銀杏GbR2R3-MYB1基因的克隆及非生物脅迫應(yīng)答分析

駱鷹 譚智 王帆 劉曉霞 羅小芳 何福林

（1.湖南科技學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院，永州 425199；2.湖南省銀杏工程技術(shù)研究中心，永州 425199；湖南省生物質(zhì)資源綜合開發(fā)利用工程技術(shù)研究中心，永州 425199）

轉(zhuǎn)錄因子（transcription factors，TF）又稱反式作用因子，能夠與位于基因啟動(dòng)子序列上的順式作用元件相互作用，通過轉(zhuǎn)錄因子之間，或與其它相關(guān)蛋白間的特異性結(jié)合從而激活或抑制某些基因的轉(zhuǎn)錄［1］。高等植物中轉(zhuǎn)錄因子一般由DNA結(jié)合功能域、寡聚化位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)及核定位信號(hào)區(qū)等組成［2］。植物中的MYB轉(zhuǎn)錄因子成員數(shù)量較多，且大多數(shù)成員的N末端都含有保守MYB結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域由1-4個(gè)不完全重復(fù)序列R組成，每個(gè)R片段含有50-53個(gè)保守的氨基酸殘基。根據(jù)MYB結(jié)構(gòu)域所含R重復(fù)序列數(shù)量可分為：R1-MYB（1R）、R2R3-MYB（2R）、R1R2R3-MYB（3R） 和 4R-MYB（4R），其中植物中以R2R3-MYB為主要群體［3-4］。研究發(fā)現(xiàn)，R2R3MYB能參與植物的生理生化，次生代謝，生長(zhǎng)發(fā)育，激素合成及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，以及響應(yīng)生物和非生物脅迫過程等［4-8］。擬南芥（Arabidopsis thaliana）中的AtMYB15可以通過調(diào)控CBF基因參與抗寒和抗凍性，mby15突變體能夠增強(qiáng)擬南芥的抗凍性，而過表達(dá)則降低其抗凍性［9］；MYB80和MYB124可以通過影響CBF基因的表達(dá)來增強(qiáng)蘋果的抗寒與抗凍性［10］。水稻（Oryza sativa）OsMYB30也是對(duì)冷敏感的MYB家族成員之一，過表達(dá)OsMYB30可以增強(qiáng)水稻對(duì)冷敏感程度，而myb30突變體植株則表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐寒性［11］。AtMYB30突變體對(duì)熱應(yīng)激、氧化應(yīng)激比較敏感，MYB30能與ANN4和ANN1啟動(dòng)子結(jié)合并下調(diào)其表達(dá)，從而通過Ca2+信號(hào)來調(diào)節(jié)熱激、氧化反應(yīng)［12］。高溫脅迫下過表達(dá)水稻OsMYB55株系總氨基酸含量較高，可以使?fàn)I養(yǎng)期水稻植株的耐熱性增強(qiáng)［13］。過表達(dá)玉米（Zea mays）中的MYB55基因，也可以增強(qiáng)玉米的耐熱性［14］。菠蘿（Ananas comosus）中 MYB 家族成員能響應(yīng)一種或多種非生物脅迫，例如Aco014614只受冷脅迫誘導(dǎo)，而Aco001113可以受高鹽、干旱和熱脅迫誘導(dǎo)，其中，Aco007733在高鹽、干旱、冷、熱脅迫、ABA、MeJA、SA、2,4-D八種條件處理下均被誘導(dǎo)表達(dá)，提示其是一種多重抗性調(diào)節(jié)因子［15］。

銀杏（Ginkgo biloba）是我國獨(dú)特的珍稀孑遺樹種，別名“公孫樹”，最早出現(xiàn)在2.7-3.5億年前，地球上的生命經(jīng)過巨大的變動(dòng)后，唯有銀杏依然保持其最初的自然生態(tài)風(fēng)貌，常被業(yè)內(nèi)人士比喻為植物界的“大熊貓”，現(xiàn)如今廣泛分布在世界各地。銀杏具有多種價(jià)值和用處，如醫(yī)藥、食品、生態(tài)、觀賞和木料等方面，尤其社會(huì)經(jīng)濟(jì)價(jià)值和生態(tài)利用價(jià)值極高［16］。銀杏在醫(yī)藥和生態(tài)學(xué)上的價(jià)值是由其葉片和果實(shí)中的活性成分所共同賦予，主要涉及黃酮類、酚類、萜內(nèi)酯以及多糖和生物堿類等化合物。黃酮類化合物也被稱作黃堿素，大部分結(jié)合糖形成苷類，對(duì)植物的各種生命活動(dòng)是不可或缺的，在各種植物的許多器官和組織中廣泛存在，其中在銀杏葉片含量較高。大多數(shù)銀杏品種的黃酮含量在1.4%-1.9%之間［17］，銀杏黃酮類化合物在植物的生長(zhǎng)發(fā)育生物過程、抗逆性等多個(gè)方面起著十分重要的作用，對(duì)于人類而言，其藥用和食用價(jià)值也很高，在醫(yī)藥衛(wèi)生行業(yè)具有十分廣闊的開發(fā)空間。近年來，高通量測(cè)序及分子生物學(xué)技術(shù)在銀杏生物學(xué)功能研究中得到廣泛運(yùn)用，人們對(duì)銀杏有了更深入了解，然而有關(guān)銀杏R2R3-MYB1轉(zhuǎn)錄因子的研究報(bào)道很少。本研究基于NCBI及生物信息相關(guān)數(shù)據(jù)庫，從銀杏葉片中克隆得到銀杏GbR2R3-MYB1轉(zhuǎn)錄因子，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)、亞細(xì)胞定位及逆境脅迫下的表達(dá)分析，為進(jìn)一步研究銀杏R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子的功能奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 本研究所用實(shí)驗(yàn)材料來源于湖南省永州市桐子坳銀杏成年植株以及收集同株銀杏的種子，地理坐標(biāo)為北緯 26°06′，東經(jīng) 111°50′。采集地上自然脫落的果實(shí)置于室溫下，待果實(shí)腐爛后，去除種皮與果實(shí)，將種子清水洗干凈后晾干，用濕沙攪拌均勻放置在通風(fēng)陰涼處，讓其自然層積。將沙藏種子洗凈，選取沉在水底飽滿良好的種子，用KMnO4溶液（1 000 mg/L）消毒時(shí)間為15 min，再用無菌蒸餾水沖洗5-6次。最后將處理的種子播種于裝有基質(zhì)的培養(yǎng)盆中，35℃人工氣候箱中黑暗培養(yǎng)催芽，待銀杏種子長(zhǎng)出白色嫩芽時(shí)進(jìn)行光照培養(yǎng)（晝夜溫度為28℃/18℃，空氣相對(duì)濕度為75%，光照周期為18 h光照/6 h黑暗）。待銀杏幼苗長(zhǎng)出4葉時(shí)，分別進(jìn)行鹽、干旱、低溫和高溫逆境脅迫處理。處理?xiàng)l件設(shè)置為：用濃度為300 mmol/L的NaCl溶液模擬鹽脅迫，20%的聚乙二醇（PEG6000）溶液模擬干旱脅迫，以4℃和42℃人工氣候箱分別模擬低溫和高溫脅迫。上述處理均以在培養(yǎng)盆常溫下正常生長(zhǎng)的銀杏幼苗為對(duì)照。4種非生物脅迫各處理的時(shí)間分別為：0 h、2 h、4 h、8 h、12 h和24 h。每處理3次生物學(xué)重復(fù)，分別將同一脅迫處理時(shí)間采集的銀杏幼苗液氮速凍后，置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 菌株和載體 本研究中使用的DH5α感受態(tài)細(xì)胞、pClone007 Blunt Vector Kit載體由北京擎科公司提供；pCAMBIA1300-GFP質(zhì)粒及GV3101農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞購自于武漢大智眾成公司。

1.1.3 主要試劑 限制性內(nèi)切酶、總RNA提取、熒光定量PCR、瓊脂糖DNA膠回收、cDNA第一鏈合成、瓊脂糖DNA回收及質(zhì)粒提取試劑盒由北京天根公司提供；無縫克隆試劑盒、引物及PCR擴(kuò)增高保真酶由北京擎科公司提供；Xba I、Kpn I高保真酶購自于武漢大智眾成公司。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取及cDNA合成 取新鮮銀杏幼苗葉0.1 g，參考北京天根公司總RNA提取試劑盒相關(guān)步驟抽提總RNA，并將樣本保存-80℃冰箱備用。取2 000 ng總RNA，根據(jù)天根公司FastKing cDNA第一鏈合成試劑盒說明，進(jìn)行cDNA第一鏈合成反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)，合成產(chǎn)物保存于-20℃冰箱待用。

1.2.2 GbR2R3-MYB1基因克隆 通過NCBI官網(wǎng)（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）查詢銀杏GbR2R3-MYB1基因（登錄號(hào)：ASR18086.1），從而獲取GbR2R3-MYB1的CDS、全基因組、cDNA及氨基酸序列。以銀杏幼苗葉片為材料，以逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，通過PCR擴(kuò)增進(jìn)行GbR2R3-MYB1基因克隆。運(yùn)用Primer Primer5.0軟件設(shè)計(jì)本研究所用特異性引物（引物具體信息見表1），GbASR基因克隆及pCAMBIA1300-GbR2R3MYB1-GFP融合表達(dá)載體構(gòu)建具體過程，參考駱鷹等［18］相關(guān)基因克隆操作方法與步驟。

表1 實(shí)驗(yàn)所用引物序列信息Table 1 Primer sequences used in this study

1.2.3 生物信息學(xué)分析 通過NCBI官網(wǎng)CDD（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/）在線工具對(duì)GbR2R3-MYB1進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析；利用Expasy ProtParam（https://web.expasy.org/ protparam/） 進(jìn) 行蛋白理化性質(zhì)預(yù)測(cè)，SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）進(jìn)行蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/）進(jìn)行蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)；通過Expasy Protscale（https://web.expasy.org/protscale/） 進(jìn)行親疏水性分析；通過NCBI中BLAST搜索其他物種的R2R3-MYB1同源蛋白序列，并利用DNAMAN軟件進(jìn)行多重序列比對(duì)分析；利用MEGA6.0軟件中鄰近法（neighbor joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.4 GbR2R3-MYB1基因亞細(xì)胞定位 按照謝旻等［19］有關(guān)亞細(xì)胞定位步驟操作進(jìn)行GbR2R3-MYB1蛋白亞細(xì)胞定位檢測(cè)試驗(yàn)。利用基因克隆方法獲得GbR2R3-MYB1目的片段，用Xba I和Kpn I高保真酶對(duì)質(zhì)粒pCAMBIA1300-GFP進(jìn)行酶切，并將目的片段GbR2R3-MYB1與pCAMBIA1300-GFP載體酶切片段進(jìn)行體外連接，從而構(gòu)建重組載體pCAMBIA1300-GbR2R3MYB1-GFP。對(duì)凍存的GV3101菌種進(jìn)行復(fù)蘇，并制備感受態(tài)細(xì)胞。采用冷卻法將重組融合表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至GV3101農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞，通過搖菌、涂板、挑選陽性單克隆等過程，然后進(jìn)行菌落PCR。將陽性單克隆菌液送北京擎科公司進(jìn)行測(cè)序，并用正確的陽性單克隆菌液提取質(zhì)粒，以便備用。

將含有重組融合表達(dá)載體pCAMBIA1300-GbR2R3MYB1-GFP的農(nóng)桿菌進(jìn)行過夜培養(yǎng)后，移入LB液體培養(yǎng)基中（含有Kan和Rif），搖床培養(yǎng)16 h，溫度控制28℃，再加入濃度為100 mmol/L的乙酰丁香酮和0.5 mol/L的嗎啉乙磺酸（MES）。常溫4 000 r/min條件下，菌液離心10 min，然后棄除上清液，用MgCl2溶液重新懸浮菌體，加入濃度為100 mmol/L的MAS進(jìn)行混勻，靜置3 h，用于后續(xù)試驗(yàn)侵染液。選取正在生長(zhǎng)期的煙草葉片，用針頭在葉片背面扎數(shù)個(gè)小孔，然后用注射器吸入侵染液，將其從葉片下表皮注射到煙草葉片內(nèi)，注射后煙草葉片會(huì)出現(xiàn)濕潤現(xiàn)象，作為處理組。以轉(zhuǎn)入空載體的煙草葉片作為對(duì)照組。注射后72 h，取樣置于激光共聚焦熒光顯微鏡檢測(cè)熒光信號(hào)。GFP激發(fā)光為488 nm，DAPI激發(fā)光為405 nm。

1.2.5 GbR2R3-MYB1基因表達(dá)分析 通過上述1.1.1植物材料和1.2.1總RNA提取及cDNA合成步驟，獲得銀杏幼苗葉片總RNA和cDNA，用于逆境脅迫下GbR2R3-MYB1基因的表達(dá)情況分析。熒光定量qPCR的總反應(yīng)體系、擴(kuò)增條件、樣品處理及相對(duì)表達(dá)量的計(jì)算方法參考駱鷹等［18］相關(guān)基因表達(dá)實(shí)驗(yàn)操作方法及步驟。

2 結(jié)果

2.1 銀杏GbR2R3-MYB1基因克隆及序列分析

以銀杏葉片cDNA為模板，利用目的基因特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將獲得GbR2R3-MYB1目的片段PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，出現(xiàn)單一DNA條帶，片段大小介于750-1 000 bp，這與本研究預(yù)測(cè)擴(kuò)增片段大小一致（圖1-A）。在紫外燈下迅速切下與目的片段大小一致的條帶，利用DNA膠回收試劑盒，并參考相關(guān)說明回收目的片段，連接至pClone007 Blunt Vector Kit載體，轉(zhuǎn)化至DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞后，涂板，挑選陽性單克隆，并用pClone007載體引物進(jìn)行菌落PCR，通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)（圖1-B），將陽性菌液送公司測(cè)序。通過DNASTAR軟件對(duì)陽性克隆測(cè)序獲得GbR2R3-MYB1核苷酸序列及其所編碼的氨基酸序列進(jìn)行分析，結(jié)果顯示本研究克隆GbR2R3-MYB1的cDNA長(zhǎng)為909 bp，起始密碼子ATG和終止密碼子TAA分別位于321 bp和1 139 bp處，發(fā)現(xiàn)銀杏GbR2R3-MYB1的CDS區(qū)全長(zhǎng)為819 bp。該基因CDS的堿基組成A為28.21%、T為20.63%、G為26.98%、C 為 24.18%，共編碼 272 aa（圖2）。（A+T）%值是48.84%，低于（G+C）%，推測(cè)GbR2R3-MYB1的CDS區(qū)的DNA雙鏈比較穩(wěn)定。

圖1 GbR2R3-MYB1基因PCR擴(kuò)增瓊脂糖凝膠電泳Fig.1 Agarose gel electrophoresis of PCR amplified products of GbR2R3-MYB1

圖2 GbR2R3-MYB1基因CDS區(qū)核苷酸序列及編碼氨基酸序列Fig.2 Nucleotide and amino acid sequence in the CDS region of GbR2R3-MYB1 gene

2.2 銀杏GbR2R3-MYB1的序列比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化分析

通過NCBI官網(wǎng)對(duì)銀杏GbR2R3-MYB1的序列進(jìn)行分析，結(jié)果表明GbR2R3-MYB1蛋白具有MYB_DNA-Bingding結(jié)構(gòu)域，位于67-111 aa區(qū)域，含有兩個(gè)典型的SANT結(jié)構(gòu)域，分別位于67-114 aa和69-112 aa區(qū)域（圖3）。利用在NCBI數(shù)據(jù)庫BLAST比對(duì)，下載GenBank收錄的12種植物MYB氨基酸序列，通過DNAMAN軟件進(jìn)行多重序列比對(duì)（圖4），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，銀杏GbR2R3-MYB1蛋白與火炬松（Pinus taeda）、白云杉（Picea glauca）MYB蛋白的氨基酸序列相似性最高，分別為67.32%和63.57%；與荷花（Nelumbo nucifera） 和 桃（Prunus persica）MYB蛋白的氨基酸序列相似性較低，分別為54.78%和55.51%。由圖5可見，GbR2R3-MYB1蛋白與火炬松（Pinus taeda）、白云杉MYB蛋白聚在一起，它們同屬于裸子植物，表明親緣關(guān)系較近。荷花（Nelumbo nucifera）和桃（Prunus persica）MYB蛋白聚在同一分支，它們同屬于雙子葉植物；玉米（Zea mays）和水稻（Oryza sativa Japonica）屬于單子葉植物，它們的MYB蛋白聚在一起，親緣關(guān)系較近。

圖3 銀杏GbR2R3-MYB1蛋白保守域Fig.3 Conservative domain of GbR2R3-MYB1 protein from G.biloba

圖4 銀杏GbR2R3-MYB1蛋白與其他植物氨基酸序列的多重比對(duì)Fig.4 Multiple alignment of the amino acid sequences of GbR2R3-MYB1 in G.biloba and other plants

圖5 植物MYB同源基因氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.5 Phylogenetic tree of deduced amino acid sequences of plant MYB homologous genes

2.3 銀杏GbR2R3-MYB1氨基酸序列的理化性質(zhì)分析

銀杏GbR2R3-MYB1蛋白理化性質(zhì)通過Protparam軟件進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GbR2R3-MYB1由272個(gè)氨基酸殘基組成，相對(duì)分子質(zhì)量為30 001.60 Da，理論等電點(diǎn)（PI）為6.59，在組成該蛋白的氨基酸中，丙氨酸（Ala）所占比例最高，為9.2%，而蛋氨酸（Met）、色氨酸（Trp）、酪氨酸（Tyr）所占比例最低，為1.8%。負(fù)電荷殘基（Asp+Glu）33個(gè)，正電荷殘基（Arg+Lys）31個(gè)。GbR2R3-MYB1的分子式為C1287H2028N392O406S16，不穩(wěn)定指數(shù)為52.10，這表明該蛋白為不穩(wěn)定酸性蛋白。GbR2R3-MYB1的脂肪族氨基酸指數(shù)（aliphatic index）為68.64，總親水性平均系數(shù)（GRAVY）為-0.628，這說明該蛋白是親水性蛋白（圖6）。

圖6 GbR2R3-MYB1蛋白親水/疏水性預(yù)測(cè)分析Fig.6 Prediction of hydrophilic/hydrophobicity for GbR2R3-MYB1 protein

2.4 銀杏GbR2R3-MYB1蛋白的二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

通過SOPMA在線軟件對(duì)GbR2R3-MYB1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果表明（圖7），GbR2R3-MYB1蛋 白 由 28.31%的α-螺 旋、4.78%的β-轉(zhuǎn)角、5.88%的延伸鏈和61.03%的無規(guī)卷曲構(gòu)成，且α-螺旋主要集中于N端的MYB結(jié)構(gòu)域和C端的功能結(jié)構(gòu)域位置，這與預(yù)期結(jié)果相一致。利用SWISSMODEL在線軟件對(duì)GbR2R3-MYB1蛋白三維空間結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖8），在R2和R3 repeat結(jié)構(gòu)域中均含有3個(gè)α-螺旋結(jié)構(gòu)單位，這與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果相一致。

圖7 GbR2R3-MYB1蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.7 Prediction of secondary structure for GbR2R3-MYB1 protein

圖8 GbR2R3-MYB1蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.8 Prediction of tertiary structure of GbR2R3-MYB1 protein

2.5 GbR2R3-MYB1蛋白亞細(xì)胞定位分析

為了明確GbR2R3-MYB1蛋白的亞細(xì)胞定位情況，將克隆獲得的GbR2R3-MYB1目的片段成功連接至pCAMBIA1300-GFP載體上，構(gòu)建融合表達(dá)載體pCAMBIA1300- GbR2R3MYB1-GFP，并將其轉(zhuǎn)入煙草幼苗葉片下表皮細(xì)胞中進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)。以DAPI染劑作為參考，撕取煙草幼苗葉片表皮細(xì)胞置于激光共聚焦熒光顯微鏡觀察下觀察GFP蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖9），對(duì)照組中整個(gè)煙草表皮細(xì)胞分布較強(qiáng)的綠色熒光信號(hào)，而處理組煙草表皮細(xì)胞僅細(xì)胞核能檢測(cè)到熒光信號(hào)，這表明GbR2R3MYB1基因所編碼的蛋白定位于細(xì)胞核。

圖9 GbR2R3-MYB1蛋白亞細(xì)胞定位結(jié)果Fig.9 Subcellular localization of GbR2R3-MYB1 protein

2.6 GbR2R3MYB1基因在非生物脅迫下的表達(dá)分析

通過RT-qPCR技術(shù)對(duì)高鹽、干旱、低溫和高溫等非生物脅迫處理下的銀杏GbR2R3-MYB1基因表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)分析，結(jié)果顯示，GbR2R3-MYB1受高鹽、干旱、低溫和高溫等非生物脅迫的誘導(dǎo)，在NaCl脅迫處理下（圖10-A），GbR2R3-MYB1基因相對(duì)表達(dá)量呈先上升后下降的趨勢(shì)，鹽脅迫4 h GbR2R3-MYB1基因的相對(duì)表達(dá)量達(dá)最達(dá)峰值，而鹽脅迫8 h，其表達(dá)量達(dá)最低值。干旱脅迫2 h，GbR2R3-MYB1的相對(duì)表達(dá)量最高，而脅迫24 h時(shí)，其表達(dá)量最低，整體上也呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)（圖10-B）。在低溫（4℃）及高溫（42℃）處理下（圖10-C、D），GbR2R3-MYB1的相對(duì)表達(dá)量均呈先下降后上升再下降的趨勢(shì)，低溫脅迫12 h時(shí)GbR2R3-MYB1相對(duì)表達(dá)量峰值最高，而高溫脅迫8 h，其表達(dá)量峰值最高。

圖10 GbR2R3-MYB1基因在鹽、干旱、低溫及高溫脅迫下的表達(dá)分析Fig.10 Expression analysis of GbR2R3-MYB1 gene under salt，drought，cold，and heat stresses

3 討論

MYB轉(zhuǎn)錄因子家族成員的典型特征是含有比較保守的DNA結(jié)合域，本研究通過分子生物學(xué)技術(shù)克隆得到銀杏GbR2R3-MYB1基因，片段大小為819 bp，編碼272個(gè)氨基酸。根據(jù)結(jié)構(gòu)域的不同可以將MYB蛋白家族分為4類，其中R2R3-MYB蛋白是最大一類蛋白家族。本研究通過蛋白序列比對(duì)及保守結(jié)構(gòu)域分析，結(jié)果確定銀杏GbR2R3-MYB1轉(zhuǎn)錄因子含有R2、R3結(jié)構(gòu)域，能夠與啟動(dòng)子元件結(jié)合并發(fā)生作用，這為進(jìn)一步驗(yàn)證銀杏GbR2R3-MYB1對(duì)下游基因的作用奠定基礎(chǔ)。進(jìn)化樹分析表明銀杏GbR2R3-MYB1與火炬松、白云杉等植物的R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子親緣關(guān)系比較近，聚在一個(gè)分支，這可能是由于它們同屬于裸子植物。通常情況下，轉(zhuǎn)錄因子定位于細(xì)胞核［20］，可以通過調(diào)控下游基因而發(fā)生作用，如銀杏GbERF1轉(zhuǎn)錄因子定位于細(xì)胞核［21］；西瓜（Citrullus lanatus）ClWRKY54蛋白分布于細(xì)胞核［22］；本研究亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示，銀杏GbR2R3-MYB1轉(zhuǎn)錄因子定位于細(xì)胞核。然而，一些植物轉(zhuǎn)錄因子也可能定位于細(xì)胞中的其他位置，如梁山慈竹（Dendrocalamus farinosus）DfMYB3蛋白定位于細(xì)胞核和細(xì)胞膜［23］；丹參（Salvia miltiorrhiza）SmMYB52［24］、SmMYB87 轉(zhuǎn)錄因子［25］在細(xì)胞核和細(xì)胞膜上GFP都有表達(dá)。

植物通過不同的適應(yīng)調(diào)節(jié)機(jī)制來感知、響應(yīng)外界各種生物及非生物學(xué)脅迫，從而使其生命得以延續(xù)。R2R3-MYBs作為MYB轉(zhuǎn)錄因子家族數(shù)量最多成員，已被證實(shí)在植物生長(zhǎng)發(fā)育及應(yīng)答非生物學(xué)脅迫過程中扮演重要角色。當(dāng)植物處于鹽脅迫環(huán)境時(shí)，土壤中高濃度鹽對(duì)大多數(shù)植物是有害的，Na+、Ca2+鹽對(duì)植物的損害更大，尤其是Na+鹽［26］。研究發(fā)現(xiàn)，棉花（Gossypium hirsutum）GhMYB73受NaCl和ABA誘導(dǎo)，將GhMYB73基因沉默，突變體株系對(duì)鹽脅迫更加敏感，然而，過表達(dá)GhMYB73擬南芥株系苗期耐鹽性卻顯著增強(qiáng)［27］；擬南芥AtMYB2和AtMYB44基因的轉(zhuǎn)錄水平受鹽脅迫的影響，過表達(dá)AtMYB2和AtMYB44擬南芥株系抗鹽性明顯提升［28-29］；番茄（Solanum lycopersicum）SlMYB102受滲透脅迫，尤其是鹽脅迫誘導(dǎo)，過表達(dá)SlMYB102番茄株系在長(zhǎng)時(shí)間鹽脅迫下，其生長(zhǎng)抑制程度顯著降低［30］；花生（Arachis hypogaea）中 AhMYB1、AhMYB2、AhMYB6和AhMYB7基因的表達(dá)量在鹽脅迫下顯著增加［31］；小麥（Triticum aestivum）TaMYB33、TaMYB56-B和TaMYB73基 因 均 受 高鹽誘導(dǎo)，過表達(dá)這些基因，所獲得擬南芥株系對(duì)鹽的耐受性顯著增強(qiáng)［32-34］。已有研究報(bào)道，植物R2R3-MYB基因還受干旱誘導(dǎo)，如干旱脅迫后，白羊草（Bothriochloa ischaemum） 根 系 中 BiMYB35、BiMYB142、BiMYB143的表達(dá)量上調(diào)，促進(jìn)根部的發(fā)育，從而提高其抗旱性［35］；大豆（Glycine max）GmMYB118可以通過促進(jìn)干旱、鹽脅迫相關(guān)基因的表達(dá)，調(diào)節(jié)滲透及氧化物質(zhì)（如脯氨酸、葉綠素、活性氧和丙二醛）含量來維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)，從而增強(qiáng)大豆對(duì)干旱、鹽脅迫耐受性［36］。本研究表明GbR2R3-MYB1基因受高鹽和干旱誘導(dǎo)，其相對(duì)表達(dá)量在整體上呈先上升后下降的趨勢(shì)，且GbR2R3-MYB1基因的表達(dá)量分別在高鹽處理4 h和PEG處理2 h后達(dá)到最大峰值，這與上述報(bào)道植物R2R3MYB轉(zhuǎn)錄因子能應(yīng)答鹽、干旱脅迫結(jié)果相符合。

溫度是影響植物分布、生長(zhǎng)和產(chǎn)量的關(guān)鍵環(huán)境因子，近年來，研究人員對(duì)植物MYB轉(zhuǎn)錄因子應(yīng)答溫度脅迫進(jìn)行大量的試驗(yàn)研究，發(fā)現(xiàn)蘋果（Malus×domestica）中MdMYB88、MdMYB124基因分別通過靶向調(diào)控MdCSP3和MdCCA1基因的表達(dá)，促進(jìn)花青素積累和降低H2O2毒性以應(yīng)對(duì)寒冷脅迫［37］；過表達(dá)MdMYB23轉(zhuǎn)基因蘋果愈傷組織和擬南芥株系表現(xiàn)出更強(qiáng)的耐寒性［38］。低溫脅迫50 d后，GmMYB76和GmMYB177轉(zhuǎn)基因大豆株系的存活率顯著高于野生型，且轉(zhuǎn)基因大豆株系中的脯氨酸含量顯著增加［39］。高溫脅迫下，過表達(dá)R2R3-MYB相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子TT2和MYB5擬南芥植株表現(xiàn)出更強(qiáng)的耐熱性，相反，tt2、myb5、tt2/myb5突變體植株則對(duì)熱激反應(yīng)更為敏感［40］。小麥幼苗中TaMYB79、TaMYB80、TaMYB81和 TaMYB82基 因的mRNA在40℃熱處理1 h后迅速積累［41］。藍(lán)莓（Vaccinium corymbosum）中VcMYB4a是應(yīng)答非生物學(xué)脅迫的重要抑制因子，在鹽、干旱、冷脅迫下，VcMYB4a基因的表達(dá)下調(diào)，但是受極度嚴(yán)寒與熱誘導(dǎo)；過表達(dá)VcMYB4a愈傷組織會(huì)增強(qiáng)對(duì)鹽、干旱、冷、極度嚴(yán)寒和高溫脅迫敏感性［42］。本次研究發(fā)現(xiàn)，GbR2R3-MYB1基因的相對(duì)表達(dá)量在低溫、高溫脅迫下出現(xiàn)先下調(diào)再上升再下調(diào)的趨勢(shì)，表明GbR2R3-MYB1基因參與應(yīng)答低溫和高溫脅迫。然而，銀杏GbR2R3-MYB1基因參與響應(yīng)非生物脅迫的分子機(jī)制及其信號(hào)通路，以及是否影響銀杏生長(zhǎng)發(fā)育等還需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

克隆獲得1個(gè)R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子基因GbR2R3-MYB1，其編碼區(qū)長(zhǎng)度為819 bp，編碼272個(gè)氨基酸，其相對(duì)分子量大小為30 001.60 Da，編碼蛋白為不穩(wěn)定親水蛋白，定位于細(xì)胞核；GbR2R3-MYB1蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)含有28.31% α-螺旋，4.78%β-轉(zhuǎn)角，61.03%無規(guī)卷曲，5.88%延伸鏈；與火炬松、白云杉中的R2R3-MYB蛋白親緣關(guān)系較近；GbR2R3-MYB1基因?qū)}、干旱、低溫及高溫脅迫均有響應(yīng)。