杧果鉀通道基因MiSPIK的克隆、表達與功能分析

韓蕾 李俊林 高愛平 黃建峰 李建召 宋志忠，，4

（1.魯東大學農(nóng)林工程研究院 山東省高校作物高產(chǎn)抗逆分子模塊育種重點實驗室，煙臺 264025；2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院作物品種資源研究所，?？?571100；3.南京林業(yè)大學林學院，南京 210037；4.劍橋大學植物系，劍橋，英國 CB2 3EA）

鉀（K+）在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中占有重要地位，土壤缺鉀制約作物產(chǎn)量和品質(zhì)，如何提高作物鉀素營養(yǎng)高效利用是亟待解決和攻關(guān)的關(guān)鍵科學問題。果樹栽培中，控釋鉀肥能有效促進花的開放，改善果實品質(zhì)和產(chǎn)量，增強采后貯藏性能［1-4］，相關(guān)研究集中在生理生化層面，而果樹鉀素營養(yǎng)高效與利用的分子機制尚不清楚。植物中，Shaker類K+通道介導K+吸收、地上部長距離運輸、分配和動態(tài)平衡，在植物生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要功能［2，5-10］。然而，該家族通道功能研究集中在一年生模式作物，果樹中Shaker類K+通道的生物學功能依然未知。因此，研究果樹Shaker類K+通道的生物學功能，聚焦果樹研究前沿，具有重要的科學意義。

Shaker類型K+通道于1992年首次在擬南芥中報道，隨后陸續(xù)在不同植物中鑒定了30多個Shaker類型K+通道［11-12］。模式作物擬南芥中Shaker類型K+通道研究最為透徹，目前至少鑒定了9個Shaker類型K+通道，包括內(nèi)向整流型（AtKAT1、AtKAT2、AtAKT1、AtAKT5和AtSPIK）、外向整流型（AtSKOR和AtGORK）、弱整流型AtAKT2和調(diào)節(jié)組件類型AtKC1［11-17］。其中AtSPIK主要在擬南芥花粉中表達，電生理功能研究證實其為內(nèi)向整流型K+通道，在花粉萌發(fā)和花粉管形成中發(fā)揮作用，并通過SnRK1復合物調(diào)控進而參與柱頭上花粉的干燥過程［14，17］。AtSKOR主要在擬南芥根中表達，介導韌皮部K+分泌至木質(zhì)部并經(jīng)由“根-莖”的長距離運輸，該基因缺失突變后導致植株地上部K+含量降低約50%，電生理功能研究表明AtSKOR是一個電壓依賴型的外向整流型K+通道［16］。AtGORK在擬南芥保衛(wèi)細胞中特異表達，該基因缺失突變后導致氣孔關(guān)閉受抑制，電生理研究表明AtGORK是電壓依賴型的外向整流型K+通道，其通道活性受蛋白激酶CPK33調(diào)節(jié)［13，15］。近年來，國內(nèi)外學者在水稻［18］、荒漠植物霸王［19］、甜瓜［20］、山新楊［21］、紫皮柳［22］、沙冬青［23］等植物中陸續(xù)鑒定了Shaker類型K+通道蛋白。然而，果樹中有關(guān)Shaker類型K+通道的功能研究較少，近期研究表明梨PbrKAT1是一個內(nèi)向整流型K+通道［7］，葡萄ViSKOR是一個主要在根中表達的外向整流型K+通道［24］。

杧果（Mangifera indica）是典型的熱帶果樹之一，其生長發(fā)育對K+的需求量較大，特別是花分化過程中對K+的依賴性最大［25-26］。然而杧果鉀素營養(yǎng)高效與利用的分子基礎(chǔ)尚未見報道，Shaker類型K+通道的生物學功能依然未知。

本研究以‘桂熱82’杧果為材料，克隆并鑒定了一個Shaker類型K+通道基因MiSPIK，分析其表達模式并初步明確其生物學功能，為研究杧果Shaker類型K+通道的生物學功能和熱帶作物鉀素營養(yǎng)與高效利用機制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

五年生‘桂熱82’杧果和一年生嫁接幼苗材料均由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院作物品種資源研究所提供，野生型擬南芥（Arabidopsis thaliana）Col-0、農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）GV3101菌株和植物表達載體pHB為魯東大學農(nóng)林作物遺傳改良中心實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1 試驗處理 利用一年生‘桂熱82’嫁接幼苗，按照李俊林等［23］和Song等［27］方法，以1/2 MS液體培養(yǎng)基為對照，進行缺鉀、50 mmol/L高鉀脅迫、4℃低溫脅迫、200 mmol/L NaCl和10% PEG處理。

1.2.2 植物總RNA提取和cDNA反轉(zhuǎn)錄 利用RNAiso Plus Kit（TaKaRa，中國大連）試劑盒提取杧果不同組織材料的總RNA，微量紫外分光光度計檢測RNA質(zhì)量和濃度；根據(jù)Primescript 1stStrand cDNA Synthesis Kit（TaKaRa，中國大連）試劑盒，使用2 μg總RNA作為模板，使用oligo（dT）18作為錨定引物合成第一鏈cDNA。

1.2.3 利用RACE-PCR技術(shù)擴增MiSPIK 借鑒Song等［27］方 法 進 行 RACE-PCR（rapid amplification of cDNA ends-PCR）克隆目的基因MiSPIK。根據(jù)已報道植物Shaker類型鉀通道保守區(qū)域，設(shè)計簡并引物GP1-F和GP1-R（表1），以杧果花朵總RNA反轉(zhuǎn)錄的第一鏈cDNA為模板，擴增目的基因的保守區(qū)域序列。測序驗證正確后，分別設(shè)計用于3′-RACE和5′-RACE的特異性引物GP2-out/in和GP3-out/in（表1）， 利 用 SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit（TaKaRa，中國大連）開展 3′-RACE 和 5′-RACE 的巢氏PCR，然后拼接獲得目的基因MiSPIK的完整編碼區(qū)CDS序列；然后設(shè)計上下游引物，利用高保真酶High-Fidelity PCR（TaKaRa，中國大連）進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物連到pMD19-T（TaKaRa，大連，中國）載體上，送往生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序驗證。

表1 本文所用引物序列Table 1 Primers used in study

1.2.4 生物信息學特征分析 通過TMpredict在線工具（http://ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html）預測MiSPIK蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域。利用ProtParam在線服務器（http://expasy.org/tools/protparam.html）分析MiSPIK蛋白的化學公式、理論等電點（pI）、穩(wěn)定性（instability index，不穩(wěn)定指數(shù)＞ 40為不穩(wěn)定蛋白），脂肪系數(shù)（aliphatic index，＜100為親水蛋白質(zhì)）、總平均親水性GRAVY（grand average of hydropathicity，＜0為親水蛋白質(zhì)）等理化性質(zhì)。運用SignalP5.0在線服務器（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-5.0/）預測MiSPIK蛋白的信號肽情況。利用Phyre2在線軟件（http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index）分析MiSPIK蛋白的三級結(jié)構(gòu)。根據(jù)王力敏等［21］和Chen等［22］方法，利用ClustalX 2.0軟件對杧果、擬南芥、水稻、玉米、高粱、棉花、短柄草、大豆、番茄、黃瓜、桃、梨、葡萄、草莓、蘋果、番木瓜、克萊門柚、甜橙、香蕉、鳳梨、白楊、紅皮柳、巨桉和木薯24種已報道植物Shaker類型K+通道同源蛋白進行氨基酸序列比對［7，21-22，24］，利用 MEGA 13.0 中的最大相似法（maximum-likelihood）構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，分析遺傳進化關(guān)系。

1.2.5 表達模式分析 分別采集五年生‘桂熱82’杧果一年生新葉（4月1日）、新生韌皮部（4月1日）、新生根（4月1日）、盛開期花朵（4月1日，分為花瓣、花粉、花柱和花托）、幼果（5月1日）和成熟果實（8月1日）等材料，液氮冷凍后用于組織特異性表達特征分析。分別采集缺鉀、50 mmol/L高鉀脅迫、4℃低溫、200 mmol/L NaCl和10% PEG處理0、6、24和48 h時的葉片和根部材料，用于轉(zhuǎn)錄水平脅迫響應差異分析。

利用NCBI/Primer-BLAST在線服務器設(shè)計MiSPIK特異性表達引物（表1），以杧果MiActin為內(nèi)參基因，利用SYBR Green熒光染料（TaKaRa，大連），通過ABI 7500實時熒光定量PCR儀分析該基因的表達模式，反應程序為95℃ 30 s；95℃5 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，35 個 循 環(huán) ；72℃ 10 s。在ABI 7500 PCR儀獲得相應的Ct值，經(jīng)內(nèi)參基因Actin 均一化處理，采用 2-ΔCt法計算相對表達量［21-24］。試驗共設(shè)置3次生物學重復，每次重復每個處理選用6棵幼苗。

1.2.6 超表達載體構(gòu)建 設(shè)計特異性引物（表1），上下游分別引入Sac I和Xba I限制性酶切位點，PCR擴增帶有酶切位點的MiSPIK CDS片段，利用T4 DNA Ligase（TaKaRa，大連，中國）將MiSPIK構(gòu)建到植物表達載體pHB，獲得重組質(zhì)粒pHBMiSPIK，并進行雙酶切驗證。

1.2.7 異源超表達的擬南芥轉(zhuǎn)基因株系創(chuàng)制 利用農(nóng)桿菌介導的花序侵染法，將重組質(zhì)粒pHB-MiSPIK轉(zhuǎn)化野生型擬南芥Col-0，將收獲的T0代種子在含有10 mg/L潮霉素的1/2 MS固體培養(yǎng)基平板上，篩選能夠長出綠色真葉、根系較長的陽性抗性苗并移栽到基質(zhì)中，通過RT-PCR驗證擴增獲得一條2.4 kb的MiSPIK條帶。收獲T1代轉(zhuǎn)基因株系種子，在1/2 MS固體培養(yǎng)基平板播種10 d后觀察生長情況。

根據(jù)Song等［27］方法，利用電子天平稱量擬南芥生物鮮重，借助Epson Rhizo scanner（Seiko Epson，日本）掃描擬南芥的根系，并利用Epson WinRHIZO（Seiko Epson，日本）軟件分析總根長。利用HNO3-HClO4法消解植物組織材料，運用電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜儀（ICP-AES）測定K+含量。

1.2.8 數(shù) 據(jù) 分 析 采 用SPSS 13.0軟 件（SPSS Chicago，美國）對全文數(shù)據(jù)進行顯著性分析，在對照和脅迫處理條件下2個獨立樣品間進行t檢驗（檢驗水平 *P＜0.05，**P＜0.01）。

2 結(jié)果

2.1 MiSPIK的克隆

從杧果盛花期花朵里擴增得到一條485 bp的保守區(qū)片段（圖1-A），測序獲得堿基序列，其翻譯蛋白經(jīng)BLAST比對，顯示是與擬南芥AtSPIK同源性最高的基因片段。根據(jù)已獲得的保守區(qū)序列（485 bp），開展 3′-RACE 和 5′-RACE，分別擴增獲得 3′端1 836 bp和5′端1 217 bp的產(chǎn)物（圖1-B），拼接獲得一條2 415 bp的全長CDS序列（圖1-C），將其命名為杧果MiSPIK。利用PCR擴增該基因的CDS序列并經(jīng)測序驗證，功能域分析表明MiSPIK蛋白含有cAMP結(jié)合域（PF00027）、離子跨膜域（PF00520）和KHA（PF11834）等功能域，均屬于Shaker類型K+通道的典型功能域（圖2），提交NCBI獲得登錄號GenBank ID為OM179914。

圖1 MiSPIK RACE克隆過程Fig.1 RACE cloning process of MiSPIK

圖2 功能域分析Fig.2 Functional domain analysis

理化性質(zhì)分析表明MiSPIK分子量為90 006.83 kD，pI為7.59，屬于含堿性氨基酸較多的蛋白?？缒び蝾A測結(jié)果表明，MiSPIK含有6個典型的跨膜結(jié)構(gòu)域，不穩(wěn)定指數(shù)為49.12，GRAVY值為-0.221，脂肪系數(shù)為88.91，表明MiSPIK屬于親水的不穩(wěn)定膜蛋白。

2.2 系統(tǒng)發(fā)育樹分析

系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建結(jié)果表明，24種已報道植物Shaker類型K+通道同源蛋白可以分為兩大亞族，其中，SKOR和GORK兩種外向整流型通道屬于GroupI，其余類型的通道均屬于Group II（圖3）。相較于Shaker類型其他通道蛋白，MiSPIK與梨PbrSPIK和擬南芥AtSPIK在進化關(guān)系上的遺傳距離最近（圖3），三者的氨基酸序列一致性最高，達到了59.46%（圖4），且擁有相似但仍有略微差異的三級結(jié)構(gòu)（圖5），相較于擬南芥AtSPIK，杧果MiSPIK與梨PbrSPIK的三級結(jié)構(gòu)更為相似。此外，同屬于禾本科（玉米、水稻、高粱和短柄草）、薔薇科（梨、蘋果和草莓）、楊柳科（楊樹和紫皮柳）或蕓香科（甜橙和克萊門柚）的SKOR同源蛋白傾向于緊密聚在一起。而禾本科（玉米、水稻和高粱）KAT同源蛋白傾向于緊密聚在一起（圖5）。

圖3 24種植物Shaker類型通道同源蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹建立Fig.3 Phylogenetic tree construction of Shaker type channel homologs from 24 plant species

圖4 3種植物SPIK同源蛋白氨基酸序列一致性分析Fig.4 Identity analysis of amino acid sequence of SPIK homologs from 3 plant species

圖5 3種植物SPIK同源蛋白三級結(jié)構(gòu)預測Fig.5 Tertiary structure prediction of SPIK homologs from 3 plant species

2.3 表達模式分析

RT-qPCR結(jié)果（圖6）表明，MiSPIK在花粉中特異表達，其轉(zhuǎn)錄水平的表達量最高，其次是盛花期整花中，而在一年生新葉、韌皮、根、盛開期花朵、花瓣、花柱、花托、幼果和成熟果實中的表達量相對較低，暗示該通道蛋白可能在杧果花粉發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。

圖6 組織特異性表達分析Fig.6 Tissue specific expression analysis

此外，MiSPIK在轉(zhuǎn)錄水平對不同非生物脅迫的響應情況存在差異。其中，缺鉀和NaCl脅迫在不同處理時間均顯著降低MiSPIK在幼苗根部的表達水平，高鉀脅迫在短期處理時間內(nèi)（4 h時）顯著增強MiSPIK在幼苗根部的表達量，且在處理24 h時增強倍數(shù)最高，在處理48 h時的增加倍數(shù)則有所降低，而低溫和PEG脅迫則隨著處理時間的延長而持續(xù)增強MiSPIK在幼苗根部的表達水平（圖7）。

圖7 MiSPIK對非生物脅迫差異響應的熱圖分析Fig.7 Heat map analysis of differential responses of MiSPIK to different abiotic stresses

2.4 超表達轉(zhuǎn)基因擬南芥創(chuàng)制

根據(jù)圖8-A所示，構(gòu)建重組表達載體pHBMiSPIK，利用農(nóng)桿菌介導侵染法獲得T0代陽性轉(zhuǎn)基因株系，RT-PCR驗證顯示轉(zhuǎn)基因株系地上部和地下部均擴增獲得一條2.4 kb大小的MiSPIK的條帶（圖8-B），表明MiSPIK在轉(zhuǎn)基因擬南芥整株組織中均可穩(wěn)定表達。

圖8 異源超表達轉(zhuǎn)基因創(chuàng)制Fig.8 Generation of heterologous over-expression transgenic seedlings

T1代種子在1/2 MS固體培養(yǎng)基平板上播種10 d后觀察生長情況。發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化MiSPIK的擬南芥地上部的生物量顯著高于野生型Col-0（表2），且提前抽薹和開花（圖9），然而，根系的生物鮮重和總根長均無顯著差異。T1轉(zhuǎn)基因擬南芥在整株（地上部和根部）的K+含量顯著高于野生型對照（表2）。

圖9 T1代轉(zhuǎn)基因株系表型分析Fig.9 Phenotype analysis of T1 transgenic lines

表2 T1代轉(zhuǎn)基因株系生理指標分析Table 2 Physiological indicator analysis of T1 transgenic lines

3 討論

K+是植物細胞中含量最為豐富的金屬元素，與植物的生長發(fā)育密切相關(guān)，土壤缺鉀將影響作物生長和發(fā)育，降低果實品質(zhì)和產(chǎn)量［1-6］。目前，果樹中有關(guān)Shaker類型K+通道功能的報道極少，在梨［7］和葡萄［24，28］中有單個通道基因的功能研究。然而，SPIK通道的功能研究僅在模式作物擬南芥中有報道，果樹SPIK基因的生物學功能依然未知。

本研究通過同源克隆和RACE擴增技術(shù)，從杧果中克隆了一個在花粉中特異表達的Shaker類型K+通道基因MiSPIK，其編碼蛋白和梨PbrSPIK的三級結(jié)構(gòu)較為相似，且具有較高的氨基酸序列一致性，兩者在在進化關(guān)系上遺傳距離最為相近，暗示二者可能具有類似的生物學功能。因此，解析杧果MiSPIK通道的功能，為研究梨和其他近屬植物SPIK同源基因的生物學功能提供了理論依據(jù)。

在生物學功能層面，SPIK通道屬于典型的Shaker類內(nèi)向整流型K+通道，在擬南芥中介導花粉中K+的內(nèi)流，與花粉萌發(fā)、花粉管形成和花粉表面干燥密切相關(guān)，這一生命過程受鈣調(diào)磷酸激酶CPK11 和 CPK24 的調(diào)控［14-15，17］。本研究借助轉(zhuǎn)基因擬南芥創(chuàng)制，初步證實異源超表達MiSPIK增強轉(zhuǎn)基因擬南芥整株K+的含量，促進轉(zhuǎn)基因株系提早抽薹和開花，但對根系發(fā)育無顯著影響，這些結(jié)果表明MiSPIK通道蛋白可能通過調(diào)節(jié)K+狀況參與花朵發(fā)育過程。盡管MiSPIK通道運輸?shù)孜颣+的電生理功能及其調(diào)控機制還尚未清晰，但是轉(zhuǎn)基因株系中K+富集狀況的增強可能在一定程度上解釋了提早抽薹和開花的現(xiàn)象，即花朵中K+的富集可有效促進植物開花，這與宋志忠等［29］結(jié)果相吻合。

盡管在根中的相對表達量很低，但是MiSPIK的表達水平對不同非生物脅迫極為敏感且響應情況存在差異，缺鉀和NaCl脅迫顯著降低其表達量，而高鉀、低溫和PEG脅迫則顯著增強其表達量，這一發(fā)現(xiàn)與SPIK在其他物種中的報道結(jié)果相一致。這些結(jié)果暗示MiSPIK通道傾向于在較為適宜的K+供應環(huán)境中發(fā)揮作用（低鉀抑制，高鉀誘導），其生物學活性且在轉(zhuǎn)錄水平易受外界K+供應水平和低溫、PEG、NaCl等非生物脅迫的調(diào)控。這些發(fā)現(xiàn)與前人對于SKOR、GORK和KAT1等其他Shaker類型通道的研究結(jié)果相一致［7，18-24］，再次印證植物Shaker類型通道在K+動態(tài)平衡、質(zhì)子調(diào)控和滲透調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用。

綜上可知，花藥特異表達的K+通道基因MiSPIK可能通過維持K+動態(tài)平衡進而調(diào)控杧果花粉發(fā)育過程，借助本研究工作可為研究果樹SPIK同源蛋白的生物學功能提供理論支撐和技術(shù)借鑒。

4 結(jié)論

從杧果中分離并鑒定了一個Shaker類型的K+通道蛋白MiSPIK，與梨PbrSPIK和擬南芥AtSPIK具有高度同源性。MiSPIK在杧果花藥中特異表達，受缺鉀或NaCl處理的抑制均顯著降低，受高鉀、PEG和低溫脅迫誘導而顯著增強。超表達MiSPIK促進轉(zhuǎn)基因植株提早抽薹和開花。