基于高分辨率熔解曲線技術(shù)的CRISPR/Cas9介導(dǎo)的細胞基因突變快速檢測研究

陳黎 盧茜 楊紅蘭 張鵬，2 何志旭，2，3

（1.貴州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室 組織工程與干細胞實驗中心，貴陽550004；2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院成體干細胞轉(zhuǎn)化研究重點實驗室，貴陽 550004；3.遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院兒科，遵義 563000）

基于CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的位點特異性突變在生命科學(xué)領(lǐng)域越來越普遍［1］，該技術(shù)已應(yīng)用于基因治療、基因功能研究、動物模型制作及農(nóng)作物品種改良等領(lǐng)域［2］。由于載體構(gòu)建簡單、靶向位點選擇靈活等優(yōu)點，CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)被廣泛用于各類細胞的基因編輯［3］。該技術(shù)利用人工設(shè)計的向?qū)NA（single-guide RNA，sgRNA）介導(dǎo)外源表達的Cas9蛋白與基因組的靶位點特異性地結(jié)合，進而實現(xiàn)對基因組DNA特異性地切割。靶位點被切割后，一般會通過DNA損傷修復(fù)機制進行修復(fù)，在此過程中多會引入堿基的插入或缺失，從而導(dǎo)致基因突變。目前，檢測細胞基因突變的金標準為DNA測序法，但進行測序的周期較長，不利于CRISPR/Cas9基因編輯產(chǎn)物的快速及高通量篩選。因此，建立一種高效快速地檢測CRISPR/Cas9介導(dǎo)的細胞基因突變的方法具有廣闊的應(yīng)用前景。

高分辨率熔解曲線（high-resolution melting，HRM）分析技術(shù)是近年來發(fā)展起來的用于突變掃描和基因分型的新技術(shù)。其原理為：熔解曲線與DNA的序列長度、GC含量及雙鏈互補性相關(guān)［4］，堿基序列發(fā)生替換、缺失、插入等改變均可引起DNA熔解曲線的變化，通過高靈敏度熒光定量PCR儀檢測的熔解曲線變化，把野生型、純合突變型及雜合突變型予以鑒別［5］。不同與其他突變掃描方法，高分辨率熔解曲線技術(shù)進行突變分析為閉管操作，降低了污染風(fēng)險，減少了分析時間，不需要在PCR后進行樣品處理或分離［6］。該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于疾病診斷、耐藥菌株基因分型、單核苷酸多態(tài)性分型、甲基化檢測等方面的研究［7-11］。

本研究建立的高分辨率熔解曲線法能夠鑒別野生型、純合突變及雜合突變小鼠胚胎干細胞，同時應(yīng)用建立的高分辨率熔解曲線分析方法能對CRISPR/Cas9介導(dǎo)的小鼠胚胎干細胞基因突變進行快速檢測，是一種靈敏、準確、簡便、高通量的方法。該高分辨率熔解曲線方法將為細胞基因突變快速篩選及細胞基因功能研究奠定堅實的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

配制的細胞裂解液成分為：①Tris 50 mmol/L，②CaCl210 mmol/L，③蛋白酶K 250 ng/mL，④SDS 1.7 μmol/L， ⑤ 雙 蒸 水 ；KnockOut DMEM、KSR、NEAA、Glutamine及β-巰基乙醇均購買于Thermo Scientific公司；雙抗購買于Biological Industries公司；LIF購買于Merck公司；PD0325901及CHIR99021購買于MedChemExpress公司；Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑購買于invitrogen公司；小鼠胚胎干細胞制備參考文獻［12］；甲基結(jié)合蛋白1基因的Cas9/sgRNA表達載體構(gòu)建參考文獻［13］；TB Green Premix Ex Taq II為日本TaKaRa公司產(chǎn)品；CFX96熒光定量PCR儀為美國BIO-RAD公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 小鼠胚胎干細胞培養(yǎng)及質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 小鼠胚胎干細胞培養(yǎng)在經(jīng)0.2%明膠包被過的細胞培養(yǎng)皿內(nèi)，細胞培養(yǎng)液為KnockOut DMEM含15% KSR，1%NEAA，1% 雙 抗，1% Glutamine，0.1 mmol/L β-巰基 乙 醇，1 000 units/mL LIF，1 μmol/L PD0325901，3 μmol/L CHIR99021。將甲基結(jié)合蛋白1基因的Cas9/sgRNA表達載體使用Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑按照說明書轉(zhuǎn)入小鼠胚胎干細胞內(nèi)，轉(zhuǎn)染2 d后將培養(yǎng)液換為含有終濃度為1 mg/L的嘌呤霉素培養(yǎng)液，嘌呤霉素篩選2 d后消化細胞，然后重懸細胞，在不含嘌呤霉素的培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)6 d。

1.2.2 基因突變細胞的鑒定 使用10 μL槍頭在體視顯微鏡下挑取小鼠胚胎干細胞單克隆，將胚胎干細胞單克隆消化后，分別將30%（板1）及70%（板2）的細胞培養(yǎng)在兩個不同的96孔板中。96 h后，板2中的小鼠胚胎干細胞融合度達70%-80%時，棄掉培養(yǎng)基，用PBS清洗細胞一遍，然后加入50 μL的細胞裂解液。用封板膜將96孔板封板后，按以下條件處理：-20℃，30 min；55℃，150 min；85℃，10 min。最終以細胞裂解液為DNA模板，進行HRM分析及DNA測序鑒定。

1.2.3 引物設(shè)計與合成 根據(jù)甲基結(jié)合蛋白1基因敲除位點設(shè)計上下游引物，敲除位點位于甲基結(jié)合蛋白1基因的第2號外顯子轉(zhuǎn)錄起始位點附近。

HRM1 上游引物為 ：5′-CGGGAGACGTTGGAAACTCA-3′，HRM1 下游引物為 ：5′-GAGCACACCCGTTACCTCTG-3′，擴增產(chǎn)物長度為394 bp。

HRM2 上游引物為 ：5′-CTTGCAGGCTTCTGTTCTGT-3′，HRM2 下游引物為 ：5′-ACTCTCGGCGTTTCCAGCCA-3′，擴增產(chǎn)物長度為91 bp。

DNA測序引物同HRM1引物。

1.2.4 反應(yīng)體系及條件的優(yōu)化 熒光定量PCR反應(yīng)體系如下：0.8 μL細胞裂解液、0.8 μL上游引物（HRM1、HRM2）、0.8 μL下 游 引 物（HRM1、HRM2）、TB Green Premix Ex Taq II：10 μL、無酶無菌水補足至總體積20 μL。

采用HRM1引物時，反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)變性3 min；39個擴增循環(huán)（95℃變性30 s，63℃退火30 s，72℃延伸30 s）；95℃ 3 min；95℃ 30 s；40℃1 min；熔解溫度60-94.5℃，0.3℃/步，增加0.3℃/10 s。

采用HRM2引物時，反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)變性3 min；39個擴增循環(huán)（95℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸30 s）；95℃ 3 min；95℃ 30 s；40℃1 min；熔解溫度60-94.5℃，0.3℃/步，增加0.3℃/10 s。

1.2.5 HRM分析結(jié)果驗證甲基結(jié)合蛋白1基因突變 對30個測序結(jié)果已知的CRISPR/Cas9技術(shù)編輯過的小鼠胚胎干細胞單克隆進行HRM檢測，根據(jù)熔解溫度與熔解曲線的差異區(qū)分野生型、純合突變型和雜合突變型，以驗證建立的HRM方法的可行性和準確性。

2 結(jié)果

2.1 HRM檢測方法的建立與優(yōu)化

根據(jù)甲基結(jié)合蛋白1基因敲除位點設(shè)計進行HRM分析的上下游引物，分別以野生型、純合突變及雜合突變小鼠胚胎干細胞的細胞裂解液為DNA模板進行PCR，PCR結(jié)束后直接進行HRM分析。結(jié)果表明，野生型PCR擴增產(chǎn)物為394 bp時，野生型、純合突變型及雜合突變型的模板所產(chǎn)生的熔解曲線差異較小，另外熔解溫度與溫度變化梯度（導(dǎo)數(shù)）結(jié)果顯示，394 bp擴增產(chǎn)物出現(xiàn)兩個峰值（圖1）。為了提高HRM檢測的靈敏度，縮短了進行HRM分析的擴增產(chǎn)物長度。當野生型PCR擴增產(chǎn)物為91 bp時，野生型、純合突變型及雜合突變型的熔解曲線具有明顯差異，并且導(dǎo)數(shù)圖峰值只有一個（圖2）。表明優(yōu)化后的HRM檢測方法能準確地鑒別野生型、純合突變及雜合突變小鼠胚胎干細胞。測序結(jié)果見圖3。

圖1 野生型PCR擴增產(chǎn)物為394 bp時，野生型、純合突變型及雜合突變型高分辨率熔解曲線分析圖Fig.1 Analysis of high-resolution melting of wild-type mESCs，homozygous mutation mESCs and heterozygous mutation mESCs when the PCR product of wild-type mESCs is 394 bp

圖2 野生型PCR擴增產(chǎn)物為91 bp時，野生型、純合突變型及雜合突變型高分辨率熔解曲線分析圖Fig.2 Analysis of high-resolution melting of wild-type mESCs，homozygous mutation mESCs and heterozygous mutation mESCs when the PCR product of wild-type mESCs is 91 bp

圖3 野生型、雜合突變型和純合突變型的測序結(jié)果Fig.3 Sequencing results of wild-type mESCs，heterozygous mutation mESCs and homozygous mutation mESCs

2.2 HRM分析結(jié)果驗證甲基結(jié)合蛋白1基因突變

用本研究建立的HRM方法對30個測序結(jié)果已知的CRISPR/Cas9技術(shù)編輯過的小鼠胚胎干細胞單克隆進行檢測和分析。測序結(jié)果表明，14個小鼠胚胎干細胞單克隆為野生型，未發(fā)生基因突變。16個突變的小鼠胚胎干細胞單克隆中，14個單克隆為雜合突變型，2個單克隆為純合突變型。代表性測序結(jié)果見圖4。HRM結(jié)果顯示，14個雜合突變型、2個純合突變型與14個野生型小鼠胚胎干細胞單克隆的熔解溫度有明顯區(qū)別（圖5）。此外，通過高分辨率熔解曲線圖可以明顯區(qū)分出野生型、雜合突變型和純合突變型（圖6）。表明該HRM分析法準確地鑒別出甲基結(jié)合蛋白1基因突變的小鼠胚胎干細胞單克隆，并且與測序結(jié)果一致，靈敏度與特異性均為100%。

圖4 代表性野生型、雜合突變型和純合突變型的測序結(jié)果Fig.4 Sequencing results of typical wild-type mESCs，heterozygous mutation mESCs and homozygous mutation mESCs

圖5 30例CRISPR/Cas9技術(shù)編輯過的小鼠胚胎干細胞單克隆熔解溫度結(jié)果Fig.5 Results of melting temperature of 30 monoclones of mESCs edited by CRISPR/Cas9 techniqe

圖6 30例CRISPR/Cas9技術(shù)編輯過的小鼠胚胎干細胞單克隆高分辨率熔解曲線圖Fig.6 High-resolution melting curve of 30 monoclones of mESCs edited by CRISPR/Cas9 technique

3 討論

CRISPR/Cas9系統(tǒng)是一類廣泛存在于細菌和古生物菌體內(nèi)的免疫防御系統(tǒng)，可以用來抵御外源核酸的入侵［14-15］，CRISPR/Cas9技術(shù)基于這一系統(tǒng)改造而來。近年來，CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)成為科研領(lǐng)域一項很熱門的技術(shù)，具有設(shè)計簡單、操作方便，成本低、效率高且可同時進行多位點編輯等優(yōu)勢［16］，該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于多種模式生物及細胞的基因編輯［17-19］。因此，對CRISPR/Cas9介導(dǎo)的細胞基因突變進行快速檢測具有廣闊的應(yīng)用前景及重要的實踐意義。本研究優(yōu)化并建立了篩選細胞基因突變的方法，為CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因突變檢測提供了一種操作簡便、分析周期短的新選擇。

目前，常采用酶錯配切割方法和DNA測序法對CRISPR/Cas9技術(shù)切割產(chǎn)物進行驗證。酶錯配切割方法是一種低成本、經(jīng)濟的檢測基因突變的方法［20］，但該方法靈敏度較低，且產(chǎn)物進行電泳后需肉眼觀察，可能會引入人為的誤差，導(dǎo)致檢測結(jié)果產(chǎn)生偏差［21］。DNA測序法是檢測細胞基因突變的金標準，但樣本進行DNA測序前實驗操作流程繁瑣，需進行PCR擴增目的DNA條帶、瓊脂糖凝膠電泳及PCR純化等步驟。樣本送檢后，檢測周期較長，需幾天才能得到測序結(jié)果。因此，采用DNA測序法檢測細胞基因突變，需較長的時間完成突變篩選，不能對CRISPR/Cas9基因編輯產(chǎn)物進行快速檢測。且DNA測序的成本較高，不利于大規(guī)模的基因突變篩選。有研究報道，在DNA測序前應(yīng)用高分辨率熔解曲線進行突變掃描是一種有效、靈敏、經(jīng)濟的檢測基因突變和減少測序工作的方法［22］。本研究建立的高分辨率熔解曲線法可以快速高效地檢測CRISPR/Cas9介導(dǎo)的細胞基因突變，實驗操作流程簡單，無需提取基因組DNA，無需進行瓊脂糖凝膠電泳，無需序列特異性探針。只需設(shè)計特異性引物，以細胞裂解液為DNA模板，熒光定量PCR完成后，直接進行熔解曲線分析即可。與酶錯配切割方法和DNA測序法相比，該高分辨率熔解曲線法具有簡便、經(jīng)濟、準確、檢測周期短等優(yōu)點，詳見表1。

表1 3種檢測CRISPR/Cas9基因編輯產(chǎn)物方法比較Table 1 Comparison of three methods of detecting gene products edited by CRISPR/Cas9 technique

本研究采用的高分辨率熔解曲線技術(shù)是通過實時監(jiān)測升溫過程中雙鏈DNA熒光染料與擴增產(chǎn)物之間的結(jié)合情況而完成，堿基序列發(fā)生替換、缺失、插入等均可引起DNA熔解曲線的變化，進而能有效區(qū)分出野生型、純合突變型及雜合突變型。擴增產(chǎn)物長度是影響高分辨率熔解曲線關(guān)鍵問題之一，有研究表明，進行HRM分析的擴增產(chǎn)物較短時，能夠提高HRM檢測的靈敏度［23］。本研究中，野生型PCR擴增產(chǎn)物為394 bp時，野生型、純合突變型及雜合突變型的模板所產(chǎn)生的熔解曲線差異較小。而縮短了進行熔解曲線分析的擴增產(chǎn)物長度，野生型PCR擴增產(chǎn)物變?yōu)?1 bp時，野生型、純合突變型及雜合突變型的熔解曲線具有明顯差異，熔解曲線辨識度非常好，能清晰辨別基因型。表明優(yōu)化后的HRM分析方法具有較高的檢測靈敏度，能夠準確地鑒別野生型、純合突變型及雜合突變型。應(yīng)用本研究建立的HRM方法對30個CRISPR/Cas9技術(shù)編輯過的小鼠胚胎干細胞單克隆進行分析，檢測出14個雜合突變型、2個純合突變型及14個野生型，靈敏度和特異性均為100%，純合突變型及雜合突變型可以根據(jù)熔解溫度與熔解曲線的差異有效地與野生型進行區(qū)分。提示該HRM法能對CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因突變進行快速篩選，是一種高效、準確的分子診斷方法。

本研究建立了細胞基因突變的高分辨率熔解曲線檢測方法，該方法簡便、快速、可靠、重復(fù)性好，可用于大規(guī)模的CRISPR/Cas9介導(dǎo)的細胞基因突變分析，為細胞基因突變快速篩選及細胞基因功能研究奠定堅實的基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究針對CRISPR/Cas9介導(dǎo)的細胞基因突變?nèi)狈`敏、快速的檢測方法問題，建立了一種簡便、準確、經(jīng)濟、高通量的高分辨率熔解曲線分析方法。經(jīng)過條件的優(yōu)化，該高分辨率熔解曲線法能明顯區(qū)分出野生型、純合突變型及雜合突變型，同時應(yīng)用建立的高分辨率熔解曲線分析方法能對CRISPR/Cas9介導(dǎo)的細胞基因突變進行高效快速地檢測。