無患子RT-qPCR內參基因的篩選與驗證

徐圓圓 趙國春 郝穎穎 翁學煌 陳仲，5 賈黎明

（1.北京林業(yè)大學林學院省部共建森林培育與保護教育部重點實驗室，北京 100083；2.北京林業(yè)大學國家能源非糧生物質原料研發(fā)中心，北京 100083；3.北京林業(yè)大學無患子產(chǎn)業(yè)國家創(chuàng)新聯(lián)盟，北京 100083；4.福建源華林業(yè)生物科技有限公司，三明 354500；5.北京林業(yè)大學林木分子設計育種高精尖創(chuàng)新中心，北京 100083）

實時熒光定量PCR（RT-qPCR）是一種研究植物生長發(fā)育和代謝物生物合成過程中關鍵基因功能的重要技術，由于其準確性高、特異性強、操作簡便的特點，常被應用于基因的表達分析［1-2］。樣品的RNA完整性、cDNA質量、引物特異性及擴增效率等因素都會影響RT-qPCR實驗結果［1，3］，引入1個或多個表達穩(wěn)定的內參基因對目的基因進行校正和標準化可以提高RT-qPCR結果的準確性［4］。常用的內參基因大多是維持細胞正常生命代謝的管家基因，如與細胞結構相關的肌動蛋白基因（actin）、微管蛋白基因（tublin），與蛋白質降解相關的泛素基因（ubiquitin），與糖代謝相關的甘油醛-3-磷酸-脫氫酶基因（GAPDH）以及編碼核糖體RNA的基因18S rRNA、28S rRNA等［5-6］。理想的內參基因應該是在所有生理狀態(tài)下的樣品、組織類型中均能較穩(wěn)定表達的基因［7］。然而，研究表明植物中并不存在絕對穩(wěn)定表達的基因，不同物種、組織、發(fā)育階段或試驗條件下，內參基因的表達穩(wěn)定性存在差異，例如，千里光（Senecio scandens）的內參基因ACT1在不同組織和不同脅迫處理下表達穩(wěn)定［8］，而老鴉瓣（Amana edulis）的ACT在不同器官和不同發(fā)育時期的花芽中的表達穩(wěn)定性卻較差［9］；紅花（Carthamus tinctorius）的UBCE2是最適合用于種子發(fā)育階段基因表達研究的內參基因，而在脫落酸處理下，研究不同紅花品種對脫落酸信號響應的最佳內參基因是UBCE2和EF1β組合［10］。因此，根據(jù)物種、試驗條件和試驗目的選擇合適的內參基因是獲得準確、可靠的 RT-qPCR 實驗結果的關鍵［7，11］。

無患子Sapindus mukorossi Gaertn.為無患子科（Sapindaceae）無患子屬（Sapindus Linn.）植物，是我國傳統(tǒng)的洗護用植物和藥用植物，集日用化工、生物醫(yī)藥、生物質能源、綠化美化和生態(tài)修復于一體，具有較高的綜合利用價值［12］。我們前期研究表明無患子根、莖、葉、花和果皮中均含有三萜皂苷［13］，三萜皂苷起泡性能和去污能力強，可以用于制作手工皂、洗發(fā)水等洗護用品［14］。此外，無患子三萜皂苷及其皂苷元還具有抑菌、抗腫瘤、降血糖、降血脂、保肝和殺蟲等多種生物活性，可用于醫(yī)藥、食品保健和農(nóng)業(yè)等領域［15］。目前，對無患子的研究主要集中在種質資源收集和評價［14，16］、開花結實習性［17］，原料林高效培育［18］及化學成分的提取、分離、鑒定與應用［19-20］等方面，極少涉及分子生物學和功能基因組學方面的研究，無患子內參基因篩選方面的研究也未見報道。課題組已完成了無患子根、莖、葉、芽、花和不同發(fā)育時期果皮的轉錄組測序工作，并從中挖掘了一系列無患子三萜皂苷生物合成候選基因。本研究從轉錄組測序數(shù)據(jù)中初步篩選了8個常見的候選內參基因，通過RT-qPCR技術，結合GeNorm、NormFinder、BestKeeper三個分析軟件和RefFinder在線分析工具，對它們在無患子不同器官和不同發(fā)育時期果皮中的表達穩(wěn)定性進行評估，以期篩選適用于無患子三萜皂苷生物合成相關基因表達研究的內參基因，同時對無患子三萜皂苷生物合成過程中的6個編碼關鍵酶的基因（乙酰輔酶A?；D移酶基因，SmAACT；1-脫氧-木酮糖-5-磷酸合酶基因，SmDXS；法呢基焦磷酸合成酶基因，SmFPS；β-香樹素合成酶基因，SmbAS1；細胞色素P450酶基因，SmCYP716A-5；糖基轉移酶基因，SmUGT73C-14）和2個編碼轉錄因子的基因（SmbHLH8和SmERF25）的表達模式進行分析，可為后續(xù)深入開展無患子三萜皂苷生物合成機理研究奠定基礎，也可為無患子及近緣植物的其他生物學過程中的基因表達研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料采自福建省三明市建寧縣無患子原料林（116°52′E，26°49′N）。于 2018 年 3-11 月進行試驗材料的采集。在果園中選取3株樹體相近、生長健康、結果量穩(wěn)定的優(yōu)樹進行果實樣品采集，以單株為小區(qū)，3次重復。于3月4日采集芽（bud，B），4月 25日采集根（root，R）、莖（stem，ST）、葉（leaf，L），5月25日采集雄花（male flower，MF）和雌花（female flower，MF）；6月10日-11月10日采集完整果實發(fā)育周期的果皮樣品，涵蓋果實發(fā)育全程的8個關鍵時期［17，21］，分別為：子房發(fā)育早期（花后15 d，S1）；果實最大體積的30%（花后45 d，S2）；果實最大體積的70%（花后75 d，S3）；果實最大體積的80%（花后90 d，S4）；果實最大體積的90%（花后105 d，S5）；果實開始成熟（花后120 d，S6）；果皮發(fā)生較大變化（花后135 d，S7）；果實充分發(fā)育和成熟（花后150 d，S8）（圖1）。每個時期于晴天上午10點進行采樣，每株樹在相同位置上隨機采摘果實，果實采摘后立即取下果皮，用液氮速凍后，置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 無患子采樣材料Fig.1 Sample materials of S.mukorossi

FinePure Plant RNA提取試劑盒購自北京濟凡生物科技有限公司；Goldenstar RT6 cDNA Synthesis Kit Ver 2、2× T5 Fast qPCR Mix等購自北京擎科生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 候選內參基因的選取 基于無患子根、莖、葉、芽、花和果皮的轉錄組數(shù)據(jù)，以基因表達量FPKM（fragments per kilobase of transcript per million mapped reads）值大于10和不同器官或果皮發(fā)育時期間FPKM的差異倍數(shù)小于2為篩選標準，選取8個常用的內參基因作為候選基因進行穩(wěn)定性分析，包括18S核糖體RNA甲基轉移酶基因（18S rRNA（guanine1575-N7）-methyltransferase，Sm18S）、 肌動蛋白基因（actin-related protein 8，SmACT）、轉錄延伸因子基因（elongation factor 1-alpha，SmEF-1α）、大亞基核糖體蛋白基因（large subunit ribosomal protein L1，SmRPL1）、小亞基核糖體蛋白基因（small subunit ribosomal protein S26e，SmRPS26）、微管蛋白特異性伴侶蛋白基因（tubulin-specific chaperone C，SmTBCC）、泛素綴合酶基因（ubiquitin-conjugating enzyme E2 M，SmUBC12）、E3泛素蛋白連接酶基因（E3 ubiquitin-protein ligase BAH，SmUBP）。根據(jù)候選內參基因的核苷酸序列，使用Primer Premier 5.0軟件設計引物（表1），引物由北京擎科生物科技有限公司合成。

表1 候選內參基因的引物Table 1 Primers of candidate reference genes

1.2.2 候選內參基因的RT-qPCR分析 根據(jù)FinePure Plant RNA提取試劑盒說明書提取無患子樣品的總RNA，并采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測每個樣品的RNA質量，然后使用NanoDrop 2000分光光度計檢測RNA的濃度及純度，要求A260/A280值在1.8-2.1之間。使用反轉錄試劑盒Goldenstar RT6 cDNA Synthesis Kit Ver 2合成cDNA。使用LineGene 9600 Plus熒光定量聚合酶反應（PCR）檢測系統(tǒng)（杭州博日，中國）進行熒光定量檢測。擴增體系和反應程序如下：反應體系為20 μL，其中T5 Fast qPCR Mix（SYBR Green I）（2×）10 μL，正反向引物各0.8 μL，cDNA 模板 1 μL，ddH2O 7.4 μL。PCR 程序 ：95℃預變性 1 min；95℃變性 15 s，60℃退火 34 s，72℃延伸30 s，40個循環(huán)；反應結束后通過熔解曲線檢測產(chǎn)物特異性：從60℃緩慢升溫（0.11℃/s）至95℃，每升溫1℃連續(xù)采集5次熒光信號。每個樣本設置3次技術重復。最后基于擴增結果制作內參基因的標準曲線，并計算相關系數(shù)。

1.2.3 候選內參基因的穩(wěn)定性分析 使用Microsoft Excel 2016軟件對實時熒光定量PCR產(chǎn)生的原始Ct值進行整理，計算每個樣本的平均Ct值。使用 geNorm［22］、NormFinder［23］和 BestKeeper［24］軟件對8個候選內參基因的穩(wěn)定性進行分析。其中，geNorm和NormFinder軟件以2-△Ct進行分析，△Ct=Ct樣本-Ctmin；geNorm軟件通過計算候選內參基因的平均表達穩(wěn)定值（M）對其穩(wěn)定性進行評估，該值與內參基因的穩(wěn)定性呈負相關關系，一般認為M值小于1.5，內參基因表達穩(wěn)定［22］。另外，geNorm軟件還可以通過候選內參基因標準化因子的配對差異分析（Vn/Vn+1）得出最佳內參基因的配對組合。軟件默認的Vn/Vn+1值為0.15，當Vn/Vn+1＜0.15時，說明n個內參基因已滿足穩(wěn)定歸一化；當Vn/Vn+1＞0.15時，則需要n+1個內參基因才能滿足穩(wěn)定歸一化。NormFinder軟件則以表達穩(wěn)定值（Stability value，SV）對候選內參基因的表達穩(wěn)定性進行評價，該值越小，說明基因表達越穩(wěn)定［23］。Bestkeeper軟件以樣本的原始Ct值進行分析，通過Ct值的標準偏差（SD）、變異系數(shù)（CV）和相關系數(shù)（r）來評價候選內參基因的表達穩(wěn)定性，SD和CV越小，r越大，候選內參基因的穩(wěn)定性越好［24］。然后，根據(jù)Delta Ct方法計算各內參基因表達量的平均標準偏差（STDEV）?；趃eNorm、Normfinder、BestKeeper和Delta Ct四種分析結果，通過RefFinder在線分析工具（https://www.heartcure.com.au/reffinder/）計算其幾何平均數(shù)以獲得候選內參基因穩(wěn)定性的綜合指數(shù)排名［25］，綜合指數(shù)越小，說明基因的表達穩(wěn)定性越高。

1.2.4 內參基因的驗證 以篩選出來的內參基因作為內參，使用RT-qPCR對無患子三萜皂苷生物合成相關的6個編碼關鍵酶的基因（SmAACT、SmDXS、SmFPS、SmbAS1、SmCYP716A-5 和 SmUGT73C-14）和2個編碼轉錄因子的基因（SmbHLH8和Sm-ERF25）的相對表達量進行測定，以驗證篩選出來的內參基因的可靠性。采用Ct（2-ΔΔCt）法計算相對表達量，再計算各樣本相對于果皮S1時期的表達量。各目的基因的引物見表2。使用Microsoft Excel 2016軟件對數(shù)據(jù)進行處理，使用Origin 2017 SR2繪制圖表。

表2 目的基因的引物Table 2 Primers of objective genes

2 結果

2.1 RT-qPCR分析結果

RT-qPCR結果顯示8個候選內參基因的擴增效率在93.727%-100.206%之間，相關系數(shù)在0.997-0.999之間（表3），符合熒光定量PCR實驗要求。如圖2所示，在無患子根、莖、葉、芽、花和果皮等器官中，8個內參基因的平均Ct值在21.37（SmEF-1α）-28.04（SmTBCC） 之 間，SmEF-1α的變幅較大。

圖2 候選內參基因的Ct值Fig.2 Ct values of candidate reference genes

表3 候選內參基因擴增效率和標準曲線參數(shù)Table 3 Amplification efficiency and standard curve parameters of candidate reference genes

2.2 候選內參基因的穩(wěn)定性分析

geNorm軟件分析結果表明，在無患子不同器官和不同發(fā)育時期果皮中，8個候選內參基因的平均表達穩(wěn)定值（M）均小于1.5（表4）。其中，SmACT和SmRPL1的M值最小，為0.373；其次為SmUBC12，M值為0.508。候選內參基因標準化因子的配對差異分析結果顯示V2/V3（0.182）大于0.15，V3/V4（0.126）小于 0.15（ 圖3）。NormFinder軟件結果顯示8個候選內參基因的穩(wěn)定性排序為SmACT＞SmUBP＞SmRPL1＞SmUBC12＞SmTBCC＞SmRPS26＞ Sm18S＞ SmEF-1α（表4）。BestKeeper軟件分析結果表明，SD值和CV值最小的基因分別為 Sm18S和 SmTBCC，SmACT、SmRPL1和 SmUBP的 r值最大（r=0.985）（表4）。采用 Delta Ct法對候選內參基因的表達穩(wěn)定性進行分析，結果表明SmACT（0.67） 的 STDEV 最 小，SmEF-1α（1.07）的STDEV最大（表4）。RefFinder綜合分析結果顯示，8個候選內參基因在無患子不同器官和不同發(fā)育時期果皮中的表達穩(wěn)定性大小順序為SmACT、SmRPL1、SmUBP、SmUBC12、Sm18S、SmTBCC、SmRPS26、SmEF-1α，其中SmACT是最理想的內參基因，其次為SmRPL1和SmUBP（表4）。

圖3 geNorm軟件分析內參基因最適數(shù)目Fig.3 Analysis of optimal number of reference genes for normalization by geNorm

表4 GeNorm，NormFinder和BestKeeper分析結果和排名Table 4 GeNorm，NormFinder and BestKeeper analysis results and rankings

2.3 內參基因穩(wěn)定性的驗證

分別以篩選出來的3個穩(wěn)定性較好的內參基因（SmACT、SmRPL1和SmUBP）和一個穩(wěn)定性較差的內參基因（SmEF-1α）作為內參，對8個皂苷合成相關基因在不同器官和不同發(fā)育時期果皮中的表達情況進行研究。結果如圖4所示，SmAACT4在果皮S6-S8時期和雄花中有較高相對表達量；SmDXS4在果皮S5-S7時期和根中高表達；SmFPS和SmCYP716A-5在果皮S1-S4時期和雌花中有較高相對表達量；SmbAS1和SmUGT73C-14的相對表達量隨著果皮生長先升高后下降，且均在S3時期達到最高；SmbHLH8和SmERF25在果皮S1時期和根、莖、葉、芽和雌花等器官中高表達。以SmACT、SmACT+SmRPL1組合和SmACT+SmRPL1+SmUBP組合進行數(shù)據(jù)標準化，目的基因的相對表達量基本上保持一致；同時，8個目的基因在不同器官和不同發(fā)育時期果皮中的表達規(guī)律與轉錄組測序結果相一致，進一步驗證了轉錄組測序結果的可靠性；以穩(wěn)定性較差的候選內參基因SmEF-1α為內參，會高估目的基因的相對表達水平。

圖4 無患子三萜皂苷生物合成途徑中相關基因的RT-qPCR結果Fig.4 RT-qPCR expression pattern of genes related to the triterpenoid saponin biosynthesis of S.mukorossi

本研究對無患子的8個候選內參基因在不同器官和不同果皮發(fā)育時期的表達量進行RT-qPCR分析，結果顯示各基因的Ct值均有所變化，結合3種軟件對其穩(wěn)定性進行評價，結果表明不同軟件得出的穩(wěn)定性排序存在一定差異，geNorm、NormFinder軟件和Delta Ct法結果均顯示SmACT的穩(wěn)定性最好；而BestKeeper軟件分析表明SD值最小的基因為Sm18S，CV值最小的基因為SmTBCC，r值最大的基因為SmACT、SmRPL1和SmUBP。可見，GeNorm和NormFinder軟件的分析結果較為接近，而與BestKeeper軟件分析結果略有不同，這與蔣婷婷等［26］、Dudziak 等［27］、曹映輝等［28］、章穎佳等［29］的研究結果相似，造成這種差異的原因可能是各軟件所使用的算法不同［30］。ACT是一類球狀微絲結構蛋白，在細胞中占總蛋白質含量的5%以上，氨基酸序列高度保守［31］。ACT在植物組織中表達量大且基本穩(wěn)定，常被用于植物三萜皂苷生物合成途徑中相關基因的表達分析研究，如刺五加（Eleutherococcus senticosus）［32］、刺楸（Kalopanax septemlobus）［33］和細風輪菜（Clinopodium gracile）［34］等。本研究結果也表明SmACT在無患子根、莖、葉、芽、花和果皮中表達最穩(wěn)定，是最適合作為三萜皂苷生物合成相關基因表達分析的內參基因。另外，根據(jù)geNorm軟件得到的V2/V3＞0.15、V3/V4＜0.15的結果，說明3

3 討論

個穩(wěn)定基因的組合能增加定量結果的可靠性，所以SmACT、SmRPL1、SmUBP是理想的內參基因組合。

本研究結果顯示以SmACT、SmACT+SmRPL1組合和SmACT+SmRPL1+SmUBP組合進行數(shù)據(jù)標準化，無患子皂苷合成途徑中的6個關鍵酶編碼基 因（SmAACT4、SmDXS4、SmFPS、SmbAS1、SmCYP716A-5和SmUGT73C-14）和2個轉錄因子編碼基因（SmbHLH8和SmERF25）的相對表達量基本上保持一致，說明了這些內參基因及內參基因組合的可靠性。Xiao等［35］在羊躑躅（Rhododendron molle）不同發(fā)育階段和不同組織下內參基因篩選的研究中也得到了類似的結論，即采用單個或兩個內參的組合對目的基因進行表達驗證時，其表達趨勢一致。所以，在無患子果皮RT-qPCR實 驗 中， 使 用SmACT、SmACT+SmRPL1組 合、SmACT+SmRPL1+SmUBP組合作為內參基因對目的基因進行校準均可得到準確和可靠的定量結果。

乙酰輔酶A?；D移酶（acetyl-CoA C-acetyltransferase，AACT）、1-脫氧D-木酮糖-5-磷酸合成酶（1-deoxy-D-xylulose-5-phosphat synthetase，DXS）、法呢基焦磷酸合酶（farnesyl pyrophosphate synthetase，F(xiàn)PS）、β-香樹素合成酶（β-amyrin synthase，β-AS）、細胞色素P450依賴性單加氧酶（Cytochrome P450-dependent monooxygenases，CYP450s）和 糖基轉移酶（uridine diphosphate（UDP）-glucosyltransferases，UGTs）是三萜皂苷生物合成途徑中的關鍵酶類，編碼這些酶的基因在無患子三萜皂苷生物合成過程中均起著重要作用［36-38］。課題組前期研究表明無患子果皮中的三萜皂苷含量最高（13.26%），其次為花（5.68%-6.21%）和葉（3.30%-5.35%）［13］；此外，在果皮發(fā)育過程中，總皂苷含量總體上呈先增加后降低、然后保持在較高水平的趨勢，在S3和S4時期有較高的總三萜皂苷含量［39］。本研究 發(fā) 現(xiàn) SmAACT4、SmDXS4、SmFPS、SmbAS1、SmCYP716A-5、SmUGT73C-14、SmbHLH8 和SmERF25等編碼基因在根、莖、葉、花等部分器官或果皮的部分發(fā)育時期中高表達，說明其在無患子三萜皂苷生物合成中可能發(fā)揮著重要作用。另外，SmFPS、SmbAS1、SmCYP716A-5、SmUGT73C-14 的相對表達量在果皮發(fā)育前期（S1-S4時期）較高，SmbHLH8和SmERF25在果皮S1時期也有較高的相對表達量，說明這些關鍵基因或轉錄因子在調控無患子皂苷合成與積累的過程中可能存在著協(xié)同作用，具體機制有待進一步研究。研究表明親緣關系相近的物種中同一類同源基因的保守性一般會更高，所以本研究篩選出的內參基因SmACT、SmRPL1和SmUBP不僅可用作無患子三萜皂苷合成相關基因表達量分析的內參基因，也可以應用于無患子及近緣植物的其他生物學過程中的基因表達研究。然而，本研究僅對無患子根、莖、葉、芽、花和不同發(fā)育時期果皮進行了研究，篩選出的內參基因在各類脅迫處理的無患子植株中的穩(wěn)定性有待進一步驗證。

4 結論

從無患子8個候選內參基因中，篩選得到SmACT、SmRPL1和SmUBP等3個表達穩(wěn)定性較好的內參基因，以這些基因為內參對三萜皂苷生物合成途徑中的8個候選基因進行校準所得的表達量基本上保持一致，且相對表達量結果與轉錄組結果基本保持一致，表明SmACT、SmACT+SmRPL組合和SmACT+SmRPL+SmUBP組合可作為無患子三萜皂苷生物合成途徑中相關基因表達研究的內參基因。