UPLC-MS/MS測(cè)定小麥莖稈木質(zhì)素單體交聯(lián)結(jié)構(gòu)的方法

孫淑芳 駱永麗 李春輝 金敏 胥倩

（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院 作物生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，泰安 271018）

木質(zhì)素作為一種十分重要的可再生資源，受到越來越多的人關(guān)注［1-4］。但由于木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜，利用率極低。木質(zhì)素是一種復(fù)雜的芳香族聚合物，由對(duì)香豆醇（p-coumaryl alcohol，H）、芥子醇（sinapyl alcoho，S）、松柏醇（coniferyl alcohol，G）3種單體通過不同的連接方式聚合而成［5-6］。木質(zhì)素單體連接鍵包括 8-O-4、8-5、8-8、5-5、5-O-4、7-O-4等連接方式［7-10］。其中，8-O-4是最常見的，該鍵比其他鍵更容易斷裂［11］。另外，單體的比例不同，連接鍵的比例和種類不同。比如，富含G單體的木質(zhì)素含有豐富的8-5、5-5、5-O-4鍵；富含S單元的木質(zhì)素交聯(lián)度較低，提取的難度較?。?2］。因此，確定小麥莖稈中木質(zhì)素單體的交聯(lián)結(jié)構(gòu)特性對(duì)木質(zhì)素的開發(fā)利用尤為重要。

木質(zhì)素的表征是木質(zhì)素開發(fā)利用的關(guān)鍵。目前，主要采用溴乙酰法、Klason法、巰基乙酸法（thioglycollic acid，TGA）、酸性洗滌法測(cè)定木質(zhì)素的含量，這些方法通過降解細(xì)胞壁和木質(zhì)素，測(cè)定可溶性降解產(chǎn)物，從而獲取細(xì)胞壁中不溶性木質(zhì)素的含量，但這些方法無法獲取關(guān)于木質(zhì)素單體的相關(guān)信息［13-16］。堿性硝基苯氧化法是通過在樣品中加入硝基苯，經(jīng)高溫條件反應(yīng)后獲取木質(zhì)素單體含量的方法，但是該方法無法提供木質(zhì)素結(jié)構(gòu)特性的相關(guān)信息［17］。紫外光譜（ultraviolet absorption spectrometry，UV）、紫外-可見-近紅外吸收光譜（UV-visible-NIR absorption spectra，UV-Vis-NIR）、紅外光譜（infrared spectroscopy，IR）是利用木質(zhì)素官能團(tuán)在不同位置的特征吸收峰對(duì)木質(zhì)素進(jìn)行定性分析，但不能提供木質(zhì)素單體序列和交聯(lián)結(jié)構(gòu)的精確信息［18-22］。

本研究通過使用不同比例的3種單體和過氧化物酶模擬木質(zhì)素單體的自然聚合過程，在體外聚合形成木質(zhì)素二聚體、三聚體等結(jié)構(gòu)。同時(shí)，將小麥莖稈中的可溶性木質(zhì)素溫和提取而不降解，利用超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（UPLC-MS/MS）分析其結(jié)構(gòu)和含量。定性和定量分析小麥莖稈內(nèi)可溶性木質(zhì)素低聚體，更精確地測(cè)定小麥莖稈木質(zhì)素單體交聯(lián)結(jié)構(gòu)組成和含量，為木質(zhì)素的開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

選用山農(nóng)16的莖稈作為試驗(yàn)材料。取拔節(jié)后14 d的小麥莖稈（用剪刀將莖稈最上部和最下部的莖節(jié)剪掉，留莖稈中部），液氮速凍后，-80℃保存。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 將3種單體（對(duì)香豆醇（H）、松柏醇（G）和芥子醇（S））混合（每種單體稱取3 mg）溶于2 mL含27 mmol/L的（CTA）2SO4磷酸鈉緩沖液（10 mmol/mL，pH 6.5）。加入 67 μL 3% H2O2和0.3 mg II型辣根過氧化物酶。30℃水浴1 h，用1 mL 5%的Na2S2O7水溶液中止反應(yīng)。用0.6 mL乙酸乙酯萃取木質(zhì)素單體和低聚物，再用飽和NaCl水溶液洗滌、渦旋振蕩2 min，4 727 r/min離心5 min，吸取上層清液，在真空濃縮儀中蒸干。最后，將干燥的樣品溶解在2 mL含有35%乙腈的水溶液中，等待上機(jī)。

1.2.2 樣品制備 樣品處理：稱取凍干的樣品粉末0.5 g，加入2 mL萃取劑（乙醇∶超純水=80∶20，V/V），振蕩混勻2 min。然后常溫條件超聲30 min。4℃4 727 r/min離心5 min，取上清。樣品殘?jiān)性俅渭尤? mL乙醇，重復(fù)上面的步驟，獲取上清液，將上清液放在真空離心濃縮儀中蒸干，然后加入2 mL乙酸乙酯溶解萃取木質(zhì)素，渦旋振蕩2 min。4 727 r/min離心5 min，取上清，將上清液再次放入真空離心濃縮儀中蒸干，然后加入2 mL乙腈水溶液（乙腈∶超純水=35∶65，V/V）溶解，過0.22 μm有機(jī)系濾器，備用。

1.2.3 超高效液相-三重四級(jí)桿質(zhì)譜條件 流動(dòng)相A：超純水，流動(dòng)相B：乙腈，梯度洗脫（0-0.5 min，95% A，0.5-3 min，95% A-75% A線性降低，3.0-3.5 min，75% A-10% A線性降低，3.0-4.0 min，10% A，4.0-4.1 min，10% A-95% A線性提高，4.1-6.0 min，95% A，表1）。色譜柱為 ACQUITY UPLC?BEH C18，1.7 μm，2.1 mm×100 mm，柱溫為 40℃。

表1 液相方法表Table 1 Liquid phase method

質(zhì)譜條件為：MS系統(tǒng)：ACQUITY XEVO TQ-D，電離模式：電噴霧離子源負(fù)離子模式（ESI-）；源溫度：150℃，脫溶劑氣溫度：450℃；脫溶劑氣流速：800 L/h，錐孔氣流速：30 L/h，碰撞氣流速：0.20 mL/min，毛細(xì)管電壓：負(fù)離子為2.5 kV；脫溶劑氣溫度：450℃；掃描模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)MRM；霧化氣：氮?dú)狻８髂举|(zhì)素單體交聯(lián)結(jié)構(gòu)的質(zhì)譜參數(shù)見表2。

表2 各木質(zhì)素單體交聯(lián)結(jié)構(gòu)的質(zhì)譜參數(shù)表Table 2 Mass spectrum parameters of crosslinking structures of lignin monomers

2 結(jié)果

2.1 定性與定量

圖1分別為UPLC分析標(biāo)準(zhǔn)品S（8-O-4）S（8-8）S、S（8-O-4）G（8-O-4）S、G（8-O-4）S（8-5）G、S（8-O-4）S（8-5）G、G（8-O-4）S（8-8）S、G（8-O-4）G（8-5）G、S（8-O-4）S、G（8-5）H、G（8-8）G的色譜圖。9種交聯(lián)結(jié)構(gòu)的保留時(shí)間分別為 4.08、4.00、4.04、4.04、4.08、4.02、4.01、4.05和4.03 min。圖2為實(shí)際樣品中9種木質(zhì)素單體交聯(lián)結(jié)構(gòu)的保留時(shí)間，分別為4.08、3.99、4.04、4.04、4.08、4.02、4.01、4.05和4.03 min?？梢源_定樣品中檢測(cè)的木質(zhì)素單體交聯(lián)結(jié)構(gòu)分別為S（8-O-4）S（8-8）S、S（8-O-4）G（8-O-4）S、G（8-O-4）S（8-5）G、S（8-O-4）S（8-5）G、G（8-O-4）S（8-8）S、G（8-O-4）G（8-5）G、S（8-O-4）S、G（8-5）H和G（8-8）G。由于無9種交聯(lián)結(jié)構(gòu)的商品化標(biāo)準(zhǔn)品，本試驗(yàn)以50 μg/L芥子醛為基準(zhǔn)，對(duì)樣品中木質(zhì)素單體交聯(lián)結(jié)構(gòu)進(jìn)行定量（表3）。

表3 拔節(jié)后14 d小麥莖稈中9種木質(zhì)素單體交聯(lián)結(jié)構(gòu)的含量Table 3 Contents of crosslinking structures of 9 lignin monomers in wheat stems at 14 d after jointing

圖1 UPLC分析標(biāo)準(zhǔn)品中不同交聯(lián)結(jié)構(gòu)的色譜圖Fig.1 Chromatogram of different crosslinking structures in UPLC analytical standards

圖2 UPLC分析樣品中不同交聯(lián)結(jié)構(gòu)的色譜圖Fig.2 Chromatogram of different crosslinking structures in UPLC analysis samples

2.2 方法學(xué)驗(yàn)證

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 由于無商品標(biāo)準(zhǔn)品，本發(fā)明制備的標(biāo)準(zhǔn)品為混合物，故以芥子醛為基準(zhǔn)，對(duì)木質(zhì)素單體交聯(lián)結(jié)構(gòu)進(jìn)行定量。配制0.05-100 ng/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，以峰面積（y）對(duì)芥子醛濃度（x，μg/L）作圖，回歸方程為：y=23.914 5x+131.997，相關(guān)系數(shù)（R2）=0.998 9。

2.2.2 樣品精密度 同一試驗(yàn)樣品重復(fù)進(jìn)樣（n=6），9種木質(zhì)素單體交聯(lián)結(jié)構(gòu)含量的平均值分別為0.03、0.04、0.55、0.05、0.29、0.03、0.05、9.79 和 0.15 ng/g。9種木質(zhì)素單體交聯(lián)結(jié)構(gòu)的RSD分別為2.10%、1.80%、0.57%、1.55%、0.87%、2.10%、1.93%、0.24%和1.28%（表4）。因此，該方法對(duì)9種木質(zhì)素單體交聯(lián)結(jié)構(gòu)的分析具有良好的精密度和重復(fù)性。

表4 拔節(jié)后14 d小麥莖稈中9種木質(zhì)素單體交聯(lián)結(jié)構(gòu)含量的精度分析Table 4 Accuracy analysis of crosslinking structure contents of 9 lignin monomers in wheat stems at 14 d after jointing

2.2.3 加樣回收率試驗(yàn) 測(cè)定樣品木質(zhì)素單體交聯(lián)結(jié)構(gòu)的含量，添加不同水平的標(biāo)準(zhǔn)品，測(cè)定樣品加標(biāo)后每種木質(zhì)素單體交聯(lián)結(jié)構(gòu)的含量，計(jì)算回收率（表5）?；厥章蕿?1.67%-100%。

3 討論

木質(zhì)素的高值、高效利用，對(duì)于人類的可持續(xù)發(fā)展具有十分重要的意義［23］。木質(zhì)素是由木質(zhì)素的3種單體（S、G、H）在酶的催化下聚合而成［24］。木質(zhì)素單體交聯(lián)結(jié)構(gòu)的表征，對(duì)于木質(zhì)素的高值化利用意義深遠(yuǎn)。有研究表明，高濃度稀釋的木質(zhì)素單體溶液與緩沖的H2O2溶液緩慢混合后在辣根過氧化物酶的催化下，即可啟動(dòng)成聚合過程［25］。本研究正是利用這一原理制備的標(biāo)品。另外，本研究所使用的小麥莖稈前期處理方法，可以有效的去除莖稈中的色素、脂肪酸等基質(zhì)干擾物質(zhì)，降低檢測(cè)時(shí)樣品基質(zhì)成分和目標(biāo)化合物在電噴霧離子源進(jìn)行離子化時(shí)相互競(jìng)爭(zhēng)等的基質(zhì)效應(yīng)。

UPLC是具有小顆粒填料（＜ 2 μm）和超高壓系統(tǒng)（＞ 105 kPa）兩大特征的超高效液相色譜，具有更加高效和快速的色譜分離性能，由于其高靈敏度和精確度應(yīng)用于越來越多的領(lǐng)域［26-27］。因此，利用UPLC-MS/MS測(cè)定小麥莖稈中木質(zhì)素單體的交聯(lián)結(jié)構(gòu)較為精確。前人研究表明，小麥莖稈中S和G單體的含量顯著高于H單體的含量［28-29］。本研究測(cè)得的小麥莖稈中木質(zhì)素單體交聯(lián)結(jié)構(gòu)主要以S和G單體間的連接鍵含量最多。證實(shí)了本研究的準(zhǔn)確性。

4 結(jié)論

利用UPLC-MS/MS開發(fā)了一種定性定量分析小麥莖稈中9種木質(zhì)素單體交聯(lián)結(jié)構(gòu)的方法。該方法專一性強(qiáng)、靈敏度高、通量高，結(jié)果客觀易于分析。