p38MAPK與ERK1/2在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及臨床意義

鄒俊勇 陸國華 周建英 周建婭

●論 著

p38MAPK與ERK1/2在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及臨床意義

鄒俊勇 陸國華 周建英 周建婭

目的 探討絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族成員p38MAPK、細(xì)胞外信息調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK1/2）在非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）中的表達(dá)及臨床意義。 方法 選取43例NSCLC的腫瘤組織及其癌旁正常組織作為對照。采用蛋白免疫印跡法檢測p38MAPK、ERK1/2的表達(dá)情況，分析其與臨床特征（包括性別、年齡、腫塊大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、分化程度、組織類型以及病理分期）的關(guān)系，及其表達(dá)程度與預(yù)后的關(guān)系。 結(jié)果 與配對的正常肺組織比較，phospho-p38MAPK、phospho-ERK1/2在NSCLC組織中活化上調(diào)（均P＜0．01），43例患者中37例phospho-p38MAPK的表達(dá)平均增長2．95倍，39例phospho-ERK1/2表達(dá)平均增長3．07倍，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0．01）。ERK1/2的表達(dá)與各臨床特征均無明顯相關(guān)（均P＞0．05），而p38MAPK的活化與腫瘤大小以及年齡相關(guān)（均P＜0．01）。ERK1/2未活化組、中度活化組與高度活化組的生存曲線依次下移，p38MAPK高度活化組生存曲線明顯降低。Cox比例風(fēng)險回歸模型分析顯示，phospho-p38MAPK的高表達(dá)是預(yù)后不良的預(yù)測因素（P＜0．05）。 結(jié)論 p38MAPK與ERK1/2的活化表達(dá)可能在NSCLC的發(fā)生/發(fā)展過程中具有重要意義，其中p38MAPK的活化程度可輔助作為非小細(xì)胞肺癌的預(yù)后評估因素。

絲裂原活化蛋白激酶 p38MAPK ERK 非小細(xì)胞肺癌 預(yù)后

肺癌是臨床上最常見的實(shí)體腫瘤，隨著吉非替尼等 一批肺癌靶向藥物進(jìn)入臨床，非小細(xì)胞肺癌尤其是腺癌患者受益，無進(jìn)展生存期明顯延長。但隨之出現(xiàn)的耐藥現(xiàn)象及有限延長的總生存期促使臨床更深入探究肺癌的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制及尋求新的分子靶點(diǎn)。絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）家族廣泛分布于真核細(xì)胞中，主要有p38MAPK、C-Jun N-末端激酶/應(yīng)激活化蛋白激酶（c-jun N-termina1 kinases/stress-activated protein kinase，JNK/SAPK）和細(xì)胞外信息調(diào)節(jié)蛋白激酶（extrace11u1ar signa1-regu1ated kinases 1and 2，ERK1/2）3個主要成員。MAPK通路是一條重要的聯(lián)接細(xì)胞外刺激與細(xì)胞內(nèi)生物學(xué)變化的信號通路，通過MAPK通路，可以影響染色體結(jié)構(gòu)以及轉(zhuǎn)錄因子的活性，從而產(chǎn)生一系列廣泛而重要的生物學(xué)效應(yīng)，包括炎癥、細(xì)胞生長、增殖、分化、細(xì)胞周期停止、凋亡等。本研究通過檢測非小細(xì)胞肺癌（non-sma11 ce11 1ung cancer，NSCLC）患者p38MAPK、ERK1/2與JNK的表達(dá)情況，分析其與NSCLC臨床及病理特征的關(guān)系，旨在探討其表達(dá)及臨床意義。

1 資料和方法

1.1 一般資料 選取2006-08-11在浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院手術(shù)的43例NSCLC患者的腫瘤組織標(biāo)本，患者男32例，女11例，年齡37～77（62.09±8.76）歲。以離腫瘤邊緣5cm以上且病理證實(shí)無癌細(xì)胞浸潤組織為正常肺組織作為對照。腫瘤組織切下后立即放入液氮中并儲存于-79℃的低溫冰箱中。采用電話及門診方式隨訪，總生存時間定義為從手術(shù)之日至任何原因引起的死亡或者至隨訪的終點(diǎn)，隨訪截止時間為2012-11-30，43例患者中有5例失訪，其余38例完成了6年隨訪。

1.2 試劑與儀器 一抗1∶500～1∶1 000稀釋，抗phospho-p38MAPK抗體（Tyr-182），抗phospho-JNK1/2抗體（Thr-183、Thr-185），抗phospho-ERK1/2抗體（Thr-160、Thr-177），β-actin抗體，均購自美國SANTA CRUZ公司。二抗（1∶1 000稀釋）：驢抗小鼠以及驢抗兔的特異性二抗，購于美國SANTA CRUZ公司。垂直電泳、轉(zhuǎn)膜設(shè)備以及Ge1 Doc EQ成像分析系統(tǒng)均購自美國BIORAD公司。

1.3 方法 采用PBS緩沖液洗凈組織，稱取組織0.2g，剪刀剪碎后放入玻璃管，加入1m1裂解液，置于冰上，用自動勻漿機(jī)將組織細(xì)胞破碎。將裂解液回收入1.5m1 Eppendorf管中。在冰上顛倒混勻，3～5min/次，共5次，然后在4℃下12 000g離心15min，離心后留上清液，即為蛋白提取液，分裝備用。用Lowry法測定蛋白濃度，根據(jù)最低標(biāo)本蛋白濃度，用PBS稀釋至相等濃度，加等量的2×樣品上樣緩沖液，在100℃沸水中煮沸5min，上樣電泳。取50μg蛋白上樣到15%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳（100V，1.5h），并轉(zhuǎn)到PVDF膜上（300V，2h）用5%的脫脂奶粉室溫下封閉2h，一抗4℃振搖孵育過夜，二抗室溫孵育2h后用ECL顯色系統(tǒng)顯影，凝膠成像分析。結(jié)果用Quantity One 1-D分析軟件進(jìn)行分析，軟件自動勾勒目標(biāo)條帶周邊，計(jì)算選定區(qū)域內(nèi)信號強(qiáng)度的總和，以此信號強(qiáng)度代表蛋白的相對表達(dá)量。以βactin作為內(nèi)參，校正上樣量的誤差。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS Statistic 19統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表示，自身對照比較采用配對t檢驗(yàn)。不同臨床特征者p38MAPK和ERK1/2的表達(dá)量的比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。采用Kap1an-Meier法繪制生存曲線，p38MAPK和ERK1/2的表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系采用Cox比例風(fēng)險回歸模型進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 phospho-p38MAPK、phospho-ERK1/2的表達(dá)情況 見圖1-2。

圖1 phospho-p38MAPK、phospho-ERK1/2、phospho-JNK1/2上樣電泳圖（T：腫瘤組織，N：自身對照的正常肺組織）

由圖1可見，與配對的正常肺組織比較，phosphop38MAPK、phospho-ERK1/2在NSCLC組織中活化上調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01），而JNK的表達(dá)并無明顯差異（P＞0.05）。由圖2可見，43例患者中37例 phospho-p38MAPK的表達(dá)增高，39例 phospho-ERK1/2表達(dá)增高，與配對肺組織比較，phosphop38MAPK平均增長2.95倍，phospho-ERK1/2平均增長3.07倍，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。

2.2 p38MAPK及ERK1/2的表達(dá)與臨床特征的關(guān)系 見表1。

圖2 Quantity One 1-D軟件分析結(jié)果

由表1可見，不同臨床特征者ERK1/2表達(dá)的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而在不同年齡、腫瘤大小者之間p38MAPK表達(dá)的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3 NSCLC患者生存曲線及p38MAPK和ERK1/2的表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系 根據(jù)表達(dá)程度將p38MAPK和ERK1/2分層為未活化組（p38MAPK或ERK1/2活化表達(dá)未升高或降低）、中度磷酸活化組（活化表達(dá)升高＜2倍）及高度磷酸活化組（活化表達(dá)升高＞2倍）。3組患者生存曲線的比較見圖3。

由圖3可見，ERK1/2未活化組、中度活化組與高度活化組的生存曲線依次下移，p38MAPK高度活化組生存曲線明顯降低。Cox比例風(fēng)險回歸模型分析顯示，phospho-p38MAPK的高表達(dá)是預(yù)后不良的預(yù)測因素（P＜0.05）。

3 討論

外界刺激作用于細(xì)胞的信號，從胞膜傳遞到胞漿及胞核，最終引起廣泛的細(xì)胞效應(yīng)的途徑是一個多種細(xì)胞因子參與、逐級磷酸活化、瀑布樣放大的過程。MAPK是許多細(xì)胞膜信號傳導(dǎo)途徑的共同通路，通過對MAPK活性的調(diào)控，可以達(dá)到調(diào)節(jié)基因表達(dá)、有絲分裂、新陳代謝、細(xì)胞凋亡與分化等功能[1]。

表1 p38MAPK及ERK1/2的表達(dá)與臨床特征的關(guān)系

圖3 p38MAPK、ERK1/2未活化組、中度活化組及高度活化組的生存曲線

本研究結(jié)果顯示，p38MAPK和ERK1/2在NSCLC中特異性激活，且p38MAPK的活化受到腫瘤大小及患者年齡的影響。p38MAPK和ERK1/2的異?；罨磉_(dá)提示這兩個因子可能在NSCLC的發(fā)生及發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。而p38MAPK的活化與腫塊的大小之間的關(guān)系也側(cè)面印證了p38MAPK因子在腫瘤生長時的促進(jìn)作用。p38MAPK的活化程度隨患者年齡增大而增加，提示在老年患者中，包括p38MAPK在內(nèi)的某些致癌因子可能相對活躍。p38MAPK和ERK1/2高度活化的NSCLC患者生存曲線均下移，并有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，phospho-p38MAPK的高度活化表達(dá)是預(yù)后不良的預(yù)測因素。這些結(jié)果可能與MAPK抑制腫瘤細(xì)胞凋亡及促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的作用密切相關(guān)。另外發(fā)現(xiàn)病理分期及低分化與預(yù)后不良可能相關(guān)，但未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能與本次研究樣本量較小相關(guān)。童向東等[2]對71例NSCLC手術(shù)標(biāo)本進(jìn)行了免疫組化分析，發(fā)現(xiàn)p38MAPK和ERK1的表達(dá)與肺癌分期有關(guān)，p38MAPK陽性表達(dá)的肺癌患者預(yù)后較差。這個研究與我們的結(jié)果有一定的一致性，提示我們p38MAPK與ERK1/2可能在總量及磷酸化活化表達(dá)兩個層面上均有提高，并推進(jìn)了腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

另外，MAPK家族的另一個重要因子JNK，在NSCLC中無明顯活化，說明不同的MAPK因子在同一腫瘤中的作用并不一致，各種因子的作用是復(fù)雜而有差異的。以往研究已經(jīng)表明相同MAPK因子在不同類型腫瘤細(xì)胞中所起的作用也并不相同。研究發(fā)現(xiàn)，桔梗皂甙D可通過激活p38MAPK和JNK來抑制人胃癌細(xì)胞[8]，而更多的研究發(fā)現(xiàn)MAPK在諸如黑色素瘤[9]、胰腺癌[10]等腫瘤中發(fā)揮促進(jìn)腫瘤發(fā)生的作用，這些結(jié)果提示MAPK的作用有細(xì)胞特異性，而這特異性可能來源于兩個原因：（1）MAPK各因子都有多個亞型，這些亞型有不同分布，不同表達(dá)程度，有不同的底物和各自特異性，所以它們可以在不同腫瘤中導(dǎo)致不同的結(jié)果。（2）MAPK有許多底物，這些底物之間作用可以不同，甚至截然相反。而不同類型和程度的刺激就可能導(dǎo)致不同底物的活化，從而產(chǎn)生不同的生物學(xué)效應(yīng)。這也提示未來進(jìn)一步深入的研究可以著眼于建立一個MAPK途徑效應(yīng)與不同刺激之間的量效聯(lián)系。當(dāng)然，MAPK活化導(dǎo)致的細(xì)胞效應(yīng)的細(xì)胞種類特異性也應(yīng)引起重視。

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Expression of phospho-MAPK in non-small cell cancer and its clinicopathological significance

ObjectiveTo examine the expression of phospho-p38MAPK,phospho-JNK,and phospho-ERK1/2 in non-small cell lung cancer(NSCLC)and its clinicopathological significance． Methods Forty-three specimens of primary non-small cell lung cancer and paired normal lung tissue were collected．The expressions of phospho-p38MAPK,phospho-ERK1/2 and phospho-JNK were detected with Western-blot analysis．The association between clinicopathological parameters and the expression of phospho-p38MAPK and phospho-ERK1/2 protein was analyzed．Results Compared with corresponding normal lung tissue,the expression of phospho-p38MAPK and phospho-ERK1/2 in NSCLC tissue were increased (P＜0．01)．In 37 cases,phospho-p38MAPK expression were increased by average 2．95 times(P＜0．01),while in 39 cases phospho-ERK1/2 expression were increased by 3．07 times(P＜0．01)．The expression of ERK1/2 was not correlated with clinicpathological parameters(P＞0．05)．The activation of p38MAPK was correlated with tumor size and ages of patients(both P＜0．01)．The expressions of ERK1/2 and p38MAPK were negatively correlated with survival．Multivariate analysis revealed that the expression of phospho-p38MAPK was an independent prognostic indicator for overall survival of patients (P=0．046)． Conclusion ERK1/2 and p38MAPK are activated in NSCLC,and the expression of phospho-p38MAPK can help to predict the prognosis of NSCLC．

MAPK p38MAPK ERK NSCLC Prognosis

2014-01-20）

（本文編輯：歐陽卿）

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81101768）；浙江省科技廳重大科技項(xiàng)目（2012C13G2010111）

310003 杭州，浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科（鄒俊勇現(xiàn)在寧波市第二醫(yī)院工作）

周建英，Email：zjyhz@zju.edu.cn