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    p38MAPK與ERK1/2在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及臨床意義

    2014-04-13 01:35:56鄒俊勇陸國華周建英周建婭
    浙江醫(yī)學(xué) 2014年10期
    關(guān)鍵詞:蛋白激酶活化肺癌

    鄒俊勇 陸國華 周建英 周建婭

    ●論 著

    p38MAPK與ERK1/2在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及臨床意義

    鄒俊勇 陸國華 周建英 周建婭

    目的 探討絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族成員p38MAPK、細(xì)胞外信息調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK1/2)在非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)中的表達(dá)及臨床意義。 方法 選取43例NSCLC的腫瘤組織及其癌旁正常組織作為對照。采用蛋白免疫印跡法檢測p38MAPK、ERK1/2的表達(dá)情況,分析其與臨床特征(包括性別、年齡、腫塊大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、分化程度、組織類型以及病理分期)的關(guān)系,及其表達(dá)程度與預(yù)后的關(guān)系。 結(jié)果 與配對的正常肺組織比較,phospho-p38MAPK、phospho-ERK1/2在NSCLC組織中活化上調(diào)(均P<0.01),43例患者中37例phospho-p38MAPK的表達(dá)平均增長2.95倍,39例phospho-ERK1/2表達(dá)平均增長3.07倍,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)。ERK1/2的表達(dá)與各臨床特征均無明顯相關(guān)(均P>0.05),而p38MAPK的活化與腫瘤大小以及年齡相關(guān)(均P<0.01)。ERK1/2未活化組、中度活化組與高度活化組的生存曲線依次下移,p38MAPK高度活化組生存曲線明顯降低。Cox比例風(fēng)險回歸模型分析顯示,phospho-p38MAPK的高表達(dá)是預(yù)后不良的預(yù)測因素(P<0.05)。 結(jié)論 p38MAPK與ERK1/2的活化表達(dá)可能在NSCLC的發(fā)生/發(fā)展過程中具有重要意義,其中p38MAPK的活化程度可輔助作為非小細(xì)胞肺癌的預(yù)后評估因素。

    絲裂原活化蛋白激酶 p38MAPK ERK 非小細(xì)胞肺癌 預(yù)后

    肺癌是臨床上最常見的實(shí)體腫瘤,隨著吉非替尼等 一批肺癌靶向藥物進(jìn)入臨床,非小細(xì)胞肺癌尤其是腺癌患者受益,無進(jìn)展生存期明顯延長。但隨之出現(xiàn)的耐藥現(xiàn)象及有限延長的總生存期促使臨床更深入探究肺癌的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制及尋求新的分子靶點(diǎn)。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)家族廣泛分布于真核細(xì)胞中,主要有p38MAPK、C-Jun N-末端激酶/應(yīng)激活化蛋白激酶(c-jun N-termina1 kinases/stress-activated protein kinase,JNK/SAPK)和細(xì)胞外信息調(diào)節(jié)蛋白激酶(extrace11u1ar signa1-regu1ated kinases 1and 2,ERK1/2)3個主要成員。MAPK通路是一條重要的聯(lián)接細(xì)胞外刺激與細(xì)胞內(nèi)生物學(xué)變化的信號通路,通過MAPK通路,可以影響染色體結(jié)構(gòu)以及轉(zhuǎn)錄因子的活性,從而產(chǎn)生一系列廣泛而重要的生物學(xué)效應(yīng),包括炎癥、細(xì)胞生長、增殖、分化、細(xì)胞周期停止、凋亡等。本研究通過檢測非小細(xì)胞肺癌(non-sma11 ce11 1ung cancer,NSCLC)患者p38MAPK、ERK1/2與JNK的表達(dá)情況,分析其與NSCLC臨床及病理特征的關(guān)系,旨在探討其表達(dá)及臨床意義。

    1 資料和方法

    1.1 一般資料 選取2006-08-11在浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院手術(shù)的43例NSCLC患者的腫瘤組織標(biāo)本,患者男32例,女11例,年齡37~77(62.09±8.76)歲。以離腫瘤邊緣5cm以上且病理證實(shí)無癌細(xì)胞浸潤組織為正常肺組織作為對照。腫瘤組織切下后立即放入液氮中并儲存于-79℃的低溫冰箱中。采用電話及門診方式隨訪,總生存時間定義為從手術(shù)之日至任何原因引起的死亡或者至隨訪的終點(diǎn),隨訪截止時間為2012-11-30,43例患者中有5例失訪,其余38例完成了6年隨訪。

    1.2 試劑與儀器 一抗1∶500~1∶1 000稀釋,抗phospho-p38MAPK抗體(Tyr-182),抗phospho-JNK1/2抗體(Thr-183、Thr-185),抗phospho-ERK1/2抗體(Thr-160、Thr-177),β-actin抗體,均購自美國SANTA CRUZ公司。二抗(1∶1 000稀釋):驢抗小鼠以及驢抗兔的特異性二抗,購于美國SANTA CRUZ公司。垂直電泳、轉(zhuǎn)膜設(shè)備以及Ge1 Doc EQ成像分析系統(tǒng)均購自美國BIORAD公司。

    1.3 方法 采用PBS緩沖液洗凈組織,稱取組織0.2g,剪刀剪碎后放入玻璃管,加入1m1裂解液,置于冰上,用自動勻漿機(jī)將組織細(xì)胞破碎。將裂解液回收入1.5m1 Eppendorf管中。在冰上顛倒混勻,3~5min/次,共5次,然后在4℃下12 000g離心15min,離心后留上清液,即為蛋白提取液,分裝備用。用Lowry法測定蛋白濃度,根據(jù)最低標(biāo)本蛋白濃度,用PBS稀釋至相等濃度,加等量的2×樣品上樣緩沖液,在100℃沸水中煮沸5min,上樣電泳。取50μg蛋白上樣到15%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳(100V,1.5h),并轉(zhuǎn)到PVDF膜上(300V,2h)用5%的脫脂奶粉室溫下封閉2h,一抗4℃振搖孵育過夜,二抗室溫孵育2h后用ECL顯色系統(tǒng)顯影,凝膠成像分析。結(jié)果用Quantity One 1-D分析軟件進(jìn)行分析,軟件自動勾勒目標(biāo)條帶周邊,計(jì)算選定區(qū)域內(nèi)信號強(qiáng)度的總和,以此信號強(qiáng)度代表蛋白的相對表達(dá)量。以βactin作為內(nèi)參,校正上樣量的誤差。

    1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS Statistic 19統(tǒng)計(jì)軟件,計(jì)量資料以表示,自身對照比較采用配對t檢驗(yàn)。不同臨床特征者p38MAPK和ERK1/2的表達(dá)量的比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。采用Kap1an-Meier法繪制生存曲線,p38MAPK和ERK1/2的表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系采用Cox比例風(fēng)險回歸模型進(jìn)行分析。

    2 結(jié)果

    2.1 phospho-p38MAPK、phospho-ERK1/2的表達(dá)情況 見圖1-2。

    圖1 phospho-p38MAPK、phospho-ERK1/2、phospho-JNK1/2上樣電泳圖(T:腫瘤組織,N:自身對照的正常肺組織)

    由圖1可見,與配對的正常肺組織比較,phosphop38MAPK、phospho-ERK1/2在NSCLC組織中活化上調(diào),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01),而JNK的表達(dá)并無明顯差異(P>0.05)。由圖2可見,43例患者中37例 phospho-p38MAPK的表達(dá)增高,39例 phospho-ERK1/2表達(dá)增高,與配對肺組織比較,phosphop38MAPK平均增長2.95倍,phospho-ERK1/2平均增長3.07倍,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)。

    2.2 p38MAPK及ERK1/2的表達(dá)與臨床特征的關(guān)系 見表1。

    圖2 Quantity One 1-D軟件分析結(jié)果

    由表1可見,不同臨床特征者ERK1/2表達(dá)的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而在不同年齡、腫瘤大小者之間p38MAPK表達(dá)的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2.3 NSCLC患者生存曲線及p38MAPK和ERK1/2的表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系 根據(jù)表達(dá)程度將p38MAPK和ERK1/2分層為未活化組(p38MAPK或ERK1/2活化表達(dá)未升高或降低)、中度磷酸活化組(活化表達(dá)升高<2倍)及高度磷酸活化組(活化表達(dá)升高>2倍)。3組患者生存曲線的比較見圖3。

    由圖3可見,ERK1/2未活化組、中度活化組與高度活化組的生存曲線依次下移,p38MAPK高度活化組生存曲線明顯降低。Cox比例風(fēng)險回歸模型分析顯示,phospho-p38MAPK的高表達(dá)是預(yù)后不良的預(yù)測因素(P<0.05)。

    3 討論

    外界刺激作用于細(xì)胞的信號,從胞膜傳遞到胞漿及胞核,最終引起廣泛的細(xì)胞效應(yīng)的途徑是一個多種細(xì)胞因子參與、逐級磷酸活化、瀑布樣放大的過程。MAPK是許多細(xì)胞膜信號傳導(dǎo)途徑的共同通路,通過對MAPK活性的調(diào)控,可以達(dá)到調(diào)節(jié)基因表達(dá)、有絲分裂、新陳代謝、細(xì)胞凋亡與分化等功能[1]。

    表1 p38MAPK及ERK1/2的表達(dá)與臨床特征的關(guān)系

    圖3 p38MAPK、ERK1/2未活化組、中度活化組及高度活化組的生存曲線

    本研究結(jié)果顯示,p38MAPK和ERK1/2在NSCLC中特異性激活,且p38MAPK的活化受到腫瘤大小及患者年齡的影響。p38MAPK和ERK1/2的異?;罨磉_(dá)提示這兩個因子可能在NSCLC的發(fā)生及發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。而p38MAPK的活化與腫塊的大小之間的關(guān)系也側(cè)面印證了p38MAPK因子在腫瘤生長時的促進(jìn)作用。p38MAPK的活化程度隨患者年齡增大而增加,提示在老年患者中,包括p38MAPK在內(nèi)的某些致癌因子可能相對活躍。p38MAPK和ERK1/2高度活化的NSCLC患者生存曲線均下移,并有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,phospho-p38MAPK的高度活化表達(dá)是預(yù)后不良的預(yù)測因素。這些結(jié)果可能與MAPK抑制腫瘤細(xì)胞凋亡及促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的作用密切相關(guān)。另外發(fā)現(xiàn)病理分期及低分化與預(yù)后不良可能相關(guān),但未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,可能與本次研究樣本量較小相關(guān)。童向東等[2]對71例NSCLC手術(shù)標(biāo)本進(jìn)行了免疫組化分析,發(fā)現(xiàn)p38MAPK和ERK1的表達(dá)與肺癌分期有關(guān),p38MAPK陽性表達(dá)的肺癌患者預(yù)后較差。這個研究與我們的結(jié)果有一定的一致性,提示我們p38MAPK與ERK1/2可能在總量及磷酸化活化表達(dá)兩個層面上均有提高,并推進(jìn)了腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

    另外,MAPK家族的另一個重要因子JNK,在NSCLC中無明顯活化,說明不同的MAPK因子在同一腫瘤中的作用并不一致,各種因子的作用是復(fù)雜而有差異的。以往研究已經(jīng)表明相同MAPK因子在不同類型腫瘤細(xì)胞中所起的作用也并不相同。研究發(fā)現(xiàn),桔梗皂甙D可通過激活p38MAPK和JNK來抑制人胃癌細(xì)胞[8],而更多的研究發(fā)現(xiàn)MAPK在諸如黑色素瘤[9]、胰腺癌[10]等腫瘤中發(fā)揮促進(jìn)腫瘤發(fā)生的作用,這些結(jié)果提示MAPK的作用有細(xì)胞特異性,而這特異性可能來源于兩個原因:(1)MAPK各因子都有多個亞型,這些亞型有不同分布,不同表達(dá)程度,有不同的底物和各自特異性,所以它們可以在不同腫瘤中導(dǎo)致不同的結(jié)果。(2)MAPK有許多底物,這些底物之間作用可以不同,甚至截然相反。而不同類型和程度的刺激就可能導(dǎo)致不同底物的活化,從而產(chǎn)生不同的生物學(xué)效應(yīng)。這也提示未來進(jìn)一步深入的研究可以著眼于建立一個MAPK途徑效應(yīng)與不同刺激之間的量效聯(lián)系。當(dāng)然,MAPK活化導(dǎo)致的細(xì)胞效應(yīng)的細(xì)胞種類特異性也應(yīng)引起重視。

    [1]Brzezianska E,Pastuszak-Lewandoska D.A minireview:the role of MAPK/ERK and PI3K/Akt pathways in thyroid follicular cell-derived neoplasm[J].Front Biosci,2011,16:422-439.

    [2]童向東,劉宏旭,趙惠儒,等.Smad4蛋白與蛋白激酶在非小細(xì)胞肺癌信號傳導(dǎo)通路中的作用[J].中華腫瘤雜志,2006,28:741-745.

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    Expression of phospho-MAPK in non-small cell cancer and its clinicopathological significance

    ObjectiveTo examine the expression of phospho-p38MAPK,phospho-JNK,and phospho-ERK1/2 in non-small cell lung cancer(NSCLC)and its clinicopathological significance. Methods Forty-three specimens of primary non-small cell lung cancer and paired normal lung tissue were collected.The expressions of phospho-p38MAPK,phospho-ERK1/2 and phospho-JNK were detected with Western-blot analysis.The association between clinicopathological parameters and the expression of phospho-p38MAPK and phospho-ERK1/2 protein was analyzed.Results Compared with corresponding normal lung tissue,the expression of phospho-p38MAPK and phospho-ERK1/2 in NSCLC tissue were increased (P<0.01).In 37 cases,phospho-p38MAPK expression were increased by average 2.95 times(P<0.01),while in 39 cases phospho-ERK1/2 expression were increased by 3.07 times(P<0.01).The expression of ERK1/2 was not correlated with clinicpathological parameters(P>0.05).The activation of p38MAPK was correlated with tumor size and ages of patients(both P<0.01).The expressions of ERK1/2 and p38MAPK were negatively correlated with survival.Multivariate analysis revealed that the expression of phospho-p38MAPK was an independent prognostic indicator for overall survival of patients (P=0.046). Conclusion ERK1/2 and p38MAPK are activated in NSCLC,and the expression of phospho-p38MAPK can help to predict the prognosis of NSCLC.

    MAPK p38MAPK ERK NSCLC Prognosis

    2014-01-20)

    (本文編輯:歐陽卿)

    國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81101768);浙江省科技廳重大科技項(xiàng)目(2012C13G2010111)

    310003 杭州,浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科(鄒俊勇現(xiàn)在寧波市第二醫(yī)院工作)

    周建英,Email:zjyhz@zju.edu.cn

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