時(shí)差成像技術(shù)用于胚胎選擇的研究進(jìn)展

陳志堅(jiān)，汪彩珠

近年來出現(xiàn)的胚胎時(shí)差成像（time-lapse imaging，TLI）技術(shù)是一種通過瞬時(shí)曝光連續(xù)拍攝記錄胚胎形態(tài)動力學(xué)參數(shù)的技術(shù)，能夠?qū)ε咛ンw外發(fā)育過程進(jìn)行全程監(jiān)控，獲取胚胎發(fā)育的動態(tài)信息，進(jìn)而為選擇高發(fā)育潛能胚胎提供更多參考信息，是一種新的無創(chuàng)胚胎質(zhì)量評估體系。現(xiàn)對目前國內(nèi)外利用TLI技術(shù)及其獲取的形態(tài)動力學(xué)參數(shù)進(jìn)行胚胎選擇的相關(guān)研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 胚胎形態(tài)動力學(xué)參數(shù)與胚胎發(fā)育潛能的關(guān)系

胚胎形態(tài)動力學(xué)參數(shù)分為形態(tài)學(xué)現(xiàn)象和定量參數(shù)。理論上，胚胎內(nèi)部的發(fā)育異常是能夠通過形態(tài)學(xué)或分裂參數(shù)異常表現(xiàn)出來的。目前，研究較多的異常形態(tài)學(xué)特征有異常分裂（如直接分裂、無序分裂和反向分裂）、卵裂球大小不均、多核以及碎片化。從機(jī)制上看，直接分裂可能與分裂時(shí)染色體在卵裂球中異常分布導(dǎo)致三級紡錘體的形成有關(guān)。2015年，Yang等[1]根據(jù)前3次細(xì)胞分裂過程中異常分裂模式的嚴(yán)重程度和發(fā)生情況，將發(fā)育至第3天的胚胎分為6級（A～F級），異常程度較低的胚胎（A、B和C級）比異常程度較高（D、E和F級）的胚胎具有更高的發(fā)育潛力。卵裂球大小不均表明在分裂過程中遺傳物質(zhì)的不均等分離或胞質(zhì)分裂失敗。2014年Liu等[2]研究表明，卵裂球融合或胞質(zhì)分裂失敗顯著影響胚胎發(fā)育，最終導(dǎo)致胚胎植入潛能差。這種異常分裂胚胎通常與染色體數(shù)量異常有關(guān)。多核現(xiàn)象通常與較低的囊胚形成率、種植率和妊娠率有關(guān)[3-4]。多核發(fā)生的可能機(jī)制包括核分裂時(shí)胞質(zhì)未發(fā)生分裂、核部分?jǐn)嗔岩约坝薪z分裂后期染色體的遷移缺陷等。

定量參數(shù)包括以受精時(shí)間（t0）為起始點(diǎn)的絕對時(shí)間以及胚胎分裂至不同細(xì)胞時(shí)期之間的相對時(shí)間。常用指標(biāo)有：原核出現(xiàn)時(shí)間（tPNa），原核消失時(shí)間（tPNf），胚胎發(fā)育至2細(xì)胞的時(shí)間（t2），發(fā)育至3細(xì)胞的時(shí)間（t3），以此類推的t4～t8；細(xì)胞開始融合的時(shí)間點(diǎn)（tSC），融合的時(shí)間（tMf/p），囊胚腔形成的時(shí)間點(diǎn)（tSB），囊胚擴(kuò)張的時(shí)間點(diǎn)（tEB），囊胚孵化的時(shí)間點(diǎn)（tHB），囊胚腔充滿整個透明帶的時(shí)間（tB）。還有一些細(xì)胞周期時(shí)長指標(biāo)，比如：2細(xì)胞分裂到3細(xì)胞的持續(xù)時(shí)間CC2=t3-t2，3細(xì)胞分裂到5細(xì)胞的持續(xù)時(shí)間CC3=t5-t3，3細(xì)胞分裂到4細(xì)胞的持續(xù)時(shí)間S2=t4-t3，5細(xì)胞分裂到8細(xì)胞的持續(xù)時(shí)間S3=t8-t5等。2010年，斯坦福大學(xué)醫(yī)學(xué)院的研究人員Wong等[5]研究發(fā)現(xiàn)，在受精第2天可通過測量3個動態(tài)參數(shù)預(yù)測囊胚的形成，其敏感度和特異度可超過93%，這3個參數(shù)分別為：①第一次細(xì)胞分裂持續(xù)時(shí)間為（14.3±6.0）min；②第一次有絲分裂結(jié)束至第二次有絲分裂起始的間隔時(shí)間為（11.1±2.2）h；③第二次有絲分裂至第三次有絲分裂的間隔時(shí)間為（1.0±1.6）h。2013年Herrero等[6]使用TLI監(jiān)測了1 806個第1個或第2個卵細(xì)胞質(zhì)內(nèi)單精子注射（intra cytoplasmic sperm injection，ICSI）周期的9 530枚胚胎，結(jié)果發(fā)現(xiàn)早期參數(shù)（t2、t3、t4）可以作為胚胎短期發(fā)育的良好預(yù)測因子，而晚期參數(shù)（t5、t8）預(yù)測囊胚階段的生存能力更佳。王世凱等[7]的研究發(fā)現(xiàn)，t2、tSC、tMf/p和tSB可能與囊胚的形成有關(guān)，可以預(yù)測胚胎的發(fā)育潛能。而鄭愛燕等[8]發(fā)現(xiàn)6細(xì)胞以上且碎片較少的胚胎，其t5、CC2、CC3、S2和S3不僅能預(yù)測囊胚的形成，還能預(yù)測囊胚的質(zhì)量?？梢钥吹剑芏嘌芯慷紙?bào)道了形態(tài)動力學(xué)參數(shù)可以用于預(yù)測胚胎發(fā)育潛能，但是各研究之間得出的指標(biāo)并不完全一致。事實(shí)上，很難分離出適合所有實(shí)驗(yàn)室的形態(tài)動力學(xué)預(yù)測指標(biāo)，促排卵方案的不同、實(shí)驗(yàn)室環(huán)境和培養(yǎng)體系的差異等也可能是造成研究結(jié)果間差異的因素。

2 胚胎形態(tài)動力學(xué)參數(shù)與染色體整倍性的關(guān)系

胚胎染色體異常是導(dǎo)致胚胎著床失敗和反復(fù)流產(chǎn)的主要原因。 胚胎植入前遺傳學(xué)篩查（preimplantation genetic screening，PGS）是確定胚胎染色體整倍性的重要工具，其應(yīng)用有效地避免了因染色體異常導(dǎo)致的妊娠失敗或新生兒缺陷，顯著提高了移植成功率和活產(chǎn)率[9]。但是，PGS技術(shù)需要通過侵入性手段即胚胎活檢來完成，同時(shí)由于需要等待活檢后的遺傳學(xué)檢測結(jié)果，胚胎必須先進(jìn)行冷凍保存再等待復(fù)蘇，而胚胎活檢、冷凍復(fù)蘇等操作都可能會對胚胎造成損傷，影響胚胎發(fā)育。因此在這些局限性因素的影響下，開發(fā)非侵入性的染色體檢測技術(shù)至關(guān)重要[10]。理論上，染色體正常與不正常的胚胎應(yīng)該存在動力學(xué)行為差異。因此，TLI技術(shù)的出現(xiàn)為尋找無創(chuàng)篩查技術(shù)帶來了希望。2014年Basile等[11]結(jié)合TLI和PGS的數(shù)據(jù)，并應(yīng)用邏輯回歸分析確定了變量t5-t2是與染色體正常與否最相關(guān)的指標(biāo)，其次是CC3。在此基礎(chǔ)上，Basile提出了一種胚胎選擇方法：將胚胎依據(jù)指標(biāo)的差異分為A、B、C、D共4類，結(jié)果顯示，各類間染色體正常百分比存在顯著差異（A類35.9%，B類26.4%，C類12.1%，D類9.8%），提示該算法可在沒有PGS的情況下用于無創(chuàng)性選擇染色體正常胚胎。該團(tuán)隊(duì)隨后進(jìn)行了另一項(xiàng)研究，比較了單體、三體和復(fù)雜非整倍體（多于一條染色體異常）胚胎的形態(tài)動力學(xué)數(shù)據(jù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)三體和單體胚胎與正常胚胎間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異，但復(fù)雜非整倍體的t3、t5、CC2、CC3、S2和t5-t2與正常胚胎間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。邏輯回歸分析結(jié)果表明t3和變量t5-t2是預(yù)測胚胎是正常還是復(fù)雜非整倍體的最佳參數(shù)[12]。最近的研究提示，發(fā)育速度快的囊胚更偏向于為整倍體胚胎[13-14]。2020年鄒曜宇等[13]對150例行植入前遺傳學(xué)檢驗(yàn)（preimplantation genetic testing，PGT）助孕患者的550枚胚胎進(jìn)行回顧性分析，發(fā)現(xiàn)非整倍體胚胎的t4較整倍體胚胎明顯延長且S2分布向右偏移，同時(shí)tHB有增加趨勢。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，除t8外，整倍體胚胎從tPNf發(fā)育到tB的整個過程中的分裂時(shí)間點(diǎn)均比非整倍體胚胎要早[14]。

3 TLI技術(shù)在國內(nèi)外的應(yīng)用現(xiàn)狀

近年來，國內(nèi)外已有許多中心應(yīng)用TLI進(jìn)行胚胎培養(yǎng)及優(yōu)選胚胎，且多個中心報(bào)道使用TLI培養(yǎng)胚胎可提高臨床妊娠率，降低妊娠早期的流產(chǎn)率[15-17]。據(jù)已發(fā)表的關(guān)于TLI的文獻(xiàn)分析，國內(nèi)已有22個中心應(yīng)用了TLI。青海省人民醫(yī)院生殖中心分析了128例TLI培養(yǎng)與1 128例傳統(tǒng)培養(yǎng)的卵裂期移植的妊娠和新生兒結(jié)局，發(fā)現(xiàn)TLI培養(yǎng)的胚胎具有更好的發(fā)育潛能，臨床妊娠率、著床率、活產(chǎn)率和抱嬰回家率顯著提高，可以改善妊娠結(jié)局[18]。山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合生殖與遺傳中心報(bào)道，采用TLI培養(yǎng)獲得了比傳統(tǒng)培養(yǎng)更高的可用胚胎率[15]，而重慶市婦幼保健院遺傳與生殖研究所報(bào)道可利用囊胚率在TLI培養(yǎng)組和傳統(tǒng)胚胎培養(yǎng)組間無明顯差異[16]。這是因?yàn)?個中心的數(shù)據(jù)納入標(biāo)準(zhǔn)不同，前者統(tǒng)計(jì)的是發(fā)育第3天的卵裂胚胎可用率。而在國外，TLI的應(yīng)用更普遍。2019年，Mascarenhas等[19]回顧性地分析了英國一中心使用TLI的1 064個體外受精周期和使用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法的818個體外受精周期，發(fā)現(xiàn)采用TLI技術(shù)組新鮮周期移植的活產(chǎn)率更高。Kalleas等[20]對英國曼徹斯特圣瑪麗醫(yī)院2013年6月—2014年6月體外受精周期進(jìn)行了研究，結(jié)果表明與使用臺式培養(yǎng)箱相比，使用TLI培養(yǎng)活產(chǎn)率更高，妊娠早期流產(chǎn)率更低。

由于TLI記錄的參數(shù)眾多，各參數(shù)的預(yù)測效果報(bào)道也不一致，因此，建立耦合多種參數(shù)的數(shù)學(xué)模型可能是比較有前景的方式。但是，目前各個中心都處在研發(fā)各自的胚胎選擇模型中，因此尚未有關(guān)于TLI選擇的共識模型得以廣泛推廣應(yīng)用。2013 年Conaghan等[21]基于美國的5家體外受精診所TLI數(shù)據(jù)發(fā)布了名為EevaTM Test的首個計(jì)算機(jī)自動化囊胚預(yù)測模型。EevaTM Test與傳統(tǒng)的D3形態(tài)學(xué)評分結(jié)合，顯著提高了預(yù)測可用囊胚的能力，并減少了胚胎學(xué)家之間的差異性。2016年P(guān)etersen等[22]提出了預(yù)測胚胎發(fā)育潛能的KIDScore 算法模型，且隨后Cunegatto等[23]證實(shí)該模型可用于評估胚胎的整倍體率，動態(tài)評分較高的胚胎整倍體率更高。2015年Basile等[24]建立的基于決策樹的分層模型可將胚胎分成10類（A+，A，B+，B，C+，C，D+，D，E和F），高評分類別中的胚胎植入率更高。最近，李國臻等[25]提出了一個胚胎優(yōu)選模型，首先排除多精受精及異常發(fā)育來源的胚胎，隨后根據(jù)形態(tài)學(xué)優(yōu)選胚胎，在無法根據(jù)形態(tài)學(xué)挑選出質(zhì)量最好的胚胎時(shí)，比較t2～t8與理想分裂時(shí)間的吻合度，如果仍不能區(qū)分出最佳胚胎，再根據(jù)CC1（8.5～14 h）、CC2（越短越好）、CC3（9～15 h）和s3（越短越好）優(yōu)選胚胎。該模型簡單且操作性強(qiáng)，在可供選擇的胚胎較多時(shí)比常規(guī)形態(tài)學(xué)胚胎選擇可能具有較大的優(yōu)勢。

4 TLI用于胚胎選擇的利弊

TLI是將傳統(tǒng)胚胎培養(yǎng)裝置和光學(xué)成像技術(shù)進(jìn)行結(jié)合，在固定的時(shí)間間隔點(diǎn)使用不同焦距對胚胎進(jìn)行數(shù)次拍攝，獲取不同層面的影像，并自動識別某些特定的胚胎發(fā)育過程，并記錄其發(fā)生時(shí)間的培養(yǎng)和成像技術(shù)[26]。通過TLI可以回溯胚胎的發(fā)育過程并進(jìn)行胚胎選擇。與傳統(tǒng)的培養(yǎng)體系相比，TLI培養(yǎng)能夠避免胚胎被多次移出培養(yǎng)箱觀察，為胚胎發(fā)育提供了更穩(wěn)定的溫度、濕度、pH值及氣體含量等培養(yǎng)條件。

但由于TLI存在高頻率的曝光攝像，因此其安全性也備受關(guān)注。目前已有大量研究表明，TLI培養(yǎng)體系沒有影響胚胎的發(fā)育，其培養(yǎng)效果甚至優(yōu)于傳統(tǒng)胚胎培養(yǎng)系統(tǒng)[16,18,27]。而關(guān)于對胚胎植入后的影響，2017年Insua等[28]首次探討了TLI培養(yǎng)系統(tǒng)對圍生期結(jié)局的影響，結(jié)果表明，移植使用TLI系統(tǒng)培養(yǎng)的胚胎，未觀察到對產(chǎn)科和圍生期結(jié)局的不良影響，提示TLI是傳統(tǒng)胚胎培養(yǎng)技術(shù)的安全替代方法。然而，Racowsky等[29]認(rèn)為該研究存在樣本量小等問題。因此，對TLI的安全性，尤其是對圍生期及新生兒的影響，尚需要大樣本的前瞻性研究去論證。另一方面，目前TLI的使用過程中仍需要胚胎學(xué)家對一些形態(tài)學(xué)指標(biāo)進(jìn)行人工校正和注釋，且TLI使用的專用培養(yǎng)皿較常規(guī)培養(yǎng)皿昂貴，因此TLI的使用增加了時(shí)間和經(jīng)濟(jì)成本。

5 結(jié)語

TLI培養(yǎng)系統(tǒng)提供了先進(jìn)的胚胎培養(yǎng)和觀察體系，能獲得大量的胚胎形態(tài)動力學(xué)參數(shù)，是一種新的無創(chuàng)胚胎培養(yǎng)與實(shí)時(shí)觀察技術(shù)，能夠幫助胚胎學(xué)家更加精確地選擇具有發(fā)育潛能的胚胎，是今后觀察、預(yù)測胚胎發(fā)育潛能和非整倍性的趨勢。但截至目前，尚沒有統(tǒng)一的關(guān)于TLI用于胚胎選擇的參數(shù)模型，因此，需要更多研究進(jìn)行參數(shù)的探討和胚胎選擇模型的建立?；谌斯ぶ悄艿淖詣踊疶LI將會是未來的發(fā)展方向，其能極大地提高胚胎學(xué)家效率的同時(shí)減少人為誤差。