促進(jìn)重樓種子萌發(fā)的研究進(jìn)展

翁琳琳 鐘愛清 范曉暉 楊琿昌

（寧德市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所 福建福安355000）

重樓（Paris polyphylla）是百合科（Liliaceae）重樓屬（Paris）多種植物的統(tǒng)稱，在我國(guó)藥用歷史悠久，被譽(yù)為蛇傷癰疽之良藥。 我國(guó)是重樓屬植物的主要分布區(qū)，境內(nèi)分布有19 種（含變種），其中可供藥用的有 18 種（含 10 個(gè)變種）。 各版《中國(guó)藥典》僅收載七葉一枝花與滇重樓作為重樓藥材基原植物，是云南白藥、季德蛇藥、宮血寧、抗病毒沖劑等100 多種中成藥的主要原料[1]。 現(xiàn)代藥理研究表明，重樓中的甾體皂甙具有較好的抗腫瘤、抗病毒、調(diào)節(jié)免疫等功效[2]。

隨著重樓藥理藥效的深入研究， 其經(jīng)濟(jì)藥用價(jià)值越來越得到人們的重視，需求量逐年增加。 重樓種子存在休眠程度高、休眠周期長(zhǎng)、萌發(fā)率低等特點(diǎn)，大量種子在漫長(zhǎng)的 “兩冬一夏” 休眠期中喪失生命力，導(dǎo)致重樓種植產(chǎn)業(yè)發(fā)展障礙重重。 筆者就重樓種子的休眠機(jī)理、種子生理生化、促進(jìn)種子萌發(fā)因素等方面進(jìn)行闡述，為加快重樓種子快速、整齊萌發(fā)提供參考，促進(jìn)重樓產(chǎn)業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展。

1 種子休眠機(jī)理研究

多項(xiàng)研究表明， 重樓種子休眠是由多個(gè)因素共同作用的結(jié)果，屬于形態(tài)學(xué)—生理學(xué)綜合性的休眠。黃瑋[3]、陳偉[4]等先后對(duì)滇重樓種子進(jìn)行吸水特性研究，表明種皮透水性良好，不存在透水性差引發(fā)的機(jī)械休眠。 陳偉[4]等通過石蠟切片對(duì)滇重樓種胚進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)，滇重樓種子在果實(shí)成熟時(shí)，胚發(fā)育不完全，無明顯的分化，仍處于球形胚階段。 王躍華[5]、陳偉[4]等先后發(fā)現(xiàn)，華重樓、滇重樓外種皮提取液對(duì)白菜種子存在萌發(fā)抑制作用。 陳偉[4]等通過滇重樓種子去、留外種皮萌發(fā)對(duì)照試驗(yàn)， 發(fā)現(xiàn)外種皮抑制胚的形態(tài)后熟，使得種子萌發(fā)延遲。 趙燕[6]等研究發(fā)現(xiàn)，滇重樓胚乳中同樣存在某些萌發(fā)抑制物質(zhì)， 且抑制強(qiáng)度明顯高于種皮。 黃瑋[3]等認(rèn)為，滇重樓種子萌發(fā)前期受形態(tài)學(xué)后熟限制， 形態(tài)學(xué)成熟后萌發(fā)受生理學(xué)后熟限制。 綜上所述，胚發(fā)育不完全、種子存在萌發(fā)抑制物質(zhì)及生理學(xué)后熟是種子休眠的主要原因。

2 種子萌發(fā)機(jī)制

2.1 胚率動(dòng)態(tài)變化

孟繁蘊(yùn)[7]、趙俊凌[8]等研究發(fā)現(xiàn)，滇重樓種胚休眠和發(fā)育過程中種胚生長(zhǎng)速率與層積時(shí)間有密切關(guān)系，胚率隨著時(shí)間推移而增大。

2.2 內(nèi)源激素變化

孟繁蘊(yùn)[7]、趙俊凌[8]等在不同層積條件下研究滇重樓種子萌發(fā)過程中內(nèi)源激素變化， 發(fā)現(xiàn)層積30～40 d ABA 的含量下降明顯， 進(jìn)入生理后熟期以后，GA 含量持續(xù)升高，高峰出現(xiàn)在150~160 d。在IAA 變化上兩者得出不同結(jié)論，孟繁蘊(yùn)[7]認(rèn)為，在后熟過程中IAA 逐漸升高，出現(xiàn)2 次高峰，趙俊凌[8]則認(rèn)為，IAA 量上下波動(dòng)不明顯，可能與試驗(yàn)層積的溫度不同有關(guān)。 蘇海蘭[9-10]等對(duì)云南重樓及七葉一枝花種子萌發(fā)不同階段內(nèi)源激素GA3、ABA 及IAA 變化規(guī)律的研究結(jié)論與孟繁蘊(yùn)等的研究較為一致， 說明ABA 是解除種子休眠、 出苗的重要因子；GA3含量與解除休眠關(guān)系不明顯， 與后期出苗關(guān)系密切；IAA 是影響種子生理休眠解除、萌動(dòng)、出苗不同階段的重要因子。除了上述幾種內(nèi)源激素，蘇海蘭[9-10]等還對(duì)JA、SA 及TZ 變化規(guī)律進(jìn)行了研究， 結(jié)果表明，TZ 對(duì)華重樓種子休眠和出苗影響規(guī)律性不是很明顯， 但對(duì)云南重樓休眠解除影響明顯；SA 與解除種子休眠、種子生長(zhǎng)發(fā)育、出苗關(guān)系密切；JA 是促進(jìn)種子體眠解除、出苗的重要因子。

2.3 酶活性變化

為探究重樓種子從休眠到解除休眠過程的酶調(diào)控機(jī)制，李昭玲[11]等通過測(cè)定變溫層積處理過程中華重樓種子 SOD、POD、CAT、MDH、G-6-PDH 5 種酶活性的變化，發(fā)現(xiàn)在種子層積40 d 后MDH 和G-6-PDH活性分別發(fā)生顯著的下降和上升， 種子呼吸代謝途徑由TCA 為主轉(zhuǎn)為以PPP 為主， 促進(jìn)種子解除休眠；SOD、CAT 活性在整個(gè)層積過程中沒有明顯波動(dòng)，以保證種子活力；POD 活性在進(jìn)入低溫層積階段后顯著上升，可能參與調(diào)控了種子休眠解除的過程。 蘇海蘭[10]等研究發(fā)現(xiàn)，七葉一枝花種子從未萌動(dòng)、上胚軸休眠到即將出苗階段，SOD 和POD 活性逐步升高;CAT 和MDH 活性逐步減弱；G-6-PDH 活性出現(xiàn)雙峰； 七葉一枝花種子處理后未萌動(dòng)種子呼吸代謝途徑以TCA 途徑和PPP 途徑為主，萌動(dòng)之后種子以其他代謝途徑為主，與李昭玲[11]等研究結(jié)果不一致，可能與試驗(yàn)取樣階段不同有關(guān)。蘇海蘭[12]等研究七葉一枝花種子萌發(fā)不同階段內(nèi)含物質(zhì)及淀粉酶活性變化規(guī)律， 發(fā)現(xiàn)α 淀粉酶活性對(duì)種子休眠解除及發(fā)芽起著決定性的作用，CAT 對(duì)種胚的生長(zhǎng)有抑制作用，POD 促進(jìn)種子萌發(fā)、 出苗，SOD 與種子活力水平關(guān)系密切，SOD、POD 是種子出苗階段的關(guān)鍵物質(zhì)。黃珍[13]等研究發(fā)現(xiàn)，500 mg/L 外源GA3處理促進(jìn)了華重樓種子淀粉和脂肪的降解、 可溶性蛋白和可溶性糖的產(chǎn)生及α、β 淀粉酶的合成，從而促進(jìn)種子萌發(fā)。

2.4 基因調(diào)控與表達(dá)

陳瑤[14]等運(yùn)用高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)分析華重樓種子萌發(fā)前后激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和合成通路中的差異表達(dá)基因， 發(fā)現(xiàn)GA3和IAA 組合處理華重樓種子后，GID1 受體蛋白的編碼基因明顯下調(diào)表達(dá)，GA信號(hào)通路下游PIF4 的編碼基因明顯上調(diào)表達(dá)，推測(cè)在外源和內(nèi)源GA3共同作用下，GA3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路增強(qiáng)，促進(jìn)華重樓種子萌發(fā)。 對(duì)IAA 合成途徑分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，YUCCA 和ALDH 的編碼基因表達(dá)上調(diào)，表明IAA合成水平升高。 推測(cè)在外源和內(nèi)源IAA 共同作用下，IAA 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路增強(qiáng)，促進(jìn)華重樓種子萌發(fā)。

3 影響種子萌發(fā)因素的研究

3.1 采收貯藏對(duì)種子萌發(fā)的影響

蘇海蘭[15]等分別比較不同采收時(shí)間、果實(shí)成熟期和種子大小對(duì)萌發(fā)率的影響，結(jié)果表明，蒴果開裂、果皮自然呈黃色處于成熟中期的果實(shí)， 去除種皮后過篩的大種子萌發(fā)率最高。李瑪[16]等采用不同層積溫度， 對(duì)滇重樓種子后熟過程中種子生活力和含水量進(jìn)行動(dòng)態(tài)測(cè)定，結(jié)果表明，滇重樓種子是一種高含水量的種子，不耐脫水，不能在低含水量下貯藏，生活力隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)表現(xiàn)為不同程度的下降，室溫層積能夠較好地保持滇重樓種子在后熟期間的生活力。 楊根林[17]等認(rèn)為，滇重樓種子的假種皮對(duì)萌發(fā)時(shí)間、萌發(fā)率、成苗率無明顯影響，王艷芳[18]等則得出不同的結(jié)論， 認(rèn)為種皮對(duì)滇重樓種子萌發(fā)及胚根生長(zhǎng)的抑制作用明顯。 黃瑋[3]等認(rèn)為，假種皮的存在可能阻止了萌發(fā)抑制物質(zhì)的溢出。 綜上所述，筆者認(rèn)為采收處于成熟中期 （各地該時(shí)期的時(shí)間不同以果實(shí)外觀為準(zhǔn)），蒴果開裂、果皮自然呈黃色的果實(shí)，去除假種皮，室溫層積能較好地保持種子的活力。

3.2 解除休眠的方法

3.2.1 激素 GA3是打破種子休眠過程的關(guān)鍵內(nèi)源信號(hào)分子[19]，在藥用植物種子萌發(fā)中的應(yīng)用取得了較好的效果[20]。 唐玲[21]等將赤霉素浸泡處理后的種子進(jìn)行20℃恒溫層積， 發(fā)現(xiàn)在一定時(shí)間內(nèi)高濃度的赤霉素500 mg/L 可以更快地促進(jìn)種子發(fā)芽， 顯著提高滇重樓種子發(fā)芽率。黃宗華[22]采用不同濃度GA3處理七葉一枝花種子后再進(jìn)行變溫層積， 發(fā)現(xiàn)150 mg/L GA3處理種子的萌發(fā)率最高，達(dá)98.51%。 汪佳維[23]等研究表明，GA 單獨(dú)處理下滇重樓種子發(fā)芽情況最好的是 300 mg/L，GA 質(zhì)量濃度為 400～600 mg/L 時(shí)，發(fā)芽率隨GA 質(zhì)量濃度升高呈下降趨勢(shì)。 冼康華[24]等以不同來源地的華重樓、滇重樓種子為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)不同濃度赤霉素處理對(duì)種子萌發(fā)率無顯著差異，而種子來源不同對(duì)種子萌發(fā)率有極顯著的影響。陳瑤[14]等研究發(fā)現(xiàn)，600 mg/L GA3+40 mg/L IAA 最有利于華重樓種子萌發(fā)和上胚軸休眠解除， 可使華重樓種子萌發(fā)率在8 個(gè)月時(shí)達(dá)到87.33%。 姜武[25]等以浙產(chǎn)華重樓為試驗(yàn)材料， 用不同赤霉素濃度浸泡處理后進(jìn)行變溫層積（2℃—25℃—4℃—25℃），表明 500 mg/L赤霉素有利于打破華重樓種子休眠， 浸種處理在第120 天萌發(fā)率達(dá)85.7%。楊根林[17]等研究表明，GA3濃度達(dá)到300 mg/L 時(shí)滇重樓種子萌發(fā)率及成苗率達(dá)到峰值，濃度達(dá)到700 mg/L 時(shí)，萌發(fā)率及成苗率最低。張家玲[26]等研究表明，500 mg/L 的GA3對(duì)滇重樓種子的萌發(fā)和胚根生長(zhǎng)具顯著的促進(jìn)作用， 低于或高于500 mg/L 的GA3促進(jìn)作用則相應(yīng)減小。 雖然不同的研究者得到的結(jié)論不一致， 但都表明一定濃度GA3對(duì)重樓種子休眠解除和萌發(fā)促進(jìn)具有重要作用。

3.2.2 溫度 袁理春[27]等研究認(rèn)為，一次高溫就可完成滇重樓種子二次發(fā)育過程， 最適溫度為18～20℃，再進(jìn)行一次低溫處理就可打破胚莖休眠， 在第2 年就可出苗。 李昭玲[11]等研究表明，經(jīng)過 60～80 d 的溫暖層積（18±1）℃華重樓種子基本完成形態(tài)后熟，轉(zhuǎn)入低溫層積（4±1）℃后促進(jìn)了種子生理后熟。 李寶[28]等采用不同的溫度條件（15℃、20℃、25℃）對(duì)滇重樓種子進(jìn)行培養(yǎng)，20℃恒溫是滇重樓種子萌發(fā)及根系生長(zhǎng)最適宜的溫度條件。

3.2.3 其他 石燕碧[29]等采用組培技術(shù)中看護(hù)培養(yǎng)的方法， 在三七愈傷組織上進(jìn)行滇重樓種子暗培養(yǎng)能明顯縮短其萌發(fā)時(shí)間， 最快在第10 天就開始萌發(fā)，萌發(fā)高峰期在第20～30 天，平均萌發(fā)率為12.5%，其萌發(fā)機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。周濃[30]等研究超聲波處理時(shí)間、溫度、功率對(duì)滇重樓種子萌發(fā)的影響，結(jié)果表明，滇重樓種子經(jīng)適當(dāng)?shù)某暡ㄌ幚?，可縮短萌發(fā)時(shí)間，提高發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)，40 min、50℃、200 W的超聲波處理?xiàng)l件最適宜于滇重樓種子萌發(fā)。 宋發(fā)軍[31]等用 25% （質(zhì)量比）PE 4 000 和 25% PEG 8 000浸種能有效打破華重樓種子休眠并促進(jìn)種子萌發(fā)。李海明[32]等以滇重樓和七葉一枝花的種子為研究對(duì)象，采用100 mol/L NO 供體一硝普鈉處理種子，以相同條件清水處理為對(duì)照，結(jié)果表明，硝普鈉處理的種子比對(duì)照提前20 d 萌發(fā)，在萌發(fā)培養(yǎng)后40~60 d，硝普鈉處理種子的自發(fā)超弱發(fā)光強(qiáng)度明顯高于對(duì)照。綜合來看，這些方法可以縮短重樓萌發(fā)時(shí)間，但萌發(fā)率普遍偏低。

4 展望

種子體眠能幫助度過種子成苗過程中的不利時(shí)期，對(duì)植物生態(tài)學(xué)和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有重要的意義[33]。 但休眠期過長(zhǎng)則會(huì)阻礙種植產(chǎn)業(yè)發(fā)展從而降低經(jīng)濟(jì)效益。 重樓由于其極高的經(jīng)濟(jì)與藥用價(jià)值而備受關(guān)注與研究，其規(guī)?；N植一直是亟待解決的問題，而種子萌發(fā)又是解決這個(gè)問題的關(guān)鍵。 近年來，重樓種子的研究從原來的對(duì)休眠與萌發(fā)的初步研究， 到現(xiàn)在種子的采收貯藏、 種子萌發(fā)過程中的生理生化變化及相關(guān)蛋白和基因的調(diào)控都有涉及。

研究過程存在的不足： ①解除休眠的研究方法大多采用室內(nèi)模擬發(fā)芽，自然條件下觀測(cè)研究較少，可將室內(nèi)和自然條件結(jié)合起來研究。 ②種子萌發(fā)多采用赤霉素浸泡結(jié)合層積處理， 在此過程中種子發(fā)生霉變概率很高，實(shí)際操作也比較繁瑣，應(yīng)該制定出適合農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的種子萌發(fā)配套規(guī)程。 ③已明確重樓種子內(nèi)源抑制物質(zhì)的存在，但處于生物鑒定階段，抑制物的成分種類及含量還不確定，有待進(jìn)一步研究。