基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對(duì)接探討降糖舒心方治療2型糖尿病合并冠心病的機(jī)制*

王 桐，徐梓輝

(陸軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院中醫(yī)/中西醫(yī)結(jié)合科，重慶 400037)

2型糖尿病(T2DM)是由胰島素抵抗伴隨胰島β細(xì)胞功能缺陷所導(dǎo)致胰島素分泌減少(或相對(duì)減少)引起的以高血糖為主要特征的代謝紊亂疾病[1]，其患病人數(shù)約占總糖尿病患病人數(shù)的90%。冠心病是心臟冠狀動(dòng)脈血管發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化病變引起血管腔狹窄或阻塞造成心肌缺血、缺氧、壞死而導(dǎo)致的心臟病[2]。有研究發(fā)現(xiàn)，T2DM患者發(fā)生微血管并發(fā)癥(包括視網(wǎng)膜病變、腎病和神經(jīng)病變)和大血管并發(fā)癥(如心血管并發(fā)癥)的風(fēng)險(xiǎn)很高[3]，同時(shí)，冠心病等大血管并發(fā)癥是造成糖尿病患者死亡的主要原因[4]。因此，及早發(fā)現(xiàn)和治療能有效緩解T2DM合并冠心病患者癥狀，延長(zhǎng)患者壽命。目前，西藥降糖作用較肯定，但其存在不良反應(yīng)及停藥后反彈，整體療效并不令人滿(mǎn)意[5]。隨著中醫(yī)藥事業(yè)的發(fā)展，中醫(yī)藥在防治T2DM合并冠心病的臨床實(shí)踐中體現(xiàn)出一定的優(yōu)勢(shì)和綜合療效，能有效改善患者臨床癥狀和預(yù)后。

降糖舒心方是由湖南中醫(yī)藥大學(xué)博士生導(dǎo)師陳大舜教授根據(jù)糖尿病合并冠心病的病機(jī)分析結(jié)合自己臨床體會(huì)在左歸丸基礎(chǔ)上化生的用于治療T2DM合并冠心病的專(zhuān)病方，由熟地、黃芪、山茱萸肉、枸杞、菟絲子、丹參、川芎、蒲黃、膽南星、黃連、藿香組成。經(jīng)多例臨床驗(yàn)證對(duì)改善空腹及餐后血糖、糖化血紅蛋白、胰島素敏感指數(shù)、血脂成分、心電圖等均具有療效[5]。但其作用機(jī)制尚有待于進(jìn)一步研究。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于系統(tǒng)生物學(xué)的理論對(duì)生物系統(tǒng)的網(wǎng)絡(luò)分析,從整體觀角度認(rèn)識(shí)藥物與機(jī)體相互作用并指導(dǎo)新藥的發(fā)現(xiàn)，特別適用于中藥與慢性疾病的研究[6-8]。本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討降糖舒心方治療T2DM合并冠心病的靶點(diǎn)及作用機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

使用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)(https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)檢索降糖舒心方中熟地、黃芪、山茱萸、枸杞等 11 味中藥的所有化學(xué)成分，同時(shí)根據(jù)藥物代謝動(dòng)力學(xué)相關(guān)參數(shù)將藥物口服生物利用度(OB)≥30%和藥物相似性(DL)≥0.18作為篩選的條件，將預(yù)測(cè)得到降糖舒心方的潛在作用靶點(diǎn)導(dǎo)入U(xiǎn)niprot 數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.uniprot.org/),將所檢索到的靶點(diǎn)校正為規(guī)范名稱(chēng)。

1.2 方法

1.2.1靶點(diǎn)獲取

以coronary heart disease、type 2 diabetes作為關(guān)鍵詞,分別在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.genecards.org/)與DisGeNET數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.disgenet.org/)中檢索冠心病和T2DM相關(guān)靶點(diǎn)，合并兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)果并去除重復(fù)值。

1.2.2蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)(PPI)構(gòu)建及核心網(wǎng)絡(luò)篩選

使用在線Venny軟件(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)對(duì)篩選出的降糖舒心方活性成分的靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)取交集并繪制韋恩圖，得到降糖舒心方治療T2DM合并冠心病的潛在共同作用靶點(diǎn)，然后再將共同靶點(diǎn)帶入在線網(wǎng)站STRING 11(https://string-db.org)獲取蛋白相互作用的關(guān)系，下載制表符分隔值(TSV)文件，然后使用Cytoscape3.8.2軟件繪制網(wǎng)絡(luò)圖，cytoHubba插件尋找PPI中的關(guān)鍵基因。

1.2.3共同靶點(diǎn)通路分析

將篩選得到的降糖舒心方治療T2DM合并冠心病的靶點(diǎn)使用clusProfiler R包進(jìn)行基因本體(GO)功能和京都基因與基因組百科全書(shū)(KEGG)通路分析與可視化處理。將58個(gè)共同靶點(diǎn)基因?qū)隦軟件并引用Colorspace、Stringi、Ggplot2、Bioconductor庫(kù)中的DOSE、ClusterProfiler、Enrichplot語(yǔ)言包進(jìn)行富集分析，設(shè)定P<0.05。

1.2.4構(gòu)建藥物-活性成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)

使用Cytoscape3.8.2軟件分別構(gòu)建藥物-成分-靶點(diǎn)、有效成分-共同靶點(diǎn)、共同靶點(diǎn)-GO分析-KEGG通路分析網(wǎng)絡(luò)，并分析活性成分及靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)，根據(jù)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)判斷發(fā)揮藥效的主要活性成分。

1.2.5分子對(duì)接驗(yàn)證

1.2.5.1小分子化合物的準(zhǔn)備

對(duì)接的化合物[包括槲皮素(Quercetin)、花生四烯酸(Arachidonic-acid)、β-谷甾醇(beta-Sitosterol)、異鼠李素(Isorhamneti)、山奈酚(Kaempferol)]來(lái)自PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)，將所有的結(jié)構(gòu)導(dǎo)入Schrodinger軟件建立數(shù)據(jù)庫(kù)，通過(guò)加氫、結(jié)構(gòu)優(yōu)化和能量最小化,保存后作為分子對(duì)接的配體分子數(shù)據(jù)庫(kù)。

1.2.5.2靶點(diǎn)蛋白結(jié)構(gòu)的準(zhǔn)備

靶點(diǎn)蛋白晶體結(jié)構(gòu)從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)下載(https://www.rcsb.org/structure/)，蛋白結(jié)構(gòu)在Maestro11.9平臺(tái)進(jìn)行處理，用Schrodinger的Protein Preparation Wizard處理蛋白，去除結(jié)晶水，補(bǔ)加缺失的氫原子，并修復(fù)缺失鍵信息，修補(bǔ)缺失肽段，然后對(duì)蛋白進(jìn)行能量最小化、以及幾何結(jié)構(gòu)的優(yōu)化[9-10]。

1.2.5.3分子對(duì)接

對(duì)虛擬篩選的處理和優(yōu)化是通過(guò)Schrodinger Maestro軟件中的Glide模塊完成的。對(duì)蛋白質(zhì)的處理利用Protein Preparation Wizard模塊。對(duì)受體進(jìn)行預(yù)處理、優(yōu)化和最小化(利用OPLS3e力場(chǎng)進(jìn)行約束最小化)。所有化合物均按LigPre模塊的默認(rèn)設(shè)置制備。在Glide模塊中進(jìn)行篩選時(shí)導(dǎo)入制備好的受體，以在受體網(wǎng)格生成中指定合適的位置。選取蛋白的原配體作為10?盒子的質(zhì)心。首先將原配體進(jìn)行再對(duì)接，確認(rèn)對(duì)接方法選擇的可行性。然后對(duì)接結(jié)果通過(guò) Pymol(2D)和 LigPlus(3D)可視化。將Quercetin、Isorhamnetin、Kaempferol、Arachidonic-acid、beta-Sitosterol與TOP10靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行分子對(duì)接。通常計(jì)算結(jié)合能以評(píng)估成分與蛋白質(zhì)靶標(biāo)的親和力程度。一般認(rèn)為，結(jié)合能小于-4.25、-5.0或-7.0 kcal/mol分別表示配體與受體之間具有一定、良好或強(qiáng)的結(jié)合活性。結(jié)合能反映了受體與配體結(jié)合的可能性。結(jié)合能越低受體與配體的親和力越高，構(gòu)象越穩(wěn)定[11]。

2 結(jié) 果

2.1 活性成分及靶點(diǎn)

以 OB≥30%、DL≥0.18為篩選標(biāo)準(zhǔn)，在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索降糖舒心方的主要化學(xué)成分，并進(jìn)一步篩選。包括川芎4個(gè)，丹參14個(gè)，枸杞8個(gè)，廣藿香5個(gè)，黃連8個(gè)，蒲黃6個(gè)，天南星4個(gè)，菟絲子8個(gè)，黃芪8個(gè)，山茱萸9個(gè)，熟地黃2個(gè)，去除重復(fù)值，共發(fā)現(xiàn)降糖舒心方中含有主要化合物54個(gè)。見(jiàn)表1。同時(shí)通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)共檢索出化合物相關(guān)靶點(diǎn)141個(gè)，采用Cytoscape3.8.2軟件構(gòu)建降糖舒心方“藥物-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖。見(jiàn)圖1。

圖1 藥物-成分-靶點(diǎn)圖

表1 降糖舒心方活性成分

2.2 降糖舒心方與疾病共同靶點(diǎn)

通過(guò)對(duì)GeneCards和DisGeNET數(shù)據(jù)庫(kù)的檢索，得到T2DM相關(guān)靶點(diǎn)2 755個(gè)、冠心病相關(guān)靶點(diǎn)1 246個(gè)，將141個(gè)降糖舒心方的作用靶點(diǎn)與T2DM相關(guān)靶點(diǎn)和冠心病相關(guān)靶點(diǎn)繪制韋恩圖，三者取交集后獲得共同靶點(diǎn)58個(gè)。見(jiàn)圖2。有效成分與取交集選取出來(lái)的58個(gè)共同靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)圖見(jiàn)圖3。

圖2 降糖舒心方靶點(diǎn)T2DM、冠心病的共同靶點(diǎn)韋恩圖

2.3 PPI構(gòu)建

在STRING數(shù)據(jù)庫(kù)導(dǎo)入58個(gè)共同靶點(diǎn)基因構(gòu)建PPI圖，其中57個(gè)靶點(diǎn)基因關(guān)系緊密，糜蛋白酶原B1與其他靶點(diǎn)基因無(wú)相互作用(未顯示)，使用cytoHubba插件中最大集團(tuán)中心性方法得到的前十關(guān)鍵基因?yàn)榘准?xì)胞介素-6(IL-6)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A(VEGFA)、表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)、絲裂原激活蛋白激酶8(MAPK8)、V-REL網(wǎng)狀內(nèi)皮增生病毒癌基因同源物A(RELA)、FBJ小鼠骨肉瘤病毒癌基因同源物(FOS)、過(guò)氧化物酶體增值物激活受體γ(PPARG)、缺氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α)、核受體亞家族3C組成員1(NR3C1)、雌激素受體α(ESR1)等，表明這些基因在PPI中具有關(guān)鍵橋接作用，可能是降糖舒心方治療T2DM合并冠心病的核心靶點(diǎn)，靶點(diǎn)之間相互作用關(guān)系見(jiàn)圖4。顏色越紅表示在網(wǎng)絡(luò)中越重要，其他方法得到的TOP10基因見(jiàn)表2。

表2 通過(guò)使用cytoHubba插件下的不同方法獲得的Top 10基因

圖4 PPI圖

2.4 GO功能分析

共獲得1 526個(gè)條目，根據(jù)P值由小至大排序選取前10個(gè)GO條目，可視化分析結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 GO生物過(guò)程分析

2.5 KEGG通路分析及構(gòu)建共同靶點(diǎn)-GO分析-KEGG通路網(wǎng)絡(luò)

主要確定了84條主要信號(hào)通路，根據(jù)P值由小至大排序選取前20個(gè)條目，可視化分析結(jié)果見(jiàn)圖6。共同靶點(diǎn)主要富集在脂質(zhì)與動(dòng)脈粥樣硬化、流體剪應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病并發(fā)癥中的晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGE)-AGE 受體(RAGE)信號(hào)通路、腫瘤壞死因子(TNF)信號(hào)通路等，涉及代謝、凋亡等多方面，提示降糖舒心方治療T2DM合并冠心病可能與影響這些信號(hào)通路有關(guān)。然后在84條KEGG信號(hào)通路中篩選與T2DM和冠心病相關(guān)且P值排名靠前通路，利用Cytoscape3.8.2軟件構(gòu)建共同靶點(diǎn)-GO分析-KEGG通路網(wǎng)絡(luò)。見(jiàn)圖7。

圖6 KEGG通路富集分析

圖7 共同靶點(diǎn)-GO分析-KEGG通路網(wǎng)絡(luò)

2.6 分子對(duì)接

Quercetin、Isorhamnetin、Kaempferol、Arachidonic-acid、Beta-sitosterol可以很好地與TOP10蛋白質(zhì)靶點(diǎn)的活性位點(diǎn)結(jié)合。其中NOS3與Quercetin對(duì)接結(jié)合能最低(-9.10 kcal/mol)。見(jiàn)圖8。降糖舒心方的3種代表性化合物(Quercetin、Isorhamnetin、Kaempferol)可以與T2DM合并冠心病的3個(gè)核心靶點(diǎn)(IL-6、VEGFA、NOS3)很好地結(jié)合，形成穩(wěn)定的復(fù)合體。見(jiàn)圖9、10。以上這些可能在T2DM合并冠心病的治療中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

圖8 主要活性成分與TOP10基因分子對(duì)接結(jié)合能熱圖

圖9 Quercetin、Isorhamnetin、Kaempferol分子結(jié)構(gòu)式

A：IL-6與Quercetin；B：IL-6與Isorhamnetin；C：IL-6與Kaempferol；D：VEGFA與Quercetin；E：VEGFA與Isorhamnetin；F：VEGFA與Kaempferol；G：NOS3與Quercetin；H：NOS3與Isorhamnetin；I：NOS3與Kaempferol。

3 討 論

中醫(yī)本無(wú)糖尿病、冠心病之名，根據(jù)其臨床癥狀、體征分別歸屬于消渴、胸痹等范疇，均多發(fā)于中、老年人。目前，兒童及青少年發(fā)病率也在不斷上升。其發(fā)病、病機(jī)可概括為飲食不節(jié)、情志失調(diào)、勞欲過(guò)度等因素導(dǎo)致的陰虛內(nèi)熱、消灼津液，病程日久，陰損及陽(yáng)，氣陰兩虛，瘀血阻滯，痰濕內(nèi)生，變生百癥。瘀血、痰濕作為糖尿病合并冠心病發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的病理產(chǎn)物，阻于心脈而發(fā)為胸痹。

降糖舒心方是經(jīng)過(guò)多年臨床觀察和研究所得的復(fù)方中藥制劑，對(duì)調(diào)節(jié)糖脂代謝、改善代謝綜合征患者臨床癥狀具有肯定療效。其主要由熟地、黃芪、山萸、枸杞、菟絲子、丹參、川芎、蒲黃、膽南星、黃連、藿香等組成。以熟地、黃芪為君補(bǔ)益腎之氣陰，以冀腎氣復(fù)則司溫煦心火之能，腎陰充則上滋心陰而司濡養(yǎng)心營(yíng)之功，二者相伍，陰陽(yáng)互濟(jì)，使心之氣營(yíng)平秘，心絡(luò)得以煦濡則自無(wú)心痛之慮。臣以菟絲子、山萸肉、枸杞補(bǔ)益肝腎，菟絲子補(bǔ)陽(yáng)益陰，山萸肉溫澀，與枸杞甘平養(yǎng)陰相伍，并助熟地以陰中求陽(yáng)，陽(yáng)中求陰，共濟(jì)腎臟水火之功，且能兼以治肝，使肝氣通則心氣和(《明醫(yī)雜著·醫(yī)論》)；丹參、川芎、蒲黃行氣、活血、化瘀通絡(luò)，使心絡(luò)通暢，通則不痛，心痛常能蠲除。膽南星、黃連為佐藥，苦寒、清熱、化痰，以祛久蘊(yùn)心絡(luò)之痰熱脂濁，使絡(luò)脈通而心痛止。藿香為使藥，芳香行散，化濕濁而祛心痛(《別錄》)。全方陰陽(yáng)互濟(jì)，寒溫并調(diào)，補(bǔ)通兼施，補(bǔ)而不礙邪，攻而不傷正，共奏益氣養(yǎng)陰、活血祛瘀、化痰通脈之功，適用于消渴并胸痹、氣陰兩虛、瘀痰阻絡(luò)之證，以期達(dá)到陰陽(yáng)平、瘀血祛、痰濕除、心脈通而疼痛止之功效。

本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)經(jīng)篩選發(fā)現(xiàn)中藥復(fù)方降糖舒心方中有效成分54個(gè)，作用靶點(diǎn)141個(gè)，其中與T2DM合并冠心病共有靶點(diǎn)58個(gè)。同時(shí)構(gòu)建了藥物-有效成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)、有效成分-共同靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)和共同靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)，分析了有效成分、靶點(diǎn)、通路之間的作用關(guān)系，結(jié)果顯示，Quercetin、Kaempferol、Isorhamnetin、Arachidonic-acid、beta-Sitosterol匹配靶點(diǎn)較多，可能為降糖舒心方治療T2DM合并冠心病的核心組分。Quercetin是一種黃酮類(lèi)化合物，具有增強(qiáng)胰島素敏感性、促進(jìn)胰島素分泌、促進(jìn)糖原合成、抑制α-葡萄糖苷酶活性等抗糖尿病作用[12],并且可通過(guò)抑制炎癥、保護(hù)內(nèi)皮功能等多條通路起到心血管保護(hù)作用[13]。Kaempferol是黃酮類(lèi)化合物，其對(duì)預(yù)防與治療糖尿病、心血管疾病具有積極作用[14],具體表現(xiàn)在抗炎、抗氧化、抗凋亡等方面，如可通過(guò)AGE-RAGE/MAPK通路減少氧化應(yīng)激和炎癥，從而緩解糖尿病大鼠的心肌缺血再灌注損傷[15]。Isorhamnetin是黃酮類(lèi)化合物，可通過(guò)調(diào)節(jié)核因子κB(NF-κB)、磷酸肌醇-3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)、MAPK等信號(hào)通路及其下游因子起到心腦血管保護(hù)、抗炎、抗氧化、降血糖等作用[16]。Arachidonic-acid是一種重要的人體必須脂肪酸，對(duì)維持人體細(xì)胞與功能具有重要作用，由于Arachidonic-acid在人體代謝中處于核心地位，所以，Arachidonic-acid及其衍生物可將營(yíng)養(yǎng)代謝與免疫和炎癥聯(lián)系起來(lái)，從而在糖尿病、肥胖、心血管疾病的出現(xiàn)和進(jìn)展中具有關(guān)鍵作用，目前認(rèn)為，Arachidonic-acid對(duì)預(yù)防心血管疾病、糖尿病和腫瘤等具有重要功效[17]。beta-Sitosterol是甾醇類(lèi)化合物，具有抗焦慮、抗炎、抗氧化、抗糖尿病等功效，同時(shí)可降低血液中膽固醇水平，降低發(fā)生心臟病的風(fēng)險(xiǎn)[18]。此外，Quercetin、Isorhamnetin、Kaempferol抗T2DM與冠心病的靶基因或通路與本研究中確定的降糖舒心方抗T2DM與冠心病的靶基因和通路部分一致，表明降糖舒心方通過(guò)多組分、多靶點(diǎn)的相互作用治療T2DM合并冠心病。

為探索降糖舒心方治療T2DM合并冠心病的核心靶點(diǎn)，本研究構(gòu)建了58個(gè)共同靶點(diǎn)的PPI，得到顯著性較大的靶點(diǎn)，包括IL-6、VEGFA、MAPK8、NOS3、ESR1、EGFR等，尤其是IL-6、VEGFA和NOS3，可能是降糖舒心方治療T2DM合并冠心病的核心靶點(diǎn)。IL-6在PPI中節(jié)點(diǎn)數(shù)量最多，可能是降糖舒心方治療T2DM合并冠心病的最重要的靶點(diǎn)。IL-6在多種疾病中均具有明顯改變，其表達(dá)失調(diào)也可引起多種疾病的發(fā)生，慢性暴露于IL-6可導(dǎo)致低級(jí)組織特異性或全身性炎癥，干擾胰島素信號(hào)通路，促進(jìn)β細(xì)胞凋亡，并且通過(guò)多種炎癥信號(hào)途徑促進(jìn)多器官的胰島素抵抗[19]。IL-6能損害內(nèi)皮功能并作用于血管壁的斑塊，加速斑塊的破裂[20]。除IL-6外，VEGFA在生理及病理?xiàng)l件下調(diào)節(jié)血管生成與血管滲透性，在糖尿病及其并發(fā)癥發(fā)病過(guò)程中具有關(guān)鍵作用[21]。在心血管方面VEGFA可通過(guò)ROS-ER stress-autophagy軸促進(jìn)急性心肌缺血后的血管再生[22]。VEGFA可通過(guò)與VEGFR-1、VEGFR-2結(jié)合調(diào)節(jié)血管生成、血管通透性和炎癥，影響動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生與發(fā)展[23]。過(guò)去的研究發(fā)現(xiàn)，NOS3在內(nèi)皮細(xì)胞的正常功能中發(fā)揮著重要作用，其相關(guān)途徑的損害與包括糖尿病在內(nèi)的各種血管病變密切相關(guān)[24]。剪切應(yīng)力通過(guò)PI3K/Akt途徑調(diào)控NOS3表達(dá)，進(jìn)而影響內(nèi)皮細(xì)胞增殖、血管舒張、血管收縮和炎性反應(yīng)[25]。進(jìn)一步支持了本研究關(guān)于IL-6、VEGFA、NOS3等靶點(diǎn)基因在降糖舒心方治療T2DM合并冠心病中具有重要意義的發(fā)現(xiàn)。

本研究降糖舒心方治療T2DM合并冠心病的靶點(diǎn)GO通路富集顯示，生物過(guò)程主要包括細(xì)胞對(duì)化學(xué)應(yīng)激的反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)、對(duì)細(xì)胞外刺激的反應(yīng)等，細(xì)胞組分主要包括脂筏、膜微區(qū)、囊腔等，分子功能主要包括轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、類(lèi)固醇結(jié)合、核受體活性等。KEGG信號(hào)通路富集分析顯示，降糖舒心方治療T2DM合并冠心病的主要通路有流體切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路等，突出了降糖舒心方通過(guò)多種途徑治療T2DM合并冠心病。

心臟冠狀動(dòng)脈的粥樣硬化是冠心病發(fā)病原因，動(dòng)脈粥樣硬化是一種慢性炎性病變，內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙是起始環(huán)節(jié)，而力學(xué)刺激是影響心血管系統(tǒng)的一個(gè)重要因素。已有學(xué)者指出，剪切應(yīng)力可誘導(dǎo)血管炎癥、內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和自噬等信號(hào)通路，與動(dòng)脈斑塊的形成與破裂具有很重要的聯(lián)系，在動(dòng)脈粥樣硬化病變的發(fā)生和發(fā)展中具有關(guān)鍵作用[26-28]。AGE是一組在蛋白質(zhì)、脂肪酸或核酸的氨基基團(tuán)與還原糖的醛基之間發(fā)生非酶性糖基化反應(yīng)所形成的一系列具有高度活性終產(chǎn)物的總稱(chēng)。AGE與RAGE結(jié)合后可激活細(xì)胞Janus激酶2-信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子與轉(zhuǎn)錄激活子-干擾物激活反應(yīng)元件(JAK2-STAT-ISRE)、PI3K-Akt、ROS、MAPK-ERK、NF-κB通路，調(diào)控細(xì)胞分化、凋亡、促進(jìn)氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)等，同AGE-RAGE軸的激活可通過(guò)二肽基肽酶4分泌系統(tǒng)(DPP4-incretin system)、整合素連接激酶-哺乳動(dòng)物雷帕霉素蛋白通路(ILK-mTOR)、代謝記憶(Metabolic memory)相關(guān)通路促進(jìn)糖尿病性動(dòng)脈粥樣硬化的形成[29]。TNF是組成急性炎性反應(yīng)的細(xì)胞因子之一，可觸發(fā)MAPK、NF-κB途徑，導(dǎo)致胰島素抵抗的發(fā)生,TNF還參與各種心血管疾病的發(fā)展,包括病毒性心肌炎、急性心肌梗死、動(dòng)脈粥樣硬化和慢性心力衰竭[30]。PI3K-Akt信號(hào)通路參與了許多細(xì)胞進(jìn)程的調(diào)控，包括細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞增殖及糖脂代謝、胰島素作用等，PI3K-Akt及其下游分子也被認(rèn)為是肥胖、糖尿病及其并發(fā)癥、冠心病的治療靶點(diǎn)[31-34]。有研究證實(shí)，Quercetin、Isorhamnetin、Kaempferol等化合物正是通過(guò)以上信號(hào)通路影響了T2DM與冠心病的進(jìn)展。如Quercetin作為一種常見(jiàn)的黃酮類(lèi)化合物，具有抗炎、抗氧化、抑制AGE在血管內(nèi)蓄積等生物學(xué)功能，其機(jī)制與PI3K-Akt通路、AGE-RAGE通路、NF-κB通路密不可分[35]。Kaempferol是最常見(jiàn)的膳食類(lèi)黃酮之一，具有抗氧化、抗凋亡、抗糖尿病、抗腫瘤等生物學(xué)活性，可通過(guò)AGE/RAGE/MAPK通路減輕糖尿病大鼠的心肌缺血再灌注損傷[15]。Kaempferol的攝入可降低冠心病發(fā)病率和病死率[36]。Kaempferol通過(guò)抑制p38/c-Jun氨基末端激酶(JNK)/TNF-α/NF-κBp65通路防止大鼠心臟缺血再灌注損傷并改善心功能[37]。

基于以上網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果，本研究又對(duì)降糖舒心方治療T2DM合并冠心病的主要活性化合物與TOP10基因靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行了分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，這些活性成分與靶點(diǎn)蛋白大多具有較低的結(jié)合能，可形成穩(wěn)定的復(fù)合物。同時(shí)展示了3個(gè)關(guān)鍵活性成分(Quercetin、Isorhamnetin、Kaempferol)和3個(gè)具有代表性的靶點(diǎn)(IL-6、VEGFA、NOS3)的分子對(duì)接示意圖，顯示出Quercetin、Isorhamnetin、Kaempferol與核心靶點(diǎn)IL-6、VEGFA、NOS3具有較高的親和力，且結(jié)合位點(diǎn)均有穩(wěn)定的氫鍵，構(gòu)象穩(wěn)定。表明活性成分可直接影響機(jī)體炎癥水平，改善血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖狀態(tài)，進(jìn)一步驗(yàn)證了降糖舒心方可能通過(guò)以上多種活性成分作用于多靶點(diǎn)而影響T2DM與冠心病的發(fā)展。

綜上所述，本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對(duì)降糖舒心方的有效化學(xué)成分、作用靶點(diǎn)和其對(duì)T2DM合并冠心病的作用途徑進(jìn)行了探索性研究，證實(shí)了降糖舒心方治療T2DM合并冠心病是通過(guò)多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的協(xié)同作用發(fā)揮療效的，為后期研究提供了理論依據(jù)。