聯(lián)合檢測(cè)血漿Septin9基因甲基化及紅細(xì)胞分布寬度對(duì)結(jié)直腸癌的診斷價(jià)值*

鄧 燚,黃美園,樂文星,陳棟良

(湖南省株洲市中心醫(yī)院病理科 412000)

結(jié)直腸癌(colorectal cancer,CRC)是我國最常見消化道惡性腫瘤之一，據(jù)2015年國家癌癥中心統(tǒng)計(jì)，其發(fā)病率和病死率分別位居我國常見惡性腫瘤第3、5位[1]。隨著人們生活水平提高和中國逐漸步入老齡化社會(huì)，CRC發(fā)病率和死亡率一直居高不下，究其原因主要為大部分患者就診時(shí)已為中晚期。因此，早期診斷CRC對(duì)提高患者生活質(zhì)量具有重要意義。CRC常用篩查方法是糞便潛血試驗(yàn)和腸鏡檢查，糞便潛血試驗(yàn)特異性較低，腸鏡檢查患者依從性較差，尋求一種簡單、快捷、無創(chuàng)、患者依從性好的CRC早期篩查手段是當(dāng)前國內(nèi)外研究熱點(diǎn)。本研究探討了Septin9基因甲基化(mSEPT9)與紅細(xì)胞分布寬度(RDW)聯(lián)合檢測(cè)對(duì)CRC的診斷價(jià)值，并分析了CRC患者mSEPT9、RDW與臨床病理特征的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2020年6月至2022年6月本院收治的經(jīng)手術(shù)切除治療且術(shù)前未進(jìn)行放、化療的CRC患者144例作為研究對(duì)象，并以同期內(nèi)鏡切除診斷為結(jié)直腸良性病變(腺瘤和增生性息肉)的患者134例作為結(jié)直腸息肉組，選取同期100例健康體檢者作為健康對(duì)照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)腸道病變經(jīng)組織病理學(xué)確診；(2)健康對(duì)照組腸鏡檢查結(jié)果陰性；(3)簽署本研究知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)術(shù)前接受放、化療；(2)合并其他部位惡性腫瘤；(3)患有血液疾病，包括貧血等；(4)合并自身免疫性疾病，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡等；(5)近期輸血、嚴(yán)重感染及多器官功能衰竭。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)審批。

1.2 方法

1.2.1標(biāo)本采集

結(jié)直腸病變患者術(shù)前1周、健康對(duì)照組研究對(duì)象健康體檢時(shí)分別由專業(yè)護(hù)士采用乙二胺四乙酸負(fù)壓抗凝管采集肘前靜脈血10、2 mL，用于mSEPT9和血常規(guī)檢測(cè)。

1.2.2主要試劑及儀器

包括全血基因組DNA提取試劑盒、天根公司磁珠法大體積游離核酸提取試劑盒(DP710)、游離核酸DNA重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化試劑盒(DP215)、北京鑫諾美迪基因檢測(cè)技術(shù)有限公司自主研發(fā)的mSEPT9檢測(cè)試劑盒[聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)-熒光探針法]、ABI熒光定量PCR儀、日本希森美康XNA1全自動(dòng)血液分析儀等。

1.2.3mSEPT9的檢測(cè)

采用購自北京鑫諾美迪基因檢測(cè)技術(shù)有限公司mSEPT9檢測(cè)試劑盒(PCR-熒光探針法)進(jìn)行單盲檢測(cè)。主要操作步驟：(1)DNA提??；(2)重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化；(3)熒光定量PCR。PCR在ABI熒光定量儀上進(jìn)行，反應(yīng)條件按試劑盒說明書進(jìn)行。PCR選擇人類管家基因β-肌動(dòng)蛋白作為內(nèi)參照，PCR進(jìn)行1次，其起峰反應(yīng)循環(huán)數(shù)(Ct)低于閾值(45.0)為陽性，高于閾值為陰性。

1.2.4血常規(guī)檢測(cè)

采集3組研究對(duì)象肘前靜脈血2 mL進(jìn)行血常規(guī)檢查，檢測(cè)儀器為日本希森美康XNA1全自動(dòng)血液分析儀，檢測(cè)RDW、紅細(xì)胞、血紅蛋白(Hb)、白細(xì)胞(WBC)、血小板(PLT)等，并比較3組研究對(duì)象上述指標(biāo)的差異。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 mSEPT9陽性率

CRC組患者mSEPT9陽性率[61.81%(89/144)]均明顯高于結(jié)直腸息肉組[11.94%(16/134)]和健康對(duì)照組[10.00%(10/100)]，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=38.96，P<0.001)；結(jié)直腸息肉組患者mSEPT9陽性率與健康對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 血常規(guī)

CRC組患者RDW、PLT表達(dá)水平均明顯高于結(jié)直腸息肉組和健康對(duì)照組，紅細(xì)胞、Hb表達(dá)水平均明顯低于結(jié)直腸息肉組和健康對(duì)照組。3組研究對(duì)象血常規(guī)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 3組研究對(duì)象血常規(guī)比較

2.3 臨床病理特征與mSEPT9的關(guān)系

TNM分期為晚期的CRC患者mSEPT9陽性率明顯高于早期CRC患者(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期患者mSEPT9陽性率分別為26.3%、67.3%、58.5%、94.1%)，癌組織浸潤腸壁固有肌層者及遠(yuǎn)處臟器轉(zhuǎn)移者mSEPT9陽性率明顯升高，腫瘤最大徑大于或等于5 cm者mSEPT9陽性率明顯高于小于5 cm者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。不同年齡、性別、腫瘤部位、大體分型、組織學(xué)類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管內(nèi)癌栓、神經(jīng)受累CRC患者mSEPT9陽性率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 不同臨床病理特征CRC患者mSEPT9陽性率比較[n(%)]

2.4 臨床病理特征與RDW的關(guān)系

TNM分期Ⅳ期CRC患者RDW表達(dá)水平高于Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期CRC患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期CRC患者RDW水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。癌組織浸潤腸壁固有肌層者RDW表達(dá)水平明顯升高，結(jié)腸癌患者RDW表達(dá)水平高于直腸癌患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；左半結(jié)腸癌患者RDW相對(duì)表達(dá)水平與右半結(jié)腸癌比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。不同年齡、性別、腫瘤最大徑、大體分型、組織學(xué)類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、脈管內(nèi)癌栓、神經(jīng)受累CRC患者RDW表達(dá)水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 不同臨床病理特征CRC患者RDW表達(dá)水平比較

2.5 診斷效能

CRC組患者RDW表達(dá)水平[(14.00±3.08)%]明顯高于結(jié)直腸息肉組[(12.76±1.31)%]和健康對(duì)照組[(12.43±0.56)%]，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。RDW診斷CRC的ROC曲線下面積(AUC)為0.694，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，靈敏度為50.00%，特異度為89.00%。mSEPT9診斷CRC的ROC AUC為0.752，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，靈敏度為61.81%，特異度為90.0%。RDW聯(lián)合mSEPT9診斷CRC的ROC AUC為0.794，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，靈敏度為73.61%，特異度為83.00%。見圖1。mSEPT9聯(lián)合RDW檢測(cè)進(jìn)一步提高了診斷CRC的ROC AUC和靈敏度，對(duì)CRC的診斷具有重要價(jià)值。

圖1 RDW及mSEPT9診斷CRC的ROC曲線

3 討 論

CRC是全球第三大常見惡性腫瘤和第二大癌癥相關(guān)死亡原因，估計(jì)2020年有193萬新增病例和94萬死亡病例，特別是中國，其發(fā)病率和死亡率逐年攀升[2-3]。CRC高發(fā)病率與死亡率可歸根于診斷延遲和早期診斷準(zhǔn)確性不夠。因此，迫切需要尋找CRC早期診斷的高靈敏方法，以改善CRC患者治療結(jié)果并降低死亡率。

DNA甲基化對(duì)基因調(diào)控、維持細(xì)胞身份和表觀遺傳變化至關(guān)重要[4-5]。異常DNA甲基化已被證明與包括CRC在內(nèi)的幾種癌癥的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)[6-8]。已有研究表明，幾種基因的DNA甲基化與CRC的發(fā)生有關(guān)，其中一些可作為CRC的潛在篩查生物標(biāo)志物[9-10]。在這些生物標(biāo)志物中mSEPT9被認(rèn)為是檢測(cè)CRC的較有希望的生物標(biāo)志物[11]。目前，mSEPT9檢測(cè)已獲得國家食品藥品監(jiān)督管理總局的批準(zhǔn)，可用于CRC早期診斷的臨床檢測(cè)[12]。

RDW是血常規(guī)的常規(guī)檢測(cè)指標(biāo)，是反映血液循環(huán)中紅細(xì)胞大小異質(zhì)性的參數(shù)[13-14]。有研究表明，RDW在幾種實(shí)體癌中顯著表達(dá)，包括肺癌、乳腺癌、食管鱗狀細(xì)胞癌、腎細(xì)胞癌和其他實(shí)體癌，RDW升高與實(shí)體瘤患者預(yù)后密切相關(guān)[15-16]。雖然mSEPT9對(duì)CRC具有一定診斷價(jià)值，但其靈敏度仍較低。因此，采取多種篩查手段聯(lián)合檢測(cè)有利于提高對(duì)CRC的診斷效能。

目前，結(jié)腸鏡檢查是診斷CRC的“金標(biāo)準(zhǔn)”。然而由于給患者帶來不便，使用結(jié)腸鏡檢查的篩查率較低。此外，手術(shù)相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)和患者不依從性限制了侵入性結(jié)腸鏡檢查的廣泛應(yīng)用[17]。與侵入性結(jié)腸鏡檢查及活檢病理檢查比較，基于外周血的篩查具有無創(chuàng)、操作簡便、患者容易接受及可用于普查等優(yōu)點(diǎn)。本研究結(jié)果顯示，血漿mSEPT9診斷CRC的ROC AUC為0.752，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，靈敏度為61.81%，特異度為90.00%，具有較高的特異度，與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果相似[18-19]，但其靈敏度并不理想。RDW 是主要反映紅細(xì)胞生成受損和紅細(xì)胞存活異常的指標(biāo)，是一種廉價(jià)且易獲得的參數(shù)。近年來，人們主要關(guān)注RDW在心血管疾病及癌癥預(yù)后的關(guān)系[20-21]，很少有文獻(xiàn)報(bào)道關(guān)注RDW在CRC早期診斷中的價(jià)值。本研究結(jié)果顯示，RDW診斷CRC的ROC AUC為0.694，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，靈敏度為50.00%，特異度為89.00%，與SPELL 等[22]研究結(jié)果相似。同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)，RDW聯(lián)合mSEPT9檢測(cè)診斷CRC的AUC為0.794，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，靈敏度為73.61%，特異度為83.00%，進(jìn)一步提高了診斷CRC的ROC AUC、靈敏度和特異度，對(duì)CRC診斷具有重要價(jià)值，可用于CRC早期篩查。

目前，少有研究關(guān)注CRC患者臨床病理特征與mSEPT9陽性率、RDW表達(dá)水平的關(guān)系。腫瘤TNM分期是CRC臨床分期最常用方法，是基于原發(fā)腫瘤浸潤深度(T分期)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(N分期)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(M分期)情況進(jìn)行綜合評(píng)估。本研究結(jié)果顯示，mSEPT9陽性率、RDW表達(dá)水平均與TNM分期明顯相關(guān)，其中mSEPT9陽性率主要與T、M分期相關(guān)；另外本研究還發(fā)現(xiàn)，腫瘤最大徑大于或等于5 cm者mSEPT9陽性率明顯高于小于5 cm者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說明mSEPT9陽性率與腫瘤大小相關(guān)；與LU等[23]研究結(jié)果相似。同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)，RDW表達(dá)水平與癌組織是否穿透腸壁固有肌層(T分期)明顯相關(guān)，且結(jié)腸癌患者RDW表達(dá)水平明顯高于直腸癌，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),左半結(jié)腸癌與右半結(jié)腸癌患者比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，與SHI 等[24]研究結(jié)果相似。

綜上所述,血漿mSEPT9與RDW聯(lián)合檢測(cè)可明顯提高CRC診斷效能,對(duì)CRC的診斷具有很高的價(jià)值。同時(shí)也提示臨床醫(yī)師在診療過程中不應(yīng)忽視血常規(guī)中RDW這個(gè)參數(shù)，以減少CRC早期漏診率。同時(shí)本研究還簡單揭示了mSEPT9狀態(tài)、RDW表達(dá)水平與CRC患者臨床病理特征的關(guān)系。但由于本研究樣本量太少,對(duì)血漿mSEPT9、RDW檢測(cè)在 CRC臨床分期中的診斷價(jià)值未進(jìn)行進(jìn)一步研究,今后將繼續(xù)不斷積累病例,期望為 CRC分期診斷提供更可靠的科學(xué)依據(jù)。