四氫姜黃素對大鼠C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞的抑制作用及機制研究*

任 薇，李曉珺，張 倩，李楚文△

(1.廣東省第二中醫(yī)院/廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院/廣東省中醫(yī)藥研究開發(fā)重點實驗室，廣州 510095；2.廣州醫(yī)科大學藥學院，廣州 511436)

膠質(zhì)瘤是最常見的原發(fā)性腦瘤，約占全部腦瘤的80%，其中膠質(zhì)母細胞瘤是最惡性的腦腫瘤，目前的治療方式有腫瘤切除、化療、放療、抗血管類靶向藥物治療等，但由于膠質(zhì)母細胞瘤生長快速，廣泛浸潤?quán)徑X組織，假性壞死和誘導血管生成，且無明顯的作用靶點，阻礙了療效，且膠質(zhì)瘤患者預(yù)后較差，70%的膠質(zhì)瘤患者在第1次術(shù)后10年內(nèi)復發(fā)[1]。因此，尋找直接且密切相關(guān)的靶點、探索膠質(zhì)瘤的潛在機制、尋找新的治療方法或更好的藥物具有重要意義。近年來，在分子水平上對膠質(zhì)瘤發(fā)病機制的研究發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)瘤的發(fā)病由異常的病理過程所致，如細胞周期調(diào)控、信號傳導、DNA損傷修復缺陷等[2]。因此，迫切需要在遺傳和分子水平上更好地了解膠質(zhì)瘤的發(fā)生和發(fā)展，以確定新的治療策略。

姜黃素是一種天然化合物，具有抗腫瘤作用，對肝癌、乳腺癌均具有抑制增殖、調(diào)節(jié)信號通路等多種作用[3-4]。姜黃素在體內(nèi)的主要活性代謝產(chǎn)物為四氫姜黃素(THC)，其比姜黃素在生理條件下更穩(wěn)定，在水介質(zhì)中更易溶解，而且在血漿中具有良好的穩(wěn)定性，因而具有更高的生物利用度[5-11]。THC具有抗氧化和抗炎作用，以及預(yù)防治療阿爾茲海默癥等功能，對多種癌細胞具有抗腫瘤活性。基于此，本研究探討了THC對C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞增殖的影響，揭示其對過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)/核因子-κB(NF-κB)信號通路調(diào)控的機制，旨在為神經(jīng)膠質(zhì)瘤的治療提供新策略，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞

來自美國菌種保藏中心(ATCC)的大鼠 C6 神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞系。

1.1.2藥物與試劑

THC購自上海源葉生物科技有限公司，杜氏改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM)購自美國Sigma-Aldrich公司，胎牛血清(FBS)購自美國Gibco公司，青霉素-鏈霉素(分別取100 U/mL-100 μg/mL)購自美國Sigma-Aldrich公司，含 0.25% 1 mmol胰蛋白酶的乙二胺四乙酸(EDTA)溶液購自美國Thermo Fisher Scientific公司，四甲基偶氮唑鹽(MTT)購自美國Sigma-Aldrich公司(批號：M5655)，裂解緩沖液(RIPA)購自美國Santa Cruz Biotechnology公司，酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒購自美國Thermo Fisher Scientific公司，二氫乙錠(DHE)-活性氧(ROS)檢測試劑盒(MCH100111)購自德國Merck Millipore公司，Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自德國Merck Millipore公司，Muse?caspase-3/7試劑盒(MCH100108)購自德國Merck Millipore公司，RNA分離試劑盒購自美國Thermo Fisher Scientific公司，SuperScriptTMⅣ一步法逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)系統(tǒng)購自美國Thermo Fisher Scientific公司，SYBR Green預(yù)混液購自美國Applied Biosystems公司，二辛可寧酸Pierce(BCA)蛋白質(zhì)測定試劑盒購自美國Thermo Fisher Scientific公司，聚偏二氟乙烯(PVDF)膜購自美國Bio-Rad公司，PPARγ、NF-κB、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)、β-肌動蛋白(β-actin)均購自美國Cell Signaling Technology公司，增強型化學發(fā)光(ECL)測定試劑盒購自美國GE Healthcare公司。

1.1.3主要儀器

酶標儀(800TS)購自美國BioTek Instruments公司，流式細胞術(shù)(Muse?Cell Analyzer)購自德國Merck Millipore公司，StepOnePlusTM實時熒光定量PCR系統(tǒng)購自美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 方法

1.2.1細胞培養(yǎng)及THC處理

使用含有10%FBS和1%青鏈霉素雙抗(PS)的DMEM完全培養(yǎng)基于37 ℃、5%二氧化碳細胞恒溫培養(yǎng)箱中孵育C6細胞，于培養(yǎng)瓶中貼壁生長至80%～90%時用含有0.25% 1 mmol/L胰蛋白酶的EDTA溶液分離C6細胞。加入新鮮配制不同濃度(12.5、25.0、50.0、100.0、200.0、400.0和800.0 μmol/L)的THC藥液至96孔板中，每孔加100 μL。分別培養(yǎng)24、48、72 h，取出96孔板，棄舊培養(yǎng)基，再避光加入0.5 mg/mL新鮮制備的MTT溶液，每孔加100 μL。在黑暗中于培養(yǎng)箱中孵育3 h。棄上清液，將形成的甲臜晶體溶解在100 μL 100%二甲基亞砜(DMSO)中。用酶標儀570 nm波長檢測吸光度值。為計算細胞活力將未經(jīng)THC處理的細胞視為對照組，并假設(shè)這些細胞是100%有活力的。以下公式用于計算未經(jīng)處理和經(jīng)THC處理的C6細胞的存活率[(THC處理的細胞吸光度-空白吸光度)∕(未處理細胞吸光度-空白吸光度)×100%]。根據(jù)MTT結(jié)果，通過相應(yīng)的圖譜確定25%(IC25)、50%(IC50)和75%(IC75)濃度的THC分別為25.0、50.0、75.0 μmol/L，0 μmol/L作為對照組用于后續(xù)分析。

1.2.2細胞裂解物制備和生化分析

將C6細胞(5×103)置于96孔板中孵育，并加入25、50、75 μmol/L濃度的THC處理黏性細胞24 h，用于生化分析。用磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 7.4)洗滌細胞，再使用胰蛋白酶將黏附的細胞與96孔板分離，然后置于離心管中4 ℃、1 000 g離心5 min。將沉淀在PBS中洗滌2次，然后將重懸于RIPA中的500 mL放射免疫沉淀測定中的沉淀與RIPA在4 ℃下在軌道振蕩器中溫育20 min。將沉淀物4 ℃、10 000 g離心20 min獲得細胞碎片。使用ELISA試劑盒測量經(jīng)IC25、IC50、IC75濃度的THC處理的細胞裂解物中的8-羥基-2′-脫氧鳥苷(8-OHdG)和總抗氧化劑(TAS)水平。

1.2.3ROS 生成量檢測

使用DHE-ROS檢測試劑盒檢測經(jīng)25、50、75 μmol/L濃度的 THC孵育24 h的C6細胞中ROS生成量。在室溫條件下取10 μL經(jīng)THC處理和未經(jīng)THC處理的細胞懸液(2×106)，用移液管加入190 μL Muse?氧化應(yīng)激試劑工作溶液，充分混合，將混合物在37 ℃下孵育30 min，然后在Muse?Cell Analyzer中測量。

1.2.4Annexin V-FITC/PI染色和caspase-3/7測定

使用 Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒評估THC誘導的C6細胞凋亡。將C6細胞(2×106)接種于6孔板中生長，并將貼壁細胞與25、50、75 μmol/L濃度的THC一起溫育24 h。用胰蛋白酶分離細胞，用PBS進行洗滌。將細胞與5 μL Annexin V-FITC和1 μL碘化丙啶在 25 ℃下在黑暗中溫育15 min，用流式細胞術(shù)分析細胞凋亡情況。通過測量caspase-3/7的活化確定THC處理組和對照組細胞凋亡狀態(tài)。將細胞(2×106)與25.0、50.0、75.0 μmol/L 濃度的THC一起溫育24 h，用PBS洗滌胰蛋白酶消化細胞，并將5 μL Muse?caspase-3/7工作溶液加入50 μL的細胞。在37 °C下孵育30 min后將150 μL 7-AAD添加到細胞培養(yǎng)基中，充分混合并在Muse?cell Analyzer上進行測量。

1.2.5定量實時逆轉(zhuǎn)錄 PCR

通過定量實時逆轉(zhuǎn)錄-PCR分析未經(jīng)THC處理和經(jīng)THC處理24 h的C6細胞(2×106)中PPARγ mRNA的表達。在實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR 程序中根據(jù)說明用RNA分離試劑盒提取總RNA。純化后的RNA在無酶無菌水中洗滌后使用NanoDropTM2000/2000c以A260/A280比率確定其質(zhì)量和濃度。用 SuperScriptTMⅣ一步法實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR系統(tǒng)從總RNA中合成cDNA。PPARγ、β-肌動蛋白的引物：PPARγ正向引物5′-CCC TTT ACC ACG GTT GAT TTC TC-3′和反向引物 5′-GCA GGC TCT ACTTTG ATC GCA CT-3′；β-肌動蛋白正向引物 5′-GTG GGG CGC CCC AGG CAC CA-3′和反向引物 5′-CTT CCT TAA TGT CAC GCA CGA TTT C-3′。在StepOnePlusTM實時PCR系統(tǒng)及其軟件程序中使用SYBR Green預(yù)混液擴增cDNA。熱循環(huán)曲線：在95 ℃下進行10 min的預(yù)孵育步驟，然后在95 ℃下進行45個循環(huán)的變性步驟10 s，在55 ℃下進行1 min的退火步驟，并在72 ℃下進行10 s的延伸步驟。根據(jù)擴增后的循環(huán)數(shù)(Ct)值確定PPARγ、β-肌動蛋白轉(zhuǎn)錄水平。使用β-肌動蛋白mRNA水平作為內(nèi)標，并使用公式2-ΔΔCT確定相對表達水平。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結(jié) 果

2.1 THC對C6細胞活力的抑制作用

與對照組比較，12.5 μmol/L濃度THC處理24、48 h,以及25.0 μmol/L濃度THC處理24 h組C6細胞活力均明顯降低，12.5 μmol/L濃度THC孵育72 h組C6細胞較對照組減少22.7%，25.0 μmol/L濃度THC處理24、48、72 h組C6細胞較對照組分別減少23%、33%、40%，50.0 μmol/L濃度THC處理24、48、72 h組C6細胞較對照組分別減少48%、66%、78%，75 μmol/L濃度THC處理24、48、72 h組C6細胞較對照組分別減少70%、79%、89%，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；100.0 μmol/LTHC濃度未檢測到任何細胞。見圖1。

a：P<0.05，與對照組比較。

2.2 THC調(diào)節(jié)C6細胞中8-OhdG、TAS水平

與對照組比較，25.0、50.0、75.0 μmol/L濃度THC處理24 h組C6細胞8-OHdG水平均明顯升高，TAS水平均明顯降低，75.0 μmol/L濃度THC處理24 h組C6細胞8-OHdG水平最高，TAS水平最低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2。

A：8-OHdG；B：TAS;a：P<0.05，與對照組比較。

2.3 THC誘導的C6細胞氧化應(yīng)激

與對照組比較，25.0、50.0、75.0 μmol/L濃度THC處理24 h組C6細胞ROS生成量均明顯升高，75.0 μmol/L濃度THC處理24 h組C6細胞ROS生成量最高(約為57%)，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖3。

A：流程數(shù)據(jù)圖；B：ROS；a：P<0.05，與對照組比較。

2.4 THC觸發(fā)C6細胞凋亡

與對照組比較，25.0、50.0、75.0 μmol/L濃度THC處理C6細胞凋亡率均明顯增高，75.0 μmol/L濃度THC處理C6細胞凋亡率最高，caspase-3/7活性明顯增強，75.0 μmol/L濃度THC處理C6細胞 caspase-3/7 活性最高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖4。

A：AnnexinV-FITC凋亡分析；B：caspase-3/7活性；a：P<0.05，與對照組比較。

2.5 THC對C6細胞NF-κB、PPARγ mRNA水平的影響

與對照組比較，25.0 μmol/L 濃度THC處理C6 細胞NF-κB mRNA水平略下降，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；50.0、75.0 μmol/L濃度THC處理C6 細胞NF-κB mRNA水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與對照組比較，25.0、50.0、75.0 μmol/L濃度THC處理C6細胞PPARγ mRNA水平均明顯增加，75.0 μmol/L濃度THC處理C6細胞PPAR mRNA水平最高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖5。

A：NF-κB mRNA；B：PPARγ mRNA；a：P<0.05，與對照組比較。

3 討 論

本研究探討了不同持續(xù)時間(24、48、72 h)和濃度THC處理是否可通過觸發(fā)各種生化機制在C6膠質(zhì)瘤細胞中引起抗腫瘤作用，確定了C6細胞的IC25、IC50和IC75，結(jié)果顯示，THC可調(diào)節(jié)C6細胞中8-OhdG、TAS水平，8-OHdG水平上調(diào)和TAS水平下降在THC處理C6細胞中呈濃度依賴性，THC濃度越大C6細胞中8-OHdG水平越高，TAS水平越低；并且可誘導C6細胞氧化應(yīng)激，經(jīng)THC處理C6細胞中ROS積累顯示出濃度依賴性，THC濃度越大C6細胞中ROS生成量越高。通過PPARγ/NF-κB信號通路分析了氧化、凋亡和DNA損傷機制，結(jié)果顯示，THC處理24 h后活細胞比率降低。凋亡細胞比例及caspase-3/7活性存在THC濃度依賴性，THC濃度越大細胞凋亡率越高，細胞caspase-3/7活性越強，并且THC濃度的增加引起C6細胞PPARγ mRNA表達增加和NF-κB抑制?？梢奣HC處理上調(diào)了C6細胞PPARγ mRNA水平并降低了NF-κB mRNA水平，提示PPARγ、NF-κB通過誘導氧化和凋亡機制誘導DNA損傷。

ROS可引起細胞大分子生物分子(DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì))的氧化[12]。腫瘤細胞的高增殖導致ROS產(chǎn)生增加和異常的氧化還原穩(wěn)態(tài)[13]。通過增強抗氧化防御機制優(yōu)化氧化負荷，從而阻止ROS誘導的生物分子的氧化和誘導細胞凋亡[14]。腫瘤細胞的抗氧化能力阻礙了過量的ROS產(chǎn)生，從而抵抗細胞凋亡[15]。同樣C6膠質(zhì)瘤細胞中PPAR激動劑治療未能改變過氧化氫酶的表達和酶活性[16]。因DNA螺旋中的核堿基與ROS相互作用而形成的8-OHdG是最豐富的DNA損傷和潛在的生物標志物[17]。本研究結(jié)果顯示，在THC處理C6細胞中ROS產(chǎn)生和DNA損傷以劑量依賴性方式增加，而細胞增殖受到抑制。C6細胞中THC誘導的ROS產(chǎn)生與TAS水平的降低呈比例。此外，本研究結(jié)果顯示，細胞ROS水平的增加導致DNA損傷，增加8-OHdG水平。ALMAMUN等[18]研究也表明，THC治療通過誘導紅細胞中的氧化應(yīng)激增加ROS的產(chǎn)生。

caspase通過外在和內(nèi)在的促凋亡信號機制啟動程序性細胞死亡，對凋亡程序的啟動至關(guān)重要[19]。協(xié)調(diào)細胞凋亡破壞階段的caspase-3/7的激活是細胞凋亡的一個特征[20]。PPARγ激動劑可通過多種信號通路誘導膠質(zhì)瘤細胞凋亡激活PPARγ，如增加腫瘤細胞系中促凋亡蛋白的表達或通過改變線粒體膜電位導致細胞色素C釋放至細胞質(zhì)中[21]。據(jù)文獻報道，PPARγ的活化降低了抗凋亡蛋白的表達，并增加了A375細胞系中凋亡蛋白的表達[22]。另有研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)THC處理的A549細胞抗凋亡蛋白和腫瘤抑制基因表達降低，而caspase-3/7活性增加；THC及其衍生物已被證明通過caspase-3、caspase-9激活途徑誘導C6、U-87 MG膠質(zhì)瘤細胞凋亡[23-25]。

NF-κB是適應(yīng)性免疫反應(yīng)的主要調(diào)節(jié)因子，通過抑制細胞凋亡和促進細胞增殖誘導遷移和侵襲，特別是在癌細胞中具有結(jié)構(gòu)活性的NF-κB上調(diào)氧化應(yīng)激和DNA損傷，以及壞死性細胞死亡[26]。據(jù)文獻報道，PPARγ與NF-κB的物理相互作用通過降低NF-κB對炎癥啟動子的結(jié)合親和力抑制NF-κB信號通路[27]。有研究表明，MCF-7乳腺癌細胞中二十二碳六烯酸處理通過PPARγ mRNA表達的增加引起NF-κB抑制[28]。另有研究表明，C6膠質(zhì)瘤細胞中NF-κB的失活或抑制通過下調(diào)抗凋亡蛋白及上調(diào)凋亡蛋白引發(fā)細胞凋亡，從而激活caspase級聯(lián)反應(yīng)[29-30]。THC具有介導PPARγ抑制炎癥、血管生成和轉(zhuǎn)移的潛力[25]。本研究對PPARγ、NF-κB測定的結(jié)果顯示，THC處理C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞通過增強PPARγ的表達和活化使NF-κB蛋白水平降低，觸發(fā)C6細胞凋亡。這些結(jié)果可能有望用于解決治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤的藥物抗性問題。

綜上所述，作為 PPARγ激動劑的THC在C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞中顯示出濃度和時間依賴性抗腫瘤作用，通過引起細胞PPARγ mRNA水平的增加引起NF-κB抑制，從而誘導DNA損傷和細胞凋亡；此外，在THC處理的細胞中觀察到8-OHdG水平的增加和TAS水平的降低。本研究通過PPARγ/NF-κB信號通路在膠質(zhì)瘤細胞中證實了THC的促細胞凋亡作用。但尚需在動物體內(nèi)模型進行研究和驗證，也是后續(xù)將要關(guān)注的重點。本研究結(jié)果為將THC開發(fā)為治療神經(jīng)膠質(zhì)細胞瘤的新藥提供了參考依據(jù)。