金黃色葡萄球菌腸毒素B對動物免疫的影響及其作用機(jī)制

葉蘭，張海波＊，黎力之，郭冬生，金恒，關(guān)瑋琨*

（1.宜春學(xué)院生命科學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院，江西 宜春 336000；2.贛州市畜牧業(yè)發(fā)展和動物疫病防控中心）

葡萄球菌屬革蘭氏陽性菌，廣泛分布于自然界中，僅少數(shù)具有致病性，其中金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，SA）致病力最強(qiáng)，可分泌超過33種金黃色葡萄球菌腸毒素（staphylococcal enterotoxins，SE），如SEA、SEB、SEC、SED、SEE、SEI及類腸毒素G等[1]。SEB毒性和穩(wěn)定性最強(qiáng)，且不被胰蛋白酶降解，影響機(jī)體免疫調(diào)節(jié)[2]。在SEB刺激下，動物免疫細(xì)胞內(nèi)的髓樣分化因子88（myeloid differenttiation factor 88，MyD88）、蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）發(fā)生磷酸化，從而激活I(lǐng)κB激酶（inhibit kappa B kinase，IKK），使核因子-κB（nuclear factor-kappa，NF-κB）獲得活性并靶向細(xì)胞核，介導(dǎo)白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-1、IL-2、IL-6、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）和干擾素γ（interferon gamma，IFN-γ）等炎性細(xì)胞因子的分泌，引發(fā)機(jī)體炎癥反應(yīng)[3～4]。另外，SEB可激活免疫細(xì)胞內(nèi)絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinases，MAPKs）介導(dǎo)的信號級聯(lián)反應(yīng)，通過p38 MAPK、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）以及細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）途徑誘發(fā)細(xì)胞核內(nèi)活化T細(xì)胞核因子（nuclearfactor of activating T cells，NFAT）和活化蛋白-1（activator protein 1，AP-1）的表達(dá)，調(diào)控免疫細(xì)胞的增殖、分化以及凋亡等反應(yīng)[5]。因此，本文重點闡述SEB對動物免疫系統(tǒng)的影響，并就其作用機(jī)制進(jìn)行綜述，以期在調(diào)控動物免疫功能方面提供理論參考。

1 SEB概述

SEB為單鏈多肽，分子量約28.5 ku，由239個氨基酸殘基構(gòu)成，兩個結(jié)構(gòu)域組成其三級結(jié)構(gòu)，分別為N端1～120位殘基并包含3個α螺旋和2個β片層的結(jié)構(gòu)域，C端127～239位殘基并包含2個α螺旋、2個短β折疊以及2個β片層的結(jié)構(gòu)域[6～7]。這種特殊結(jié)構(gòu)決定了SEB的熱穩(wěn)性以及耐酸性。研究發(fā)現(xiàn)，SEB無論是在100℃條件下煮沸30 min，還是在酸性條件下仍具活性，且可抵抗胃腸道中蛋白酶的水解作用[8]。在動物體中，SEB無需抗原遞呈細(xì)胞（antigen presenting cells，APC）處理，SEBN端結(jié)構(gòu)域的第43～45位、第67位、第89位和第115位殘基通過氫鍵、電荷間及疏水層間相互作用等方式可與APC表面的（major histocompatibility complex，MHC）II類分子非限制性結(jié)合；同時，SEB中第20、22、23、177和210位殘基組成的較大結(jié)構(gòu)域，以及第60、90和91位殘基組成的較小結(jié)構(gòu)域，兩者可直接與T細(xì)胞受體（T cell receptor，TCR）Vβ鏈結(jié)合形成MHC II-SEB-TCR復(fù)合體結(jié)構(gòu)[9]。這種特殊的結(jié)合方式使其具有超抗原的功能，少量SEB即可激活大量T細(xì)胞，分泌IFN-γ和TNF-α等炎性細(xì)胞因子[10]。

2 SEB對免疫的調(diào)節(jié)作用

SEB屬超抗原家族，動物感染后可誘發(fā)T細(xì)胞大量增殖，以及IL-1、IL-2、IL-6、TNF-α和IFN-γ等細(xì)胞因子分泌，造成皮炎和器官損傷等多種炎癥疾病。Larcombe等研究發(fā)現(xiàn)[11]，感染SA小鼠與對照組相比，小鼠近端小腸損傷程度顯著高于對照組。由此可知SEB在SA感染導(dǎo)致的腸道損傷中發(fā)揮重要作用。小鼠尾靜脈注射2×108CFUs SA 12 h后，脾臟中炎性細(xì)胞因子IL-10、TNF-α和IFN-γ水平增加5倍，血清中IL-10、TNF-α和IFN-γ含量亦高于對照組但差異不顯著；監(jiān)測感染8 d后發(fā)現(xiàn)感染SA小鼠全部死亡，表明SEB通過激活免疫細(xì)胞而誘發(fā)大量炎性細(xì)胞因子的分泌，加重機(jī)體損傷致死[12]。Jorde等發(fā)現(xiàn)[13]，過敏原卵清蛋白（ovalbumin，Ova）致敏誘導(dǎo)小鼠氣道炎癥后，分別用50 ng SEB和500 ng SEB處理小鼠，顯著調(diào)節(jié)呼吸道免疫細(xì)胞的積累，增強(qiáng)淋巴細(xì)胞的活化，且在500 ng SEB劑量下，IFN-γ、IL-6和TNF-α水平顯著提高，加重氣道炎癥并導(dǎo)致氣道高反應(yīng)性。

SEB亦可使動物免疫細(xì)胞對抗原刺激表現(xiàn)出無反應(yīng)性，從而誘導(dǎo)免疫耐受，影響機(jī)體正常的免疫應(yīng)答。研究顯示，經(jīng)500 ng SEB處理后的小鼠再用Ova致敏，呼吸道中免疫細(xì)胞數(shù)目顯著減少，且促炎因子水平顯著降低[13]。將T細(xì)胞與SEB活化產(chǎn)生的效應(yīng)T細(xì)胞分別加入刀豆蛋白、脂多糖和IL-2等刺激原共同培養(yǎng)3d，結(jié)果顯示，T細(xì)胞對刺激原的應(yīng)答反應(yīng)顯著抑制，增殖能力顯著降低[14]。將可識別Ova的TM細(xì)胞、APC以及SEB共同培養(yǎng)，14 h后用帶有Ova的APC再次刺激，TM細(xì)胞呈現(xiàn)明顯的無反應(yīng)性[15]?？梢姡琒EB不僅影響正常淋巴細(xì)胞對抗原的反應(yīng)，還抑制TM對抗原再刺激的應(yīng)答，使機(jī)體發(fā)生免疫耐受反應(yīng)，導(dǎo)致動物免疫系統(tǒng)紊亂。

此外，白藜蘆醇、小檗堿和兒茶素等外源物質(zhì)可調(diào)控SEB造成的組織器官損傷，保護(hù)機(jī)體。研究顯示，小鼠鼻內(nèi)和腹腔分別用2 g和5 g SEB處理后，肺部血管滲漏，血清中IL-2、IL-6、TNF-α和IFN-γ均顯著增加，且小鼠全部死亡；但在SEB處理前均灌胃白藜蘆醇，小鼠可存活10 d天以上且無明顯臨床癥狀，肺部血管滲漏現(xiàn)象顯著減少，肺結(jié)構(gòu)正常，同時炎性細(xì)胞因子水平降低，顯著改善SEB介導(dǎo)的肺損傷[16]。Jiying等發(fā)現(xiàn)[17]，小鼠腹膜內(nèi)注射SEB顯著提高血清IL-2、IL-6、TNF-α和IFN-γ水平，引起急性肝損傷，而小檗堿處理后顯著降低SEB所誘導(dǎo)的炎性細(xì)胞因子水平，減輕肝臟炎癥。SEB可引起D-氨基半乳糖鹽酸鹽（D-galactosamine，D-Gal）致敏小鼠的致死性休克，而研究發(fā)現(xiàn)，腹腔注射茶兒酚提取物后可抑制5 g SEB導(dǎo)致的100%致死；小鼠注射5 g SEB、50 g茶兒酚提取物以及D-Gal的混合物，其血液TNF-α、IFN-γ和IL-4水平顯著低于對照組[18]。綜上所述，在SEB刺激下，動物免疫細(xì)胞內(nèi)促炎信號得以激活，促使大量炎性細(xì)胞因子分泌，誘發(fā)組織器官損傷，同時通過誘導(dǎo)免疫耐受，破壞機(jī)體免疫系統(tǒng)的正?；顒樱恍┩庠次镔|(zhì)可減弱SEB引起的組織器官損傷，對動物機(jī)體起保護(hù)作用。

3 SEB調(diào)節(jié)機(jī)體免疫的作用機(jī)制

3.1 SEB對動物NF-κB通路的影響

NF-κB是細(xì)胞內(nèi)重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，激活后可進(jìn)入細(xì)胞核靶向炎性細(xì)胞因子基因啟動子區(qū)，誘發(fā)產(chǎn)生IL-1、IL-6、IL-12和TNF-α等炎性細(xì)胞因子[19]。SEB可刺激多種免疫細(xì)胞，激活NF-κB，分泌大量炎性細(xì)胞因子，誘發(fā)機(jī)體組織損傷[5]。MyD88是NF-κB信號傳導(dǎo)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子之一，參與細(xì)胞內(nèi)IL-1受體（interleukin 1 reptor，IL-1R）、Toll樣受體及MHC II類分子等信號傳遞[20]。首先，SEB可與APCs上的MHC II類分子結(jié)合，提高M(jìn)yD88水平，增加IL-1R I型的表達(dá)，激活下游信號組分NF-κB，促進(jìn)炎性細(xì)胞因子釋放[21]。研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)抗MHC II類分子抗體處理后的單核細(xì)胞，對200 ng/mL SEB刺激無反應(yīng)，其細(xì)胞內(nèi)的MyD88水平和TNF-α基因的表達(dá)顯著降低；利用200 ng/ml SEB刺激正常單核細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，細(xì)胞內(nèi)MyD88、IL-1R相關(guān)蛋白激酶4（interleukin 1 receptor-associated kinase4，IRAK4）及TNF受體相關(guān)因子6（TNF receptor-associated Factor6，TRAF6）蛋白含量均顯著上調(diào)，NF-κBp50亞基和p65亞基含量增加50%和75%，炎性細(xì)胞因子IL-1和TNF-α水平顯著提高[4]。將compound 4210（抑制MyD88介導(dǎo)激活NF-κB）與小鼠脾細(xì)胞共同培養(yǎng)，經(jīng)0.1 mg/mL SEB刺激產(chǎn)生的促炎因子顯著降低[22]。因此，SEB結(jié)合MHC II類分子后，可激活MyD88，誘發(fā)MyD88/IRAK/NF-κB通路信號傳導(dǎo)，分泌炎性細(xì)胞因子。其次，SEB-MHC II通過形成MHC II-SEB-TCR復(fù)合物，使APC細(xì)胞膜上的共刺激分子與T細(xì)胞表面共刺激受體結(jié)合，聯(lián)合誘導(dǎo)下游信號級聯(lián)反應(yīng)，不僅激活磷脂酶Cγ，使質(zhì)膜上磷酰肌醇水解生成（diacylglycerol，DAG），進(jìn)而磷酸化PKC；也可激活（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）并募集多種磷脂肌醇至質(zhì)膜，從而活化磷脂肌醇依賴性激酶1，使PKC和蛋白激酶B磷酸化[3]。PKC隨后激活I(lǐng)KK，使IκB磷酸化并降解，釋放NF-κB以進(jìn)入細(xì)胞核結(jié)合靶基因，促進(jìn)炎性細(xì)胞因子IL-1、IL-6及TNF-α的分泌[5]。研究發(fā)現(xiàn)，單核細(xì)胞與淋巴細(xì)胞加入PKC抑制劑混合培養(yǎng)后，用100 ng/mL SEB刺激，與對照組相比TNF-α水平顯著降低；加入DAG激酶抑制劑（阻斷DAG降解途徑以提高細(xì)胞內(nèi)DAG水平）混合培養(yǎng)，用10 ng/mL SEB刺激后，與對照組相比TNF-α水平提高30%[23]?？梢?，在SEB調(diào)控的PKC/NF-κB信號傳導(dǎo)通路中，SEB通過激活DAG和PI3K兩個信號途徑活化PKC，進(jìn)而促進(jìn)NF-κB釋放并進(jìn)入細(xì)胞核調(diào)節(jié)炎性細(xì)胞因子的合成與分泌。

此外，SEB刺激產(chǎn)生的炎性細(xì)胞因子IL-1β（IL-1的一種）可與多種細(xì)胞的膜上受體IL-1RI結(jié)合誘發(fā)MyD88/NF-κB介導(dǎo)的促炎信號，從而使炎癥持續(xù)存在[21]。IL-1β與IL-1RI結(jié)合，將MyD88募集至質(zhì)膜并磷酸化，誘發(fā)下游信號級聯(lián)反應(yīng)，其中下游信號組分IRAK1激活TRAF6，活化NF-κB誘導(dǎo)激酶，使IKK磷酸化，激活NF-κB上調(diào)炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，加重機(jī)體炎癥反應(yīng)[24]。綜上所述，SEB通過上調(diào)APCs中MyD88的表達(dá)，以及激活T細(xì)胞內(nèi)DAG和PI3K信號傳導(dǎo)使PKC磷酸化，促進(jìn)NF-κB的活化，分泌炎性細(xì)胞因子IL-1、IL-6、IL-12和TNF-α，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)。由SEB刺激所產(chǎn)生的IL-1β還可與其受體結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)NF-κB介導(dǎo)的促炎信號，加重動物的炎癥反應(yīng)。

3.2 SEB對動物MAPKs通路的影響

MAPKs是蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶，由促絲裂原活化蛋白激酶激活，可將細(xì)胞外信號通過p38 MAPK、JNK或ERK等途徑轉(zhuǎn)化為細(xì)胞反應(yīng)，如細(xì)胞增殖、分化、凋亡及分泌炎性細(xì)胞因子等[25]。用2 g/mL SEB處理巨噬細(xì)胞30 min，對細(xì)胞裂解物分析發(fā)現(xiàn)，p38 MAPK磷酸化水平顯著提高，而不同劑量p38 MAPK抑制劑與巨噬細(xì)胞共同培養(yǎng)后，在2 g/mLSEB刺激下，p38 MAPK的磷酸化呈現(xiàn)不同程度的抑制[26]。小鼠靜脈注射50 g SEB，取脾臟和淋巴結(jié)T細(xì)胞分析，結(jié)果顯示c-Jun磷酸化水平顯著提高，激活JNK通路[27]。0.1 g/mL SEB處理T細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，ERK活性增加16.8倍，顯著誘導(dǎo)ERK激活[28]。由此表明，SEB可激活免疫細(xì)胞MAPKs，介導(dǎo)信號級聯(lián)反應(yīng)。隨后p38 MAPK、JNK和ERK進(jìn)一步激活NFAT和AP-1，調(diào)控T細(xì)胞的增殖、分化、凋亡及炎性細(xì)胞因子分泌[5]。利用100 ng/mLSEB處理單核細(xì)胞5 min后發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)p38 MAPK和JNK磷酸化水平提高至正常水平的2.25倍和5倍[27]。研究發(fā)現(xiàn)，用15 g/kg SEB氣溶膠和MK591（MAPK級聯(lián)反應(yīng)抑制劑）處理猴子，與對照組相比，血液T細(xì)胞增殖水平和TNF-α分泌量分別下降55%和62%[29]。用0.1 g/mLSEB分別刺激p38 MAPK途徑和ERK途徑被抑制的T細(xì)胞，結(jié)果顯示，兩種T細(xì)胞的TNF-α分泌量均減少，可見SEB激活p38 MAPK途徑與ERK途徑后，可有效誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子TNF-α分泌[28]。上述研究表明SEB誘導(dǎo)激活免疫細(xì)胞內(nèi)MAPKs介導(dǎo)的信號級聯(lián)反應(yīng)，經(jīng)p38 MAPK、JNK和ERK進(jìn)一步激活NFAT和AP-1，調(diào)控機(jī)體免疫功能。

此外，SEB激活單核細(xì)胞、T細(xì)胞以及B細(xì)胞內(nèi)MyD88介導(dǎo)的促炎信號后，通過活化IRAK4和TRAF6亦可激活MAPKs，誘發(fā)下游信號級聯(lián)反應(yīng)[21]。Gohda等研究發(fā)現(xiàn)[30]，缺乏TRAF6的小鼠巨噬細(xì)胞在依賴于MyD88信號傳導(dǎo)的外源刺激下，MAPK磷酸化水平顯著抑制，因此MAPK的活化可依賴于MyD88激活后TRAF6的磷酸化。但SEB激活免疫細(xì)胞內(nèi)MyD88途徑及下游信號級聯(lián)反應(yīng)（IRAK4和TRAF6），進(jìn)而影響MAPKs的研究還較少，有待深入探究。綜上可知，SEB直接或間接激活免疫細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)MAPKs信號級聯(lián)反應(yīng)，再通過p38 MAPK、JNK和ERK途徑調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化、凋亡及炎性細(xì)胞因子分泌，進(jìn)而影響動物免疫系統(tǒng)。

4 展望

SEB主要通過激活NF-κB促炎信號通路和MAPKs信號級聯(lián)反應(yīng)影響動物的免疫系統(tǒng)：（1）SEB不僅與APCs上MHC II類分子結(jié)合，激活A(yù)PCs內(nèi)MyD88，還與TCR結(jié)合形成MHCⅡ-SEB-TCR復(fù)合體，激活T細(xì)胞內(nèi)PKC，從而活化NF-κB并使其靶向細(xì)胞核，合成與分泌大量炎性細(xì)胞因子，引發(fā)動物機(jī)體損傷；（2）SEB亦可激活免疫細(xì)胞MAPKs信號級聯(lián)反應(yīng)，活化NFAT和AP-1，介導(dǎo)T細(xì)胞的增殖、分化與凋亡等，調(diào)控機(jī)體免疫功能。SEB還有諸多問題需要解決：SEB活化免疫細(xì)胞，除影響NF-κB和MAPKs外，還需深入探究其對機(jī)體其他信號通路的影響，如SEB對MAPKs信號級聯(lián)反應(yīng)下游NFAT和AP-1作用尚不明晰；SEB的現(xiàn)有研究主要集中于模式動物（小鼠、大鼠），對其他動物（家畜、家禽和水產(chǎn)動物等）的相關(guān)研究還需不斷深入。