雞白痢沙門菌感染雛雞的骨髓miRNA表達(dá)譜分析

尹 磊，潘孝成*，沈?qū)W懷，張丹俊，戴 銀，王潔茹

(1.安徽省農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所 安徽省畜禽疫病研究中心，合肥 230031;2.畜禽產(chǎn)品安全工程安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，合肥 230031)

雞白痢沙門菌(S. Pullorum)是禽類的重要病原體，對(duì)家禽業(yè)構(gòu)成嚴(yán)重威脅。雞白痢沙門菌可利用大囊泡(Salmonellacontaining vacuole, SCV)有效逃避宿主免疫系統(tǒng)，使宿主長(zhǎng)期保持持續(xù)或隱性感染，造成機(jī)體持續(xù)帶菌且細(xì)菌長(zhǎng)期定植于脾巨噬細(xì)胞或生殖道內(nèi)，通過血液循環(huán)進(jìn)入全身各組織器官，進(jìn)而導(dǎo)致免疫抑制和免疫系統(tǒng)損害，引起嚴(yán)重的系統(tǒng)性疾病。相較于其他種屬沙門菌，雞白痢沙門菌具有高度的宿主特異性，雞最為易感，其次是火雞。它能引起雛雞白痢并引發(fā)急性敗血癥，造成較高的發(fā)病率和死亡率[1]。盡管S. Pullorum病在發(fā)達(dá)國(guó)家的商業(yè)雞群中已得到了很好的控制，但在發(fā)展中國(guó)家，包括中國(guó)，仍然是一個(gè)主要問題[2]。因此，更全面地了解雞對(duì)S. Pullorum的反應(yīng)將有助于改進(jìn)防控策略，并為有效控制和預(yù)防S.Pullorum病提供新的理論基礎(chǔ)。

骨髓是家禽中最重要的器官之一[3]，它在抵抗和抑制細(xì)菌及病毒等各種病原體中發(fā)揮著重要作用。骨髓不僅是多能造血干細(xì)胞的重要來(lái)源，而且也是兩大類白細(xì)胞，即淋巴系和骨髓系的儲(chǔ)備庫(kù)。其中，淋巴系分化為B細(xì)胞、T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞，而骨髓系則發(fā)展為巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞(DCs)。所有這些細(xì)胞在先天性和適應(yīng)性免疫反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[4-5]。目前，通過組學(xué)技術(shù)對(duì)免疫器官或免疫細(xì)胞在感染期間進(jìn)行基因差異表達(dá)分析，有助于理解S. Pullorum致病機(jī)制和免疫調(diào)控水平。

微小核糖核酸(miRNA)是一類20至23個(gè)核苷酸的非編碼小RNA，作為生物過程的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)器，在調(diào)控發(fā)育、分化、器官形成、生長(zhǎng)控制和細(xì)胞凋亡等生命活動(dòng)中發(fā)揮重要作用[6]。研究表明，miRNA在微生物感染宿主過程中發(fā)揮著重要作用，如禽致病性大腸桿菌感染雞后，脾miRNA的表達(dá)失調(diào)與免疫細(xì)胞的發(fā)育分化及炎癥反應(yīng)密切相關(guān)[7]。骨髓提供的原始細(xì)胞，即兩大類白細(xì)胞，不受淋巴器官中存在的發(fā)育細(xì)胞因子和其他因素的影響[8]，因此，骨髓可以用來(lái)識(shí)別感染S. Pullorum的新的候選調(diào)控分子和網(wǎng)絡(luò)。本研究對(duì)感染和未感染雞骨髓中不同的miRNA表達(dá)進(jìn)行分析，以確定骨髓對(duì)S. Pullorum感染的免疫反應(yīng)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與樣品采集

無(wú)特異性病原體(SPF)的來(lái)航雞的胚胎蛋購(gòu)自北京梅里亞實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。SPF雞在封閉環(huán)境中孵化，并在負(fù)壓隔離器中飼養(yǎng)，以保證動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中無(wú)沙門菌。在7日齡時(shí)，30只SPF雞口服1 mL 108cfu的S. Pullorum (CVCC 2216)作為感染組，另外15只雞口服1 mL PBS作為對(duì)照組，感染組與對(duì)照組分別單獨(dú)隔離飼養(yǎng)。在感染后24 h內(nèi)，對(duì)雞靜脈注射巴比妥鈉安樂死。用解剖刀去除雞腿骨上的結(jié)締組織,然后用刀將骨剖開，用刮刀將其中的骨髓取出，最后用1.05 mm的尼龍網(wǎng)過濾，得到純骨髓，快速冷凍并保存在-80 ℃。

1.2 總RNA提取及樣品準(zhǔn)備

使用TRIzol試劑(Invitrogen)和Polyacryl Carrier(MRC)從樣品中提取總RNA。在1%瓊脂糖凝膠上監(jiān)測(cè)RNA的降解和污染情況。使用NanoPhotometer分光光度計(jì)(IMPLEN)、Aglient Bioanalyzer 2100系統(tǒng)的RNA Nano 6000檢測(cè)試劑盒(Aligent Technologies)和Qubit 2.0 Flurometer的Qubit RNA檢測(cè)試劑盒(Life Technologies)測(cè)量RNA純度、完整性和濃度。只有吸光度(260/280 nm)之比>1.8和RNA完整性編號(hào)(RINs)>7的RNA樣品被用于RNA分析。

1.3 miRNA測(cè)序及生物學(xué)功能分析

由Oebiotech公司(中國(guó)上海，http://www.oebiotech.com)對(duì)樣品進(jìn)行microRNA分析。提取的RNA被標(biāo)記并雜交到Agilent-070154 RatmiRNA Microarray V21.0 8×15K(Agilent)。采用Genespring軟件(13.1版，Agilent Technologies)對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，并識(shí)別差異表達(dá)的miRNAs(DEmiRNAs)。上調(diào)或下調(diào)的基因的閾值是倍數(shù)變化≥2和P≤0.05。通過檢查兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)(Targetscan和microRNAorg)的重疊交集來(lái)選擇DEmiRNAs的目標(biāo)基因。使用基因本體論(GO)和京都基因和基因組百科全書(KEGG)對(duì)推測(cè)的基因進(jìn)行了功能和途徑富集分析。GO和KEGG分析的意義閾值被定義為P≤0.05。miRNA和靶基因之間的潛在調(diào)節(jié)關(guān)系使用Cytoscape軟件(http://www.cytoscape.org/)進(jìn)行分析[9]。

1.4 qRT-PCR分析miRNAs

使用ABI Step One熱循環(huán)儀(Applied Biosystems, CA, USA)和miRcute miRNA qPCR SYBR Green檢測(cè)試劑盒(Vazyme, Nanjing, China)進(jìn)行qRT-PCR。本研究使用的miRNA特異性正向引物見表1。U6 snRNA被用來(lái)作為內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)。每個(gè)基因都使用了3個(gè)獨(dú)立的生物重復(fù)。每個(gè)miRNA的相對(duì)表達(dá)水平通過2-ΔΔct方法計(jì)算[10]。

表1 本研究所用引物序列

2 結(jié) 果

2.1 骨髓中差異表達(dá)的miRNA分析

對(duì)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)通過P值≤0.05和差異倍數(shù)變化≥2的閾值進(jìn)行過濾。根據(jù)這些標(biāo)準(zhǔn)，在雞白痢沙門菌感染后的骨髓中，與對(duì)照組相比，發(fā)現(xiàn)了20個(gè)差異表達(dá)的已知miRNAs。其中11個(gè)上調(diào)，9個(gè)下調(diào)，通過對(duì)樣本進(jìn)行差異化處理的聚類熱圖，結(jié)果如圖1所示。

圖1 差異表達(dá)miRNAs聚類熱圖Fig.1 Heat map of differentially expressed miRNAs clustering

2.2 通過qRT-PCR驗(yàn)證miRNAs

為了驗(yàn)證miRNA測(cè)序結(jié)果的可靠性，隨機(jī)選取6個(gè)關(guān)鍵差異顯著的miRNAs進(jìn)行驗(yàn)證，以U6作為內(nèi)參基因，根據(jù)NCBI中的基因序列設(shè)計(jì)引物，通過qRT-PCR檢測(cè)，結(jié)果如圖2所示，與未感染組相比，3個(gè)miRNAs(gga-miR-6643-5p、gga-miR-1466和gga-miR-2954)表達(dá)上調(diào)，3個(gè)miRNAs(gga-miR-762、gga-miR-6690-5p和gga-miR-1647)表達(dá)下調(diào)，測(cè)序結(jié)果與qRT-PCR趨勢(shì)一致，表明轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)可信。

2.3 miRNA靶基因分析

利用miRanda算法預(yù)測(cè)差異表達(dá)miRNAs的潛在靶基因，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析。通過差異表達(dá)miRNAs預(yù)測(cè)靶基因并進(jìn)行GO功能注釋和富集分析，確定miRNA靶基因的功能。從圖3可以看出，預(yù)測(cè)的靶基因主要注釋到膜運(yùn)輸、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫系統(tǒng)、碳水化合物代謝、糖類的生物合成和代謝等等分子功能上(圖3)。KEGG信號(hào)通路分析發(fā)現(xiàn)，差異表達(dá)miRNA的靶基因主要富集于Notch信號(hào)通路、Hedgehog信號(hào)通路、PPAR信號(hào)通路、AMPK信號(hào)通路、Hippo信號(hào)通路等信號(hào)通路(圖4)。

2.4 與免疫相關(guān)的miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)互作分析

利用Cytoscape軟件構(gòu)建與免疫過程相關(guān)的miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)互作圖。圖5結(jié)果顯示，有11個(gè)與免疫相關(guān)的差異表達(dá)的miRNAs，結(jié)合miRNAs與mRNA的連接性及所擁有的mRNA靶基因數(shù)量，發(fā)現(xiàn)gga-miR-1466和gga-miR-6643-5p可能是參與免疫過程相關(guān)的關(guān)鍵miRNA。

圖2 qRT-PCR結(jié)果與miRNA測(cè)序結(jié)果的比較Fig.2 Comparison of the qRT-PCR results with the miRNA sequencing results

圖3 差異表達(dá)miRNA靶基因GO分析Fig.3 GO analysis of differentially expressed miRNA target genes

圖5 miRNA-mRNA互作網(wǎng)絡(luò)圖Fig.5 miRNA-mRNA interactions network map

3 討 論

先天免疫是抵御病原體入侵的第一道防線，當(dāng)病原體相關(guān)分子模式(PAMPs)被模式識(shí)別受體(PRRs)識(shí)別時(shí)就會(huì)被激活[11]。骨髓作為未成熟免疫細(xì)胞的儲(chǔ)存庫(kù)，它在抵抗病原菌感染過程中發(fā)揮著重要作用。雞白痢沙門菌作為一種重要的宿主特異性致病菌，只在雞中引起疾病。目前，關(guān)于骨髓細(xì)胞在應(yīng)對(duì)雞白痢沙門菌感染過程中的作用及機(jī)制未見報(bào)道。因此，本研究利用miRNA-seq技術(shù)獲得了感染S. Pullorum與未感染雞的骨髓轉(zhuǎn)錄表達(dá)譜測(cè)序數(shù)據(jù)。隨后，基于對(duì)骨髓中miRNA和潛在靶標(biāo)mRNA表達(dá)譜的聯(lián)合分析，目的是更好地了解宿主在抵抗S. Pullorum感染過程中的免疫機(jī)制。

miRNAs已被證明與病原體入侵和宿主抵抗力密切相關(guān)[12-13]。因此，有必要對(duì)雞感染S. Pullorum等病原體免疫反應(yīng)中的關(guān)鍵miRNAs進(jìn)行鑒定和定性，以了解發(fā)病機(jī)制，改善動(dòng)物福利，減少家禽生產(chǎn)中的損失，保證食品安全。本研究中miRNA表達(dá)譜數(shù)據(jù)顯示，共獲得20個(gè)已知的差異表達(dá)miRNAs，其中11個(gè)表達(dá)上調(diào)，9個(gè)表達(dá)下調(diào)，其中與免疫相關(guān)的差異表達(dá)miRNAs有11個(gè)，包括gaa-miR-762、gaa-miR-2954、gaa-miR-1647等。研究表明，gaa-miR-762的表達(dá)變化與免疫系統(tǒng)和炎性損傷密切相關(guān)，在病原體感染宿主過程中，LPS誘導(dǎo)的骨髓衍生巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)特定的miRNAs上調(diào)，這其中包括gaa-miR-762，進(jìn)而導(dǎo)致炎性炎癥細(xì)胞因子(IL-6、IL-12和TNF)的產(chǎn)生減少，但它們?cè)黾恿薎L-10的釋放[14-15]；Zhou等[16]通過注射地塞米松(Dex)建立了7日齡雞的免疫抑制模型，分析了雞胸腺中miRNA表達(dá)譜特征，發(fā)現(xiàn)gaa-miR-2954高度富集，通過影響Toll樣受體信號(hào)通路、Jak-STAT信號(hào)通路等免疫信號(hào)通路進(jìn)而影響雞的胸腺免疫功能；gaa-miR-1647參與禽巨噬細(xì)胞的表達(dá)分化，在應(yīng)對(duì)病原體時(shí)能夠成功激活相關(guān)通路從而發(fā)揮重要作用[17]?？傊?，本試驗(yàn)結(jié)果表明，這些差異表達(dá)的miRNAs可能參與了宿主骨髓細(xì)胞與S. Pullorum的相互作用，具體機(jī)制有待后續(xù)進(jìn)一步的研究。

通過預(yù)測(cè)miRNAs的靶點(diǎn)和注釋其生物功能，對(duì)預(yù)測(cè)miRNAs的功能和構(gòu)建調(diào)控網(wǎng)絡(luò)很有幫助。本研究中，11個(gè)與免疫有關(guān)的生物過程被顯著富集，同時(shí)，發(fā)現(xiàn)富集的基因主要集中在Notch信號(hào)通路、Hedgehog信號(hào)通路、PPAR信號(hào)通路、AMPK信號(hào)通路、Hippo信號(hào)通路上。Notch信號(hào)通路在控制淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用[18]；Hedgehog信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá)失調(diào)會(huì)導(dǎo)致巨噬細(xì)胞的組織特異性炎癥[19]；PPAR信號(hào)通路可以被Genipin激活，引導(dǎo)并維持巨噬細(xì)胞向M2亞型的極化，從而緩解炎癥反應(yīng)[20]；AMPK信號(hào)通路作為能量應(yīng)激和鈣誘導(dǎo)自噬的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，它的激活對(duì)宿主在炎癥反應(yīng)下的損傷有保護(hù)作用[21]；Hippo通路作為先天免疫中最原始的信號(hào)通路，其信號(hào)成分LATS2通過PQBP1-cGAS途徑增強(qiáng)先天免疫，從而抑制病原微生物的感染[22]。本試驗(yàn)結(jié)果突出了差異表達(dá)的miRNAs在宿主對(duì)S. Pullorum感染反應(yīng)中的潛在功能。

當(dāng)前，雞白痢沙門菌所造成的經(jīng)濟(jì)損失對(duì)中國(guó)養(yǎng)禽業(yè)仍是一個(gè)重大的挑戰(zhàn)，需要高效精準(zhǔn)的防控解決方案。miRNA在S. Pullorum感染致病過程中發(fā)揮著重要作用，從miRNA水平解析S. Pullorum的致病機(jī)制，有助于發(fā)現(xiàn)防控S. Pullorum的新途徑。本研究發(fā)現(xiàn)，gaa-miR-1647在S. Pullorum感染過程中顯著差異表達(dá)，gaa-miR-1647作為激活免疫細(xì)胞應(yīng)對(duì)病原感染的關(guān)鍵因子[17]，可以考慮利用gaa-miR-1647作為診斷雞白痢沙門菌感染的生物標(biāo)志物，有待后續(xù)進(jìn)一步的驗(yàn)證與研究。同時(shí)，miRNA靶向宿主基因作為新型治療靶標(biāo)的研究方向，通過將聚合物納米技術(shù)與miRNA調(diào)控技術(shù)相結(jié)合，開發(fā)出一種靶向聚合物納米顆粒[23]，將包裹著gaa-miR-762和gaa-miR-2954共同遞送到雞體內(nèi)，通過調(diào)節(jié)Toll樣受體信號(hào)通路、Jak-STAT信號(hào)通路和炎癥信號(hào)通路，實(shí)現(xiàn)對(duì)S. Pullorum的防控。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)通過miRNA測(cè)序來(lái)篩選和識(shí)別S. Pullorum感染雞骨髓的差異表達(dá)miRNAs，這些差異表達(dá)的miRNAs與免疫和炎癥反應(yīng)的信號(hào)通路有關(guān)，本研究為闡明S. Pullorum致病機(jī)制和病原與宿主的相互作用提供了基礎(chǔ)，也為防控S. Pullorum提供了新的策略。