番茄紅素對(duì)秦川牛精液冷凍保存及鮮精品質(zhì)影響

王 萌，楊超群，吳斯林，譚建兵，杜鑫澤，李振興，昝林森，楊武才

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，楊凌 712100)

精液在冷凍的過程中，環(huán)境溫度的迅速降低導(dǎo)致精子產(chǎn)生應(yīng)激，膜脂質(zhì)被氧化，導(dǎo)致精子膜結(jié)構(gòu)受損，這種氧化應(yīng)激最終造成精子功能的改變[1]。且凍融的精子比新鮮的精子更容易被過氧化，冷凍解凍后精子活率、活力、功能膜完整性和線粒體活性以及抗氧化酶活性降低[2-3]。此外，在種公畜新鮮精液生產(chǎn)過程中，飼養(yǎng)種公畜環(huán)境溫度過高、活動(dòng)空間小等都會(huì)造成動(dòng)物氧化應(yīng)激，影響雄性動(dòng)物的精子質(zhì)量，危害畜體健康[4-5]。研究表明，在精液稀釋液中添加抗氧化劑可以減少精子在冷凍過程中的氧化損傷，提高精液冷凍保存效果，而在種公畜日糧中添加抗氧化劑可以減少機(jī)體應(yīng)激，提高種公畜繁殖性能[6-8]。

番茄紅素(lycopene，LYC)是主要的天然類胡蘿卜素，是一種高度不飽和的直鏈碳?xì)浠衔铮肿邮綖?C40H56，相對(duì)分子質(zhì)量為 536.88，熔點(diǎn) 176 ℃，不溶于水，可溶于脂類和非極性溶劑，有13個(gè)碳-碳雙鍵，包括11個(gè)是共軛雙鍵和2個(gè)非共軛雙鍵，這使它成為一種非常強(qiáng)大的抗氧化劑[9-10]。研究表明，在單線態(tài)氧的猝滅效率功效方面，番茄紅素是β-胡蘿卜素的兩倍多，比α-生育酚快十倍，更是維生素E的一百倍，且具有抗腫瘤、延緩衰老、保護(hù)心血管和增強(qiáng)免疫力的生物學(xué)功能[11-13]。近年來(lái)，番茄紅素在雄性生殖調(diào)控和保護(hù)方面的研究越來(lái)越多，番茄紅素對(duì)雄性動(dòng)物繁殖性能有較好促進(jìn)作用[14]，如在被診斷為特發(fā)性或抗體介導(dǎo)性不育癥的患者中，使用番茄紅素可以顯著改善精液品質(zhì)參數(shù)[9, 15]；此外，在小鼠體內(nèi)的研究表明，番茄紅素可防止睪丸退行性改變，改善精子活力和形態(tài)，并穩(wěn)定暴露于藥物、有機(jī)污染物或真菌毒素的睪丸組織的抗氧化能力[16-17]；而在綿羊的日糧中添加番茄紅素，能夠顯著提高血漿和睪丸組織中睪酮含量，使睪丸重量增加，促進(jìn)綿羊睪丸組織的發(fā)育[18]。番茄紅素在精液冷凍稀釋液中也有應(yīng)用，精液稀釋液中添加適宜濃度的番茄紅素可以顯著提高人、豬和羊冷凍-解凍后精子運(yùn)動(dòng)性能和精子生理結(jié)構(gòu)的完整性，保護(hù)精子DNA完整性，改善冷凍精液質(zhì)量，從而提高精液冷凍保存效果[19-21]。

目前，雖然番茄紅素在牛精液冷凍保存中已有研究[22]，但是由于牛的品種、飼養(yǎng)氣候等因素，導(dǎo)致番茄紅素對(duì)牛精液冷凍保存效果存在很大的差異，且番茄紅素對(duì)牛新鮮精液品質(zhì)的影響未見報(bào)道。因此，本研究基于番茄紅素的抗氧化生物學(xué)性質(zhì)和具有為雄性生殖細(xì)胞提供抗氧化保護(hù)的前景，旨在探索番茄紅素在體外對(duì)秦川牛精液冷凍保存效果和體內(nèi)對(duì)秦川牛精液品質(zhì)及機(jī)體抗氧化性能的影響。為優(yōu)化牛精液冷凍保存技術(shù)和提高動(dòng)物機(jī)體抗氧化能力提供依據(jù)，有助于進(jìn)一步開發(fā)成本較低效果較好的新型精液稀釋液添加劑和種公畜日糧添加劑，促進(jìn)秦川牛的肉牛改良與保種工作。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料和試劑

計(jì)算機(jī)輔助精液分析系統(tǒng)(SQA-Vb)，SQA-Vb精液采樣管，精子程序冷凍儀均購(gòu)于澳大利亞Cryologic；精子冷凍細(xì)管灌裝機(jī)購(gòu)于法國(guó)卡蘇；移液槍，電子天平，水浴鍋，倒置熒光顯微鏡均購(gòu)于日本Olmpus公司；檸檬酸鈉(羅恩)；果糖、葡萄糖、甘油、TRIS、慶大霉素和鏈霉素、番茄紅素、羅丹明123均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；飼喂級(jí)番茄紅素購(gòu)自陜西昂煦生物科技有限公司；試劑盒均購(gòu)自南京建成工程研究所有限公司。

1.2 精液稀釋液配制

100 mL基礎(chǔ)精液稀釋液中含有檸檬酸鈉1.354 g、TRIS 2.4224 g、葡萄糖1.1 g、甘油5.33 mL、卵黃20 mL、雙抗0.587 mL和雙蒸水68.82 mL，攪拌混勻后放入4 ℃冰箱中備用，使用時(shí)，根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)在基礎(chǔ)稀釋液中分別加入0、1、2、3、4 μmol·L-1的番茄紅素于37 ℃水浴鍋中預(yù)熱待用。

1.3 動(dòng)物飼喂

選擇體重600 kg左右且新鮮精液品質(zhì)相近并穩(wěn)定的秦川種公牛3頭，在日糧中添加15 mg·kg-1BW番茄紅素進(jìn)行飼喂，預(yù)飼期15 d，正飼期45 d，飼喂番茄紅素前后種公牛基礎(chǔ)日糧不變，自由飲水。

1.4 精液的采集與處理

精液冷凍保存：選擇3頭秦川種公牛：年齡3～5歲，體況健壯且繁殖性能良好，在每周二、五早上09:00點(diǎn)利用假陰道法采精，選擇顏色乳白色或乳黃色的正常鮮精用儀器分析，活力≥65%，密度≥6×108個(gè)· mL-1，畸形率≤15%的精液采用一步法進(jìn)行稀釋，即將預(yù)熱的牛精液稀釋液緩慢倒入新鮮精液中(新鮮精液在稀釋之前始終保持在37 ℃)，將稀釋后的精液利用細(xì)管灌裝封口一體機(jī)進(jìn)行分裝并在4 ℃平衡3 h后，放入4 ℃冷凍箱中用程序化自動(dòng)冷凍儀緩慢降溫至-145 ℃，迅速放入液氮中保存。7 d后用于檢測(cè)，迅速將0.25 mL細(xì)管從液氮中取出放入37 ℃水浴鍋中30 s解凍進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.5 血液采集與處理

秦川種公牛飼喂番茄紅素前后進(jìn)行頸靜脈采血10 mL，血樣立即運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室在離心機(jī)中以3 000 r ·min-1轉(zhuǎn)速離心10 min，吸取上清液血清，置于-80 ℃冰箱進(jìn)行保存用于后期檢測(cè)。

1.6 精子質(zhì)量的檢測(cè)

1.6.1 精子活力檢測(cè) 新鮮精液精子運(yùn)動(dòng)性能的檢測(cè)：預(yù)熱1支空的精子采樣管，將100 μL新鮮精液加入到預(yù)熱的2.0 mL Qwik CheckTM稀釋液(適用于動(dòng)物新鮮精液)中，混勻樣本，用SQA-Vb精子采樣管吸取混合后的精液，將精子采樣管插入SQA-Vb測(cè)量倉(cāng)進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)新鮮精液檢測(cè)3次，保存結(jié)果，各種精子運(yùn)動(dòng)相關(guān)參數(shù)如下：活動(dòng)精子率(%)、前向運(yùn)動(dòng)精子率(%)、前向運(yùn)動(dòng)精子平均速率(μm·s-1)、畸形率(%)。

冷凍-解凍后精子運(yùn)動(dòng)性能的檢測(cè)：在37 ℃水浴鍋中提前預(yù)熱500 μL Qwik CheckTM稀釋液(適用于冷凍動(dòng)物精液)，將解凍后的200 μL精液加入其中混勻，用SQA-Vb精子采樣管吸取混合后的精液，將精子采樣管插入SQA-Vb測(cè)量倉(cāng)進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)處理組檢測(cè)3次，保存結(jié)果，各種精子運(yùn)動(dòng)相關(guān)參數(shù)如下：活動(dòng)精子率(%)、前向運(yùn)動(dòng)精子率(%)、前向運(yùn)動(dòng)精子平均速率(μm·s-1)。

1.6.2 精子質(zhì)膜完整性檢測(cè) 利用精子尾部低滲腫脹(hypo-osmotic swelling test，HOST)法檢測(cè)精子質(zhì)膜完整性。按比例配制好低滲溶液，將100 μL解凍后的精液加入到提前預(yù)熱的等溫1 mL低滲溶液中，混勻孵育30 min，吸取10 μL制成玻片，在400×鏡下觀察，精子尾部呈角度彎曲為質(zhì)膜完整，根據(jù)“精子彎尾率(%)=彎尾精子數(shù)/計(jì)數(shù)總精子數(shù)×100”計(jì)數(shù)彎尾率，每次至少計(jì)數(shù)200個(gè)精子，重復(fù)3次以上。

1.6.3 精子頂體完整率檢測(cè) 利用花生凝集素?zé)晒鈽?biāo)記(FITC-PNA)染色法檢測(cè)精子頂體完整性。吸30 μL解凍后的精液，在干凈的載玻片上涂抹均勻，自然風(fēng)干后，用4%組織細(xì)胞固定液固定20 min，用10 μL FITC-PNA染液染色，37 ℃濕盒中避光孵育30 min，PBS沖洗3次，在熒光顯微鏡400×鏡下拍照，頭部呈綠色熒光的為頂體完整，即“精子頂體完整率(%)=頭部綠色熒光的精子數(shù)/計(jì)數(shù)總精子數(shù)×100”，每次至少計(jì)數(shù)200個(gè)，重復(fù)3次以上。

1.6.4 精子線粒體活性檢測(cè) 利用羅丹明(Rh123)熒光染料聯(lián)合染色來(lái)區(qū)分精子線粒體是否具有活性，因?yàn)镽h123能夠特異性地與功能良好的線粒體結(jié)合，使得精子尾部在熒光顯微鏡下發(fā)出綠光，因此，頭部不發(fā)光但尾部有綠色熒光的是有線粒體活性的精子。將200 μL解凍后的精液加入到500 μL提前預(yù)熱的等溫稀釋液中，將3 μL Rh123加入到預(yù)熱的200 μL PBS緩沖液中37 ℃避光孵育10 min形成染色液，在染色液中加入100 μL稀釋后的精液，37 ℃避光孵育30 min，吸取10 μL制成玻片，在熒光顯微鏡400×下觀察，計(jì)算線粒體活性，“精子線粒體活性(%)=尾部綠色熒光但頭部不發(fā)光精子數(shù)/計(jì)數(shù)總精子數(shù)×100”。每次至少計(jì)數(shù)200個(gè)精子，重復(fù)3次以上。

1.7 抗氧化性能檢測(cè)

MDA含量的變化和SOD、CAT及GSH-Px三種酶活性的變化表示抗氧化能力的強(qiáng)弱，這些抗氧化指標(biāo)的檢測(cè)按照相應(yīng)檢測(cè)試劑盒的說明書進(jìn)行。

1.8 統(tǒng)計(jì)與分析

本試驗(yàn)所有數(shù)據(jù)用 SPSS 軟件 25.0 進(jìn)行單因素方差分析，所有結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±S.D.)”表示，P<0.05 表示差異顯著，P>0.05表示差異不顯著。

2 結(jié) 果

2.1 番茄紅素對(duì)冷凍-解凍后秦川牛精子運(yùn)動(dòng)性能的影響

1 μmol·L-1番茄紅素對(duì)秦川牛精子活率和前向運(yùn)動(dòng)精子率有提高的作用，與對(duì)照組相比，前向運(yùn)動(dòng)精子率顯著提高(P<0.05)，但精子活率沒有顯著差異(P>0.05，表1)；當(dāng)番茄紅素的濃度為2 μmol·L-1時(shí)，與對(duì)照組相比，冷凍-解凍后秦川牛精子的活率、前向運(yùn)動(dòng)精子率顯著提高(P<0.05)，并都達(dá)到最高，其中精子活率為60.10%，前向運(yùn)動(dòng)精子率為47.20%，而前向運(yùn)動(dòng)精子的平均速率有提高的趨勢(shì)，為39.33 μm·s-1，但沒有顯著差異(P>0.05，表1)；后隨著添加番茄紅素濃度的升高，冷凍-解凍后牛精子的活率、活力和前向運(yùn)動(dòng)精子的平均速率逐漸降低，添加3和4 μmol·L-1的番茄紅素對(duì)冷凍-解凍后秦川牛精子運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生了抑制作用，與對(duì)照組相比，冷凍-解凍后精子的活率和前向運(yùn)動(dòng)精子率都顯著降低 (P<0.05)，前向運(yùn)動(dòng)精子平均速率有降低的趨勢(shì)，但沒有顯著差異(P>0.05，表1)。

表1 番茄紅素對(duì)冷凍-解凍后秦川牛精子運(yùn)動(dòng)性能的影響

2.2 番茄紅素對(duì)冷凍-解凍后秦川牛精子質(zhì)膜完整性的影響

表2結(jié)果顯示，在精液冷凍稀釋液中添加番茄紅素濃度為1 μmol·L-1時(shí)，冷凍-解凍后秦川牛精子的質(zhì)膜完整性與對(duì)照組相比沒有顯著差異(P>0.05)；在精液稀釋液中添加2 μmol·L-1番茄紅素的精子質(zhì)膜完整性達(dá)到了55.92%，完整性顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；精液稀釋液添加番茄紅素濃度為3和4 μmol·L-1時(shí)，對(duì)精子的質(zhì)膜出現(xiàn)破壞作用，但3 μmol·L-1的精子質(zhì)膜完整性與對(duì)照組相比沒有顯著差異(P>0.05)；與對(duì)照組相比，4 μmol·L-1的番茄紅素顯著抑制(P<0.05)了精子質(zhì)膜狀態(tài)完整，圖1為精子質(zhì)膜檢測(cè)的示意圖。

表2 番茄紅素對(duì)冷凍-解凍后秦川牛精子質(zhì)膜完整性的影響

“→”表示質(zhì)膜完整的精子，“↓”表示質(zhì)膜不完整的精子“→” indicate the sperm with integral membrane, “↓” indicate the sperm with damaged membrane圖1 精子質(zhì)膜檢測(cè)的示意圖Fig.1 Images of sperm membrane

2.3 番茄紅素對(duì)冷凍-解凍后秦川牛精子頂體完整率的影響

表3結(jié)果顯示，番茄紅素的濃度處于0～2 μmol·L-1范圍內(nèi)時(shí)，冷凍-解凍后精子頂體完整率與濃度呈正相關(guān)；但當(dāng)濃度范圍處于2～4 μmol·L-1時(shí)，精子頂體結(jié)構(gòu)的完整性與濃度呈負(fù)相關(guān)。精液稀釋液中添加2 μmol·L-1番茄紅素的精子頂體完整率最高，為61.47%，顯著高于對(duì)照組(P<0.05，表3)；精液稀釋液中添加番茄紅素濃度為3 和4 μmol·L-1時(shí)，冷凍-解凍后精子頂體完整率與對(duì)照組相比均有顯著性降低(P<0.05，表3)，結(jié)果表明適宜濃度的番茄紅素對(duì)秦川牛精子頂體結(jié)構(gòu)具有積極作用，圖2為精子頂體染色示意圖。

表3 番茄紅素對(duì)冷凍-解凍后秦川牛精子頂體完整率的影響

“S1” 表示頂體完整的精子，“S2” 表示頂體損傷的精子“S1” indicate the sperm with integral acrosome, “S2” indicate the sperm with damaged acrosome圖2 精子頂體染色示意圖Fig.2 Images of sperm acrosome staining

2.4 番茄紅素對(duì)冷凍-解凍后秦川牛精子線粒體活性的影響

表4顯示，番茄紅素濃度為1 μmol·L-1時(shí)的冷凍-解凍后精子線粒體活性與對(duì)照組相比沒有顯著差異(P>0.05)；在精液稀釋液中添加2 μmol·L-1番茄紅素的精子線粒體活性最高，為49.30%，顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；精液稀釋液添加番茄紅素濃度為3 和4 μmol·L-1時(shí)，對(duì)精子的線粒體膜出現(xiàn)破壞作用，與對(duì)照組相比，顯著降低(P<0.05)了冷凍-解凍后線粒體活性，圖3為精子線粒體染色的示意圖。

表4 番茄紅素對(duì)冷凍-解凍后秦川牛精子線粒體活性的影響

2.5 番茄紅素對(duì)冷凍-解凍后秦川牛精子抗氧化能力的影響

表5結(jié)果顯示，當(dāng)添加番茄紅素濃度為1 μmol·L-1時(shí)，冷凍-解凍后精子細(xì)胞內(nèi)CAT和GSH-Px的酶活性顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，但精子細(xì)胞內(nèi)MDA的含量與對(duì)照組相比沒有顯著差異(P>0.05)；而在稀釋液中添加2 μmol·L-1番茄紅素的抗氧化效果最好，與對(duì)照組相比，能夠顯著提高冷凍-解凍后精子細(xì)胞內(nèi)CAT和GSH-Px的酶活性(P<0.05)，并顯著降低精子細(xì)胞中MDA的含量(P<0.05)；后隨著精液稀釋液中番茄紅素濃度的增加，冷凍-解凍后精子抗氧化性能逐漸降低，添加番茄紅素的濃度為3和4 μmol·L-1時(shí)，與2 μmol·L-1相比，CAT和GSH-Px的酶活性顯著降低(P< 0.05)，精子細(xì)胞中MDA含量顯著增加(P<0.05)。

“M1”表示具有線粒體活性的精子，“M2”表示不具有線粒體活性的精子“M1” indicate the sperm with mitochondrial activity, “M2” indicate the sperm without mitochondrial activity圖3 精子線粒體染色示意圖Fig.3 Images of sperm mitochondrial staining

表5 番茄紅素對(duì)冷凍-解凍后秦川牛精子抗氧化能力的影響

2.6 日糧中添加番茄紅素對(duì)秦川牛精液品質(zhì)的影響

種公牛日糧中添加番茄紅素對(duì)秦川牛精液品質(zhì)的影響見表6，在種公牛日糧中添加番茄紅素對(duì)秦川牛精液品質(zhì)有著積極的影響，在飼喂番茄紅素60 d后與飼喂之前相比，秦川種公牛活動(dòng)精子率和前向運(yùn)動(dòng)精子率都有著顯著提高(P<0.05)，精子畸形率顯著降低(P<0.05)，其中，飼喂番茄紅素后活動(dòng)精子率提高了13.20%，前向運(yùn)動(dòng)精子率提高了13.74%，精子畸形率下降了9.01%，這說明日糧中添加番茄紅素能夠提高秦川種公牛的繁殖性能。

表6 番茄紅素對(duì)秦川牛精液品質(zhì)的影響

2.7 日糧中添加番茄紅素對(duì)秦川牛機(jī)體抗氧化性能的影響

表7顯示，日糧中添加番茄紅素對(duì)秦川種公牛血清中SOD、CAT和GSH-Px酶活性及MDA含量有顯著影響(P<0.05)。與日糧中添加番茄紅素飼喂之前相比較，飼喂后種公牛血清中SOD、CAT和GSH-Px酶活性顯著增強(qiáng)(P<0.05)，血清中MDA含量顯著降低(P<0.05)；日糧中添加番茄紅素能夠提高種公牛的抗氧化性能，對(duì)機(jī)體起到很好的保護(hù)作用。

表7 番茄紅素對(duì)秦川牛血清抗氧化性能的影響

3 討 論

精液冷凍過程會(huì)造成精子氧化應(yīng)激，精子細(xì)胞中所有的成分，包括脂類、蛋白質(zhì)、核酸和糖，都是氧化應(yīng)激的潛在目標(biāo)[23]。氧化應(yīng)激引起改變的比例取決于活性氧(ROS)的性質(zhì)和濃度、暴露于ROS的時(shí)間，但也取決于細(xì)胞外因素，如溫度、氧氣和環(huán)境組成(離子、蛋白質(zhì)、ROS清除劑)[24]。在冷凍解凍的精液中，質(zhì)膜和頂體外膜對(duì)低溫最敏感，氧化應(yīng)激通常會(huì)導(dǎo)致精子活力喪失、質(zhì)膜腫脹和頂體膜起泡，并改變精子質(zhì)膜的通透性。在凍融過程中，當(dāng)ROS大量產(chǎn)生時(shí)，質(zhì)膜的結(jié)構(gòu)損傷增加了對(duì)脂質(zhì)過氧化的敏感性。精漿中含有大量的抗壞血酸、α-生育酚、丙酮酸、谷胱甘肽、?；撬岬确敲割惪寡趸瘎@些都是精子細(xì)胞用來(lái)抵御ROS攻擊的最重要的保護(hù)元素，但這些元素有限，不足以保護(hù)精子在冷凍過程中的損傷[25-26]。天然抗氧化劑在精液稀釋和冷凍中作為介質(zhì)，如α-生育酚和抗壞血酸，對(duì)冷凍保存的牛精子細(xì)胞的代謝活性和細(xì)胞活力具有保護(hù)作用[27-28]。

本研究的體外試驗(yàn)中，在精液冷凍保存之前，通過在牛精液冷凍稀釋液中添加0、1、2、3、4 μmol·L-1濃度的番茄紅素，探究其對(duì)冷凍-解凍后秦川種公牛精子的活力、線粒體活性、生理結(jié)構(gòu)狀態(tài)(質(zhì)膜、頂體)及精子抗氧化能力的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LYC能夠顯著提高冷凍-解凍后秦川種公牛精子的運(yùn)動(dòng)性能、生理結(jié)構(gòu)的完整性和抗氧化能力，且LYC的最適添加濃度為2 μmol·L-1。這與戴小凡[29]在人的精液冷凍保存中發(fā)現(xiàn)的番茄紅素能夠改善冷凍-解凍后精液質(zhì)量的結(jié)果是一致的；王艷華等[26]在山羊的精液冷凍保存中添加1 μmol·L-1的番茄紅素對(duì)山羊精液具有顯著的保護(hù)作用，可以提高山羊凍精品質(zhì)；王捷[19]在豬的精液冷凍保存中添加2 μmol·L-1的番茄紅素能夠顯著提高冷凍-解凍后豬精子的運(yùn)動(dòng)性能和生理結(jié)構(gòu)的完整性，進(jìn)而達(dá)到提高豬精液冷凍保存效果的目的，且通過在豬胚胎發(fā)育的體外培養(yǎng)液中添加番茄紅素的研究發(fā)現(xiàn)，番茄紅素能夠影響豬胚胎發(fā)育能力和線粒體依賴性細(xì)胞凋亡途徑，在整個(gè)體外授精期間補(bǔ)充番茄紅素可通過調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激和線粒體依賴性細(xì)胞凋亡來(lái)增強(qiáng)豬的胚胎發(fā)育[30]。同時(shí)，本研究獲得的番茄紅素對(duì)冷凍-解凍后秦川牛精子活力、生理結(jié)構(gòu)和精子抗氧化能力的提高作用的結(jié)果與之前報(bào)道的冷凍-解凍后其他品種和地區(qū)牛的結(jié)果相同[22, 31]，這表明牛的品種和飼養(yǎng)氣候可能不影響番茄紅素對(duì)精液冷凍保存的提高作用。但番茄紅素濃度過高，會(huì)顯著抑制冷凍-解凍后精子的運(yùn)動(dòng)性能和精子生理結(jié)構(gòu)的完整性，并對(duì)冷凍-解凍后精子的抗氧化性能有影響，究其原因可能是高濃度的番茄紅素具有一定的毒害作用，高濃度的番茄紅素會(huì)導(dǎo)致其抗氧化活性作用轉(zhuǎn)變?yōu)榇傺趸钚訹32]。

同時(shí)，隨著現(xiàn)代畜牧養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，畜禽集約化程度不斷提高，氧化應(yīng)激對(duì)畜禽生產(chǎn)的危害越來(lái)越嚴(yán)重，造成動(dòng)物機(jī)體免疫力、生理機(jī)能、生產(chǎn)性能和繁殖性能降低，引發(fā)群體病變，甚至死亡[33-34]。大量研究證實(shí)了抗氧化劑作為畜禽日糧添加劑在畜牧業(yè)養(yǎng)殖中的重要性，這些抗氧化物質(zhì)可以有效調(diào)控動(dòng)物機(jī)體由于氧化應(yīng)激產(chǎn)生的危害，從而保障動(dòng)物機(jī)體細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)和生理機(jī)能的正常運(yùn)行[35]。研究發(fā)現(xiàn)，在蛋雞和肉仔雞飼糧中外源添加抗氧化劑叔丁基對(duì)苯二酚、茶多酚、維生素 E、吡咯喹啉醌、葡萄原花青素、硫辛酸、乙酰肉堿和肌肽可以改善和提高肉品質(zhì)，并通過提高血漿中的抗氧化酶活性來(lái)提高動(dòng)物機(jī)體的抗氧化能力[36-37]，且在肉雞飲水中添加0.5 g·L-1番茄紅素對(duì)精液質(zhì)量、受精率和免疫力都有積極的作用[38]；而在大鼠靜脈曲張引起不育癥的研究中顯示，精索靜脈曲張組給予10 mg·kg-1的番茄紅素可以通過增加抗氧化活性和減少活性氧來(lái)保護(hù)精子免受活性氧和精子DNA損傷，可防止氧化應(yīng)激引起的大鼠睪丸組織結(jié)構(gòu)和功能損害以及精子質(zhì)量降低[39]；通過飼喂5.0% 的番茄渣可提高豬肉的氧化穩(wěn)定性，靳天宇等[40-41]在綿羊的日糧中添加抗氧化劑亞硝酸鈉后發(fā)現(xiàn)綿羊的精子活力、運(yùn)動(dòng)速度和線粒體活性都得到提升，提高了綿羊的精液品質(zhì)。本研究發(fā)現(xiàn)，在秦川種公牛日糧中添加15 mg·kg-1BW番茄紅素后能夠顯著提高種公牛的精子活率和精子活力，降低精子畸形率，并對(duì)機(jī)體血清中的抗氧化性能有顯著的提高作用。這些均說明了番茄紅素可以作為日糧添加劑來(lái)改善精液品質(zhì)，提高繁殖性能。

4 結(jié) 論

番茄紅素對(duì)秦川種公牛精液冷凍保存和鮮精精液品質(zhì)具有積極的作用。其中在秦川牛精液冷凍保存過程中添加適量的番茄紅素可以顯著提高冷凍-解凍后精子的活力、生理結(jié)構(gòu)完整性(頂體、質(zhì)膜和線粒體)以及抗氧化酶(CAT和GSH-Px)活性，顯著降低精子中MDA含量，且最適添加濃度為2 μmol·L-1；飼喂15 mg·kg-1BW 番茄紅素后，秦川種公牛的精子活力顯著提高，精子畸形率顯著降低，血清中MDA含量顯著降低，3種抗氧化酶(SOD、CAT、GSH-Px)活性顯著增加，表明番茄紅素改善精液品質(zhì)和提高種公畜的繁殖性能可能是通過提高機(jī)體的抗氧化能力來(lái)實(shí)現(xiàn)的。