基于轉錄組數據分析環(huán)形泰勒蟲對誘導宿主細胞轉化相關基因的影響

趙保才，趙帥陽，關貴全，羅建勛，曹天行，張志剛，石 苗，劉軍龍*，趙洪喜*

(1.寧夏大學農學院，銀川 750021；2.中國農業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所/家畜疫病病原生物學國家重點實驗室/甘肅省動物寄生蟲病重點實驗室，蘭州 730046)

環(huán)形泰勒蟲屬于原生動物，是頂復門家族的一種胞內致病寄生蟲，感染牛后可導致其淋巴結腫大、發(fā)熱、黃疸和厭食，常被當作一種普通的發(fā)熱癥狀治療。因治療措施不當病情加劇，從而導致感染牛死亡，在一些地區(qū)死亡率接近80%[1]，給世界各地的養(yǎng)殖業(yè)每年造成的經濟損失高達12.95億美元[2]。環(huán)形泰勒蟲病主要分布在熱帶和亞熱帶地區(qū)，但隨著全球氣溫上升導致其媒介蜱分布范圍擴大，以及國際畜牧貿易的往來，均加劇了環(huán)形泰勒蟲的傳播[3]。在我國，環(huán)形泰勒蟲在北方牧區(qū)很常見，但近年來，在我國南方也相繼有環(huán)形泰勒蟲病例的報道[4-5]。

環(huán)形泰勒蟲可感染宿主的單核細胞、淋巴細胞、樹突狀細胞，在沒有抗原刺激或外源生長因子的情況下，被感染的細胞在體外培養(yǎng)時表現出無限增殖的特征，也稱為轉化[6-7]，同時被感染的細胞還具備逃脫免疫機制以及抗凋亡的能力，雖然這些與癌細胞表現出的特征極為相似[8]。但環(huán)形泰勒誘導的轉化細胞也有一些獨特之處，例如：這種轉化是完全可逆的。感染細胞的持續(xù)增殖取決于宿主細胞質中環(huán)形泰勒蟲的存在，并且通過用特定的泰勒蟲藥物布帕伐醌處理消除寄生蟲后，感染細胞會在3～4 d內恢復到正常，并最終經歷細胞凋亡[9]。因此也有很多學者把這兩者相聯系，以期找到這些表型背后的分子機制?，F階段環(huán)形泰勒蟲轉化細胞的機制研究主要在抑制細胞的凋亡信號通路方面開展。已有多種蟲體蛋白被驗證可對宿主細胞的NF-κB、MAPK、c-Myc、JAK/ STAT3、JNK和C-Jun等信號通路發(fā)揮作用，從而增強細胞的轉化活性。感染環(huán)形泰勒蟲的淋巴細胞會在宿主體內增殖，導致感染動物全身出現多個腫瘤樣病變[10]。環(huán)形泰勒蟲在感染細胞中表現為無限繁殖，說明環(huán)形泰勒蟲需要建立一種或者多種機制來保護被感染的細胞免受促死亡信號的激活。現已證明多種抗凋亡蛋白在環(huán)形泰勒蟲轉化的淋巴細胞中被激活，比如p53蛋白[11]。同樣在泰勒蟲轉化的細胞中，發(fā)現NF-κB被結構性激活，這賦予感染細胞對抗凋亡的能力[12]。在這樣的背景下，本實驗室通過藥物處理前后環(huán)形泰勒蟲感染的牛單核細胞(TaNM Ⅰ)轉錄組數據的比較分析。篩選出與細胞增殖、凋亡相關的信號通路中發(fā)揮重要作用的分子，預測其在細胞轉化過程中發(fā)揮的作用，為后續(xù)研究的開展奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

1.1.1 細胞來源 環(huán)形泰勒蟲裂殖體感染的牛單核細胞(TaNM Ⅰ)由中國農業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所國家重點實驗室提供。

1.1.2 主要試劑 M5 Total RNA Extraction Reagent購自聚合美公司；PrimeScripTMRT reagent Kit with gDNA Eraser、RPMI 1640培養(yǎng)基均購自TaKaRa公司；布帕伐醌(BW720)購自源葉生物公司；二甲基亞砜(DMSO)、10×PBS緩沖液購自索萊寶公司；甲醇(CH3OH)、乙醇(C2H5OH)、氯仿(CHCl3)等均為國產分析純。

1.1.3 主要儀器 細胞培養(yǎng)箱(3423)、超微量分光光度計(Nano Drop2000)、-80 ℃冰箱(900)購自賽默飛(中國)公司；Bioanalyzer 2100生物分析儀購自上海亞晶公司；低速冷凍離心機(DL-5M)購自湘儀集團；可調式移液器購自艾本德中國有限公司；熒光定量PCR儀(Mx3005P)購自安捷倫科技公司；自動細胞計數儀購自上海睿鈺公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 環(huán)形泰勒蟲轉化細胞系的培養(yǎng) 將第20代環(huán)形泰勒蟲感染細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、16 ng·μL-1慶大霉素的RPMI1640培養(yǎng)瓶，置于37 ℃含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 環(huán)形泰勒蟲感染細胞的藥物處理 將細胞濃度培養(yǎng)至1×105cells·mL-1，處理組加入DMSO配制的200 ng·mL-1的BW720，在DMSO對照組中加入相同體積的DMSO;每組均設3個生物學重復，然后放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，在72 h收集BW720處理組和DMSO對照組細胞樣品，并調整細胞數在1×107細胞左右(數量相差控制在±2倍內)。同時利用吉姆薩染色法以及細胞計數的方式觀察藥物的作用效果。

1.2.3 總RNA的提取 按試劑盒說明利用 Trizol Reagent分別提取BW720組和DMSO組的細胞總RNA，使用Nano Drop-2000分光光度計和Bioanalyzer2100生物分析儀對RNA濃度及RNA完整性進行鑒定。

1.2.4 mRAN文庫構建 從樣品中提取總RNA后，把 BW720 和 DMSO處理的樣品送至公司進行測序分析，構建好的文庫使用Agilent 2100以及qPCR進行質控，最后利用測序平臺 Illumina HiSeq 4000 進行測序。

1.2.5 測序數據質控 利用Fastqc和Trimglore軟對原始數據(Raw reads)進行質量控制：1)去除含有接頭的 Reads；2)去除低質量的 Reads(包括去除N的比例>10%的 Reads，去除質量值Q≤10的堿基數占整條 Read 的50%以上的 Reads)；3)過濾包含 poly A 的 Reads，過濾后得到的 Clean reads，即有效序列，進行總數、種類分布統計，并用于后續(xù)分析。

1.2.6 BW720和DMSO處理后基因的比對與Venn分析 將嚴格質控后得到的序列，分別與GenBank、Rfam、RDP數據庫進行比對，同時運用 Blast 軟件，盡可能去除樣本中的rRNA、scRNA、snoRNA、snRNA和tRNA，從而獲得高質量數據。通過Hisat2軟件將質控后的Clean reads數據映射到牛的參考基因組中，把與牛參考基因組相一致(外顯子區(qū)域、內含子區(qū)域、重復序列區(qū)域)的Clean reads，以及未比對上的Clean reads與數據庫中的 mRNA 前體序列進行比對，從而鑒定已知基因的序列。同時基于所選參考基因組序列，使用 String Tie 軟件對Mapped reads 進行拼接，并與原有的基因組注釋信息進行比較，尋找原來未被注釋的轉錄區(qū)，發(fā)掘該物種的新轉錄本和新基因，從而補充和完善原有的基因組注釋信息。利用基迪奧在線工具集合(www.omicshare.com)對BW720和DMSO的mRNA進行Venn分析，采用默認參數，分別篩選出BW720和DMSO處理組的共有和差異的mRNA。

1.2.7 差異表達基因的GO和KEGG富集分析 高質量的轉錄組學數據可作為本研究中mRNA的數據來源。以差異倍數(Fold change)≥2且P≤0.01作為篩選標準，利用DESeq2和edgeR軟件篩選BW720與DMSO處理組中差異表達的mRNA(DE mRNA)篩選結果的交集作為可信度高的mRNA。利用Blast工具將DE mRNA比對到GO和KEGG數據庫，獲得相應的功能和通路注釋信息。

表1 RT-qPCR引物序列信息

2 結 果

2.1 藥物處理前后 TaNM Ⅰ 細胞

用BW720處理TaNMⅠ細胞后，細胞中的蟲體數量以及感染細胞數量都有明顯下降(圖1、2)，說明BW720對環(huán)形泰勒蟲作用明顯，可用于后續(xù)試驗。

2.2 環(huán)形泰勒蟲轉錄組測序質量控制

將數據上傳于服務器中進行質控、比對、計數。每個樣品產生超過5.96Gb的Clean數據，測序結果如表2所示，其中，比對率均在85%以上，Q30數據均在90%以上，表明測序數據滿足后續(xù)分析的條件。本試驗中BW720組和DMSO組分別得到6 854 019 704和6 627 265 854條Raw reads，經過一系列的篩選后，BW720組和DMSO組中分別獲得22 925 606和22 171 427條Clean reads。

圖1 DMSO和BW720處理TaNMⅠ細胞后的數量變化Fig.1 The number changes of TaNM I cells treated with DMSO and BW720

A. 用DMSO處理的感染細胞；B.用BW720處理的感染細胞A.Infected cells treated with DMSO; B. Infected cells treated with BW720圖2 DMSO和BW720處理TaNMⅠ感染細胞的吉姆薩染色觀察Fig.2 Observation of T. annulata infected TaNM Ⅰcells treated with DMSO and BW720 by Giemsa staining

表2 轉錄組測序數據質量檢測分析

2.3 差異表達基因篩選及聚類分析

本研究以DMSO處理的TaNM Ⅰ為對照組，以FDR<0.05，Fold change>2為篩選差異表達基因的條件。篩選出表達基因共4 054個，其中，2 146個基因顯著上調，1 908個基因顯著下調；共同差異表達的基因367個，有196個基因顯著上調，171個基因顯著下調(圖3)，通過對367個差異表達基因進行聚類分析觀察本試驗的分組是否合理(圖5)。然后從上調和下調的基因中分別篩選出表達量高且差異顯著的前10個基因(圖4)，其中，TLR2與PIK3-AKT信號通路有關，而EGLN3則與癌癥信號通路有關，提示這兩個基因可以作為后續(xù)研究細胞增殖的方向。

圖3 在DMSO和BW720處理組中差異表達基因數Fig.3 Numbers of differentially expressed genes in DMSO and BW720 treated cells

圖4 異表達基因統計圖Fig.4 Statistics of differentially expressed genes

圖5 367個差異表達基因的聚類結果Fig.5 The clustering results of 367 differentially expressed genes

2.4 差異表達基因的GO和KEGG富集分析

使用g:Profiler在線軟件對367個差異共表達基因進行GO功能富集分析，以Pvalue<0.05為篩選顯著富集的條件。GO功能注釋到顯著富集的差異mRNA共52條生物學功能條目，其中生物過程21條，富集水平最高且顯著富集前3的是細胞進程、生物調節(jié)、單一組織進程；細胞組分17條，顯著富集前3的是細胞、細胞部分、細胞器；分子功能14條，顯著富集前3的是結合、催化活性、信號傳感活性。如圖6所示。通過篩選到的這些顯著富集的GO條目可以發(fā)現，DMSO和BW720處理后差異表達的基因在生物代謝、蛋白質合成以及糖代謝方面發(fā)揮了重要作用。富集條目大部分都與轉錄和翻譯過程緊密相關，表明細胞在此時期的活動如：細胞增殖、分化以及凋亡等方面的活動非?；钴S，此時期可能為細胞周期的重要階段。

圖6 差異表達基因的GO圖Fig.6 GO diagram of differentially expressed genes

使用g:Profiler在線軟件對367個差異表達基因進行KEGG功能富集分析，以Pvalue<0.05為篩選顯著富集的條件，共篩選到270條信號通路，其中，Top 20的信號通路主要有癌癥信號通路、PI3K-Akt信號通路、MAPK信號通路、Ras等信號通路等(圖7)。

圖7 KEGG差異基因顯著富集的前20個信號通路Fig.7 The top 20 pathways enriched by differentially expressed genes analyzed by KEGG

利用g:Profiler在線軟件對Top20富集最明顯的“癌癥信號通路”中的差異表達基因及相關信號通路進行深入分析。分析結果表明，在幾個主要的信號通路中PI3K-Akt通路富集較多，表明在感染細胞凋亡的過程中這條通路可能是起主要作用的信號通路之一。同時轉錄組數據和q-PCR驗證結果均表明，PI3KR3、NFKBIA等基因在藥物處理組中顯著下調，說明在細胞凋亡的過程中這兩個基因起調節(jié)的作用，而且PI3KR3參與了多條信號通路，這提示在后續(xù)研究中可以把這兩個基因當作重點的研究對象(表3)。

表3 參與癌癥的主要信號通路以及主要基因

2.5 RT-qPCR驗證

對隨機選取10個差異表達基因進行RT-qPCR驗證，結果如圖8所示，10個差異表達基因中6個下調，4個上調，試驗結果與轉錄組測序結果一致，進一步證明了轉錄組測序數據的可靠性。

圖8 RT-qPCR驗證差異表達的基因Fig.8 RT-qPCR analysis of differentially expressed genes

3 討 論

在環(huán)形泰勒蟲轉化細胞無限增殖的過程中，很多信號通路處于激活狀態(tài)，而且這些信號通路大部分均與細胞的增殖與凋亡有關。雖然針對環(huán)形泰勒蟲轉化的機制進行過大量研究[13-15]，但利用轉錄組手段對TaNM Ⅰ細胞藥物處理前后基因及信號通路的研究尚未發(fā)現?；诖?，本研究通過轉錄水平對藥物處理前后環(huán)形泰勒蟲轉化細胞進行了研究，以期從中發(fā)現引起環(huán)形泰勒感染細胞無限增殖的基因，為下一步探究感染細胞的凋亡與增殖機制奠定基礎。在本研究中，為驗證藥物BW720對環(huán)形泰勒蟲的作用效果，使用吉姆薩染料對藥物處理前后的感染細胞進行染色。結果表明，當用BW720處理環(huán)形泰勒蟲感染細胞后，感染細胞以及感染細胞內的蟲體數量顯著減少，說明BW720對環(huán)形泰勒蟲是有作用效果的。

通過對藥物處理前后環(huán)形泰勒蟲感染細胞差異基因進行GO和KEGG富集分析，差異表達基因顯著富集于生物代謝、蛋白質合成、糖代謝、細胞增殖以及凋亡等生物過程中。說明為了使感染細胞具備無限增殖的能力，環(huán)形泰勒蟲可能需要借助宿主細胞的多種代謝機制，來維持自身不斷增長的物質需求。對KEGG富集結果分析發(fā)現，在Top20通路中關于環(huán)形泰勒蟲研究較多的信號通路：癌癥信號通路、PI3K-Akt信號通路、MAPK信號通路、Ras等信號通路被顯著富集。對這些信號通路進步分析發(fā)現：PI3KR3、FOXO1、IL23A、FZD3、AKT、MMP9等基因在轉錄組水平表達顯著，同時在環(huán)形泰勒蟲轉化細胞的研究中上述基因也有相關文獻的報道[16-18]。這為深入研究環(huán)形泰勒蟲轉化宿主細胞過程中的哪條信號通路起作用或者是否是多條信號通路聯合的效果提供了一個可思考的方向。因此本研究通過把環(huán)形泰勒蟲轉化細胞后相關信號通路以及信號通路上的有關基因與轉錄組數據結合起來，從而進行深入的分析，以期為環(huán)形泰勒蟲轉化細胞無限增殖的機制研究奠定理論基礎。

PI3K-AKT-mTOR信號通路主要參與細胞的生長、增殖和存活。PI3K通過誘導粒細胞—單核細胞集落刺激因子(GM-CSF)依賴性自分泌環(huán)從而促進淋巴細胞增殖，這也是泰勒蟲感染白細胞的特征之一[16, 19]。目前的研究表明，PI3K可能成為治療癌癥、慢性炎癥、過敏和心血管衰竭的藥物靶點[20]。在控制細胞增殖和存活的多條途徑中PI3K占據中心地位，研究表明在泰勒蟲轉化的淋巴細胞中PI3K被持續(xù)激活[21-22]，從而誘導絲氨酸/蘇氨酸激酶AKT(PKB)激活。阻斷PI3K-PKB通路可導致細胞增殖停滯，但不會立即誘導細胞凋亡，這表明PI3K-PKB通路在細胞增殖方面起到了主要的作用。PI3K被招募到質膜上，以響應由多種刺激傳遞的觸發(fā)信號，包括生長因子、免疫受體和細胞外基質成分。PI3K刺激導致PKB的激活，它除了調節(jié)葡萄糖代謝外，還有助于調節(jié)細胞周期和防止細胞凋亡[23]。在PI3K家族的眾多分子中，大多數證據顯示 IA 類 PI3K 在人類癌癥中有著重要作用，特別是 p110α亞型，在前列腺癌、乳腺癌、結直腸癌中均發(fā)現了PIK3CA 基因突變或上調的存在[24-25]。進一步的臨床前數據表明，顯著存在 IA 類 PI3K 的功能冗余，并且僅需要小部分I類PI3K活性就可以保持細胞的存活和增殖。同時，有研究表明，PI3KR3在維持肉瘤生長、遷移、侵襲方面起重要作用[26]，另外，PI3KR3在結直腸癌中表達上調并促進癌細胞增殖[27]。在本研究篩選出的基因PI3KR3，作為PI3K-AKT-mTOR信號通路的關鍵基因，在藥物處理后出現下調趨勢，這與既往的研究相一致，上述的研究表明，PI3KR3可能是治療癌癥的一個重要的潛在靶點。

作為最古老、進化上最保守的信號通路之一，絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)在免疫應答的許多過程中也起著重要作用。哺乳動物細胞中主要有3類MAPK：細胞外信號調節(jié)蛋白激酶(ERK)、p38 MAP激酶和C-Jun NH2末端激酶(JNK)[28]。當泰勒蟲感染牛淋巴細胞時，在這3個主要激酶中，只有Jun-NH2的末端激酶(JNK)被激活[17]。已經證明JNK通過在泰勒蟲轉化的細胞中誘導轉錄因子：激活蛋白-1(AP-1)和ATF-2的結構性激活，間接引起泰勒蟲感染細胞不受控制的增殖[29]。JNK失活(用JNK特異性抑制劑處理)導致淋巴細胞凋亡，提示JNK激活在泰勒蟲誘導的淋巴細胞轉化中具有抗凋亡作用。另外，ERK的激活與細胞增殖也有關，而p38和JNK以及其細胞底物C-Jun在細胞凋亡，尤其是Fas介導的細胞凋亡中起著積極的作用[30]。本研究中激活轉錄因子4(ATF4)在MAPK信號通路中表達顯著，ATF4控制著與氨基酸運輸、新陳代謝、氧化應激保護和蛋白質穩(wěn)態(tài)有關的基因[31]。然而，ATF4也可以誘導細胞凋亡、細胞周期停滯和衰老[32]。盡管腫瘤細胞對凋亡敏感，但腫瘤細胞經常利用ATF4來減輕由于增殖過快而產生的壓力。大量的細胞內代謝需要ATF4的激活來調節(jié)[33]，此外，ATF4及其靶基因與血管的生成和轉移也存在關系[34]。通過ATF4基因可以發(fā)現，TaNM Ⅰ與腫瘤細胞之間存在著很多微妙的聯系，在一些腫瘤上的研究理論、現象、結論，同樣適用于TaNM Ⅰ 細胞。在后續(xù)的研究中可以重點把兩者通過一些共同的基因聯系起來，從而達到互補驗證的效果。

NF-κB在細胞分化和增殖調控中起著核心作用，但它也參與了細胞凋亡的過程，也是炎癥和免疫反應的中心調節(jié)器[35]。NF-κB對腫瘤壞死因子或化療藥物誘導的細胞凋亡具有保護作用，這涉及到誘導細胞生存所需的基因。另一方面，也有人提出NF-κB的激活是細胞凋亡所必需的，這似乎也是泰勒蟲轉化的淋巴細胞生存所必需的。目前研究表明，NF-κB通過將多亞單位IKB激酶(IKK)募集到寄生蟲表面的活化灶中從而實現激活，活化后的NF-κB通過阻斷Caspase-8的激活從而抑制細胞凋亡。

研究表明，PI3K-Akt信號通路、MAPK信號通路、NF-κB信號通路均與腫瘤細胞無限增殖有關。而且在環(huán)形泰勒蟲感染宿主細胞導致其無限增殖的過程中，這幾個信號通路也被活化。本研究中，這幾個信號通路均被顯著富集，說明它們可能共同調控了環(huán)形泰勒蟲感染宿主細胞導致其無限增殖，從而引起了細胞的轉化特性。

4 結 論

從轉錄組數據分析得知，環(huán)形泰勒蟲感染宿主后，可能導致宿主細胞的一些靶基因發(fā)生改變從而使相應的信號通路激活，間接影響宿主細胞的增殖和凋亡。在本研究中，利用轉錄組技術對環(huán)形泰勒蟲感染宿主細胞相關基因及信號通路進行了分析，最終篩選出PI3KR3、ATF4、IKK、PIK3CA、AKT等在感染細胞無限增殖過程中可能起重要作用的一些基因。為了驗證上述基因是否參與癌癥的發(fā)生及發(fā)展，又對Top20富集最明顯的“癌癥信號通路”中與癌癥相關的基因做進一步分析，篩選出了SGK1、PLK2、RBL2、CREB3L4、NFKBIA、PI3KR3等基因。通過篩選發(fā)現無論在感染細胞還是在癌癥中，PI3KR3基因都存在，而且通過參與不同的信號通路(如：PI3K-Akt、FOXO、cAMP)進而調控細胞周期的活動。這些結論為深入研究TaNM Ⅰ細胞無限增殖機制奠定了理論基礎，也為TaNM Ⅰ和腫瘤細胞建立了新的聯系，從而提供了新的研究思路和方向。