L-蘋果酸對斷奶仔豬炎癥反應和腸道健康的影響

張鵬光，閆恩法，王黎琦，馬成宏，張 鑫，尹靖東

(中國農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院 動物營養(yǎng)學國家重點實驗室，北京 100193)

由于食物和環(huán)境的變化，斷奶仔豬呈現(xiàn)出腹瀉、消化能力下降和生長緩慢等癥狀[1]。斷奶導致腸道氧化應激，腸道中活性氧和硫代巴比妥酸反應性物質(zhì)濃度增加，同時一氧化氮和過氧化氫濃度顯著增加，促進了大腸桿菌的生長，導致腸道炎癥和氧化應激的進一步惡化[2]。腸道屏障功能對斷奶仔豬的健康狀況和生長性能有重要影響，腸道的緊密連接在上皮屏障的形成中發(fā)揮關(guān)鍵作用。緊密連接結(jié)構(gòu)包括跨膜蛋白(Claudin、Occludin等)、連接黏附分子以及帶狀閉合蛋白ZO等[3]。在炎癥性腸病下，Claudin、Occludin和ZO水平顯著下調(diào)，腸道對有害代謝產(chǎn)物的通透性增強，引起全身炎癥反應[4-5]。因此，改善斷奶仔豬的腸道功能對于仔豬健康以及養(yǎng)豬業(yè)的高效生產(chǎn)具有重要意義。

L-蘋果酸是三羧酸循環(huán)的中間代謝產(chǎn)物。研究發(fā)現(xiàn)，L-蘋果酸可以影響機體腸道微生物，在抗應激和抗氧化方面有重要作用[6-7]。大鼠上的研究也表明，L-蘋果酸可以通過增加NADPH的生成，改善衰老鼠的能量狀態(tài)，增強機體抗氧化能力[8]。目前，L-蘋果酸在養(yǎng)豬生產(chǎn)中的應用較少。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，日糧添加L-蘋果酸制品可以改善斷奶仔豬機體抗氧化能力，增強有氧代謝，提高骨骼肌中氧化型肌纖維的比例[9]，但是L-蘋果酸對斷奶仔豬腸道功能的影響尚不清楚。本試驗以斷奶仔豬為研究對象，在日糧中添加不同水平的L-蘋果酸制品，旨在研究L-蘋果酸對斷奶仔豬腸道健康和機體健康狀態(tài)的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計

試驗選取體重相近(平均體重(9.12±0.52)kg)的28日齡“杜×長×大”三元雜交斷奶仔豬192頭，隨機分為4個處理，每個處理6個重復，每個重復8頭豬(公母各半)。對照組飼喂玉米-豆粕型基礎(chǔ)日糧，3個處理組分別在基礎(chǔ)日糧中添加0.25%、0.5%和1%的L-蘋果酸制品，試驗期28 d。L-蘋果酸制品購自安徽雪郎生物科技股份有限公司，成分為20% L-蘋果酸和80%載體(以沸石粉為主)。日糧營養(yǎng)水平滿足NRC(2012)仔豬(11～25 kg)營養(yǎng)需要?；A(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平見表1。試驗在農(nóng)業(yè)農(nóng)村部飼料工業(yè)中心動物試驗基地(河北豐寧)進行，豬舍配備漏糞地板、不銹鋼料槽與乳頭式飲水器。在整個試驗期內(nèi)，仔豬自由采食和飲水。

1.2 樣品采集

于試驗14和28 d，每個重復內(nèi)選取1頭接近本欄平均體重的健康仔豬，前腔靜脈采集血液約5 mL，靜置30 min。4 ℃條件下3 500 r·min-1離心15 min，收集血清于-20 ℃保存。試驗結(jié)束時，每個處理選取6頭接近平均體重的仔豬，禁食12 h后肌肉注射戊巴比妥鈉進行完全麻醉，屠宰解剖，取出心、肝、脾、肺、腎，吸水紙吸干表面血液后稱重。器官指數(shù)計算公式：器官指數(shù)(g·kg-1)=器官質(zhì)量(g)/豬活體重(kg)。剖開腹腔，截取空腸中段約2 cm，用生理鹽水沖洗干凈后放入4%多聚甲醛溶液中固定；截取空腸中段約10 cm，排盡食糜后用生理鹽水沖洗干凈，使用載玻片輕輕刮取腸道內(nèi)部表層黏膜，于液氮中速凍后轉(zhuǎn)移至-80 ℃保存。

1.3 血清和空腸炎癥指標

使用相應的商業(yè)化試劑盒(南京建成生物工程研究所，中國)，按照說明書步驟測定血清和空腸黏膜中TNF-α、IFN-γ、IL-6和IL-10的含量。

1.4 空腸抗氧化能力測定

測定空腸黏膜SOD、CAT和GSH-Px的活性，以及T-AOC和MDA的含量。所用試劑盒購自南京建成生物工程研究所(中國)，依照試劑盒說明書進行操作。

1.5 腸道形態(tài)學分析

空腸樣品在4%甲醛溶液中固定24 h，經(jīng)過修塊、脫水、透明和石蠟包埋后將包埋有樣品的石蠟塊切成5 μm厚的切片，隨后經(jīng)蘇木精-伊紅染色后晾干、制片。使用倒置顯微鏡(日本Olympus公司，型號為CK40)對切片進行觀察和分析，在每個組織切片上選取至少10個典型視野(絨毛清晰完整)，利用Adobe Photoshop軟件(版本CS6)測量絨毛高度和隱窩深度。

表1 基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平(飼喂基礎(chǔ))

1.6 空腸黏膜蛋白提取和Western blot分析

取50～100 mg空腸黏膜樣品在液氮中充分研磨，加入0.5～1 mL RIPA組織裂解液(北京華興博創(chuàng)基因技術(shù)有限公司，中國)，提取總蛋白質(zhì)，使用BCA試劑盒(北京華興博創(chuàng)基因技術(shù)有限公司，中國)測定蛋白質(zhì)濃度。取約60 μg蛋白使用8%～10% SDS-PAGE進行分離，使用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)印到PVDF膜上。使用含有5% BSA的封閉液進行封閉，加一抗(1∶1 000 Claudin-3多克隆抗體，1∶1 000 ZO-2多克隆抗體，1∶200 Occludin多克隆抗體，1∶10 000 GAPDH單克隆抗體)，4 ℃孵育過夜，使用TBST緩沖液漂洗3次后，加入二抗山羊抗兔抗體(1∶15 000)室溫孵育1 h。經(jīng)TBST緩沖液洗滌3次后，使用Odyssey Clx熒光系統(tǒng)進行曝光和成像，最后通過ImageJ軟件對條帶進行分析并相對定量。

抗體來源：兔抗Claudin-3、ZO-2及Occludin多克隆抗體(Omnimabs公司產(chǎn)品，貨號分別為OM123251、OM111126、OM200043)；兔抗GAPDH單克隆抗體(Cell Signaling Technology公司產(chǎn)品，貨號2118)；二抗山羊抗兔抗體(Cell Signaling Technology公司產(chǎn)品，貨號5151)。

1.7 數(shù)據(jù)分析

使用Excel 2013整理所有原始數(shù)據(jù)，使用SAS(SAS 9. 2)的GLM程序?qū)υ囼灁?shù)據(jù)進行線性和二次回歸分析以及單因素方差分析，采用Duncan氏法進行多重比較檢驗，結(jié)果以“平均值±標準誤”表示，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著，0.05≤P≤0.10為有變化趨勢。

2 結(jié) 果

2.1 L-蘋果酸對斷奶仔豬生長性能和器官指數(shù)的影響

前期研究結(jié)果顯示，日糧添加L-蘋果酸制品對斷奶仔豬的平均日增重沒有顯著影響，斷奶仔豬的平均日采食量有升高的趨勢，飼料轉(zhuǎn)化效率有降低的趨勢(0.05≤P≤0.10)[9]。此外，如表2所示，日糧添加L-蘋果酸制品不影響斷奶仔豬心、肝、脾、肺以及腎重量。

表2 L-蘋果酸對斷奶仔豬器官指數(shù)的影響

2.2 L-蘋果酸對斷奶仔豬炎癥反應的影響

TNF-α、IFN-γ和IL-6是典型的促炎因子，IL-10是典型的抗炎因子。如表3所示，與對照組相比，日糧中添加1% L-蘋果酸制品顯著降低了試驗第14天仔豬血漿中TNF-α和IL-6的水平(P<0.01)，升高了IL-10的水平(P<0.01)；顯著降低了試驗第28天血漿中IL-6的水平(P<0.01)，升高了IL-10的水平(P<0.01)，表明日糧添加1% L-蘋果酸制品降低了斷奶仔豬的炎癥反應，而添加0.25%和0.5%的L-蘋果酸制品對抗炎能力產(chǎn)生了不利影響。

表3 L-蘋果酸對斷奶仔豬血清炎癥因子水平的影響

2.3 L-蘋果酸對斷奶仔豬空腸炎癥反應和抗氧化能力的影響

鑒于日糧添加1% L-蘋果酸制品顯著改善了斷奶仔豬的抗炎能力，本研究進一步關(guān)注了該濃度下小腸健康狀態(tài)的變化，并把1% L-蘋果酸制品組定義為L-蘋果酸組。如圖1所示，日糧中添加L-蘋果酸顯著降低了空腸黏膜中促炎因子TNF-α、IFN-γ和IL-6的水平(P<0.05或P<0.01)，升高了抗炎因子IL-10的水平(P<0.01,圖1A～D)。同時，添加L-蘋果酸顯著升高了空腸黏膜中SOD、CAT和GSH-Px的活性(P<0.05或P<0.01)，顯著提高了T-AOC(P<0.01)、顯著降低了MDA的水平(P<0.05,圖1E～I)。上述結(jié)果表明日糧添加1% L-蘋果酸改善了斷奶仔豬空腸的炎癥反應，增強了抗氧化能力。

*．P<0.05，**．P<0.01。下同*．P<0.05，**．P<0.01. The same as below圖1 L-蘋果酸對斷奶仔豬空腸炎癥反應和抗氧化能力的影響Fig.1 Effects of dietary supplementation of L-malic acid on the inflammatory response and antioxidant capacity in jejunum of weaned piglets

2.4 L-蘋果酸對斷奶仔豬空腸形態(tài)的影響

本研究利用HE染色，進一步分析了L-蘋果酸對空腸形態(tài)的影響。如圖2所示，與對照組相比，日糧添加L-蘋果酸顯著增加了空腸的絨毛高度(P<0.01)，對隱窩深度沒有顯著影響，顯著升高了絨毛高度與隱窩深度的比值(P<0.05)。

2.5 L-蘋果酸對斷奶仔豬空腸屏障功能的影響

本試驗通過對斷奶仔豬空腸黏膜緊密連接蛋白表達水平的分析，進一步研究了日糧添加L-蘋果酸對腸道屏障功能的影響。與對照組相比，L-蘋果酸組Occludin的蛋白表達水平有升高的趨勢(P=0.07)，Claudin-3的蛋白表達水平顯著降低(P<0.01)，ZO-2表達無顯著變化(圖3)。

A.對照組和L-蘋果酸組空腸HE染色(100×)；B.對照組和L-蘋果酸組的空腸絨毛高度；C.對照組和L-蘋果酸組的隱窩深度；D.對照組和L-蘋果酸組的絨毛高度與隱窩深度的比值A(chǔ). Jejunum HE staining in control group and L-malic acid group (100×); B. Villus height of jejunum in control group and L-malic acid group; C. Crypt depth of control group and L-malic acid group; D. Ratio of villus height to crypt depth in control and L-malic acid groups圖2 L-蘋果酸對斷奶仔豬空腸形態(tài)的影響Fig.2 Effects of dietary supplementation of L-malic acid on jejunal morphology in weaned piglets

A.Occludin多克隆抗體、ZO-2多克隆抗體和Claudin-3多克隆抗體蛋白免疫印記分析；B.Occludin、ZO-2和Claudin-3在對照組和L-蘋果酸組中的相對表達量A. Western blotting analysis of Occludin, ZO-2 and Claudin-3; B. The relative expression levels of Occludin, ZO-2 and Claudin-3 in control group and L-malic acid group圖3 L-蘋果酸對斷奶仔豬空腸緊密連接蛋白表達的影響Fig.3 Effects of dietary supplementation of L-malic acid on the tight junction protein expression in the jejunum of weaned piglets

3 討 論

小腸具有消化和吸收功能，腸道上皮是腸道的第一道防線[10]。同時，小腸也是重要的免疫器官。應激源可以通過激活腸道免疫系統(tǒng)，導致促炎細胞因子TNF-α和IL-6等一系列特殊細胞和信號分子的產(chǎn)生。隨著炎癥反應增強，腸道形態(tài)遭到破壞，黏膜和屏障功能受損，動物的采食量和飼料轉(zhuǎn)化效率降低[11-13]，并且斷奶應激對早期斷奶仔豬免疫功能和腸道屏障功能的影響會一直延續(xù)到成年[13]。因此，改善腸道健康對于提升斷奶仔豬的消化吸收能力、免疫功能以及全期的生長性能至關(guān)重要。

L-蘋果酸是自然界廣泛存在的一種有機酸，是動植物新陳代謝的產(chǎn)物。作為三羧酸循環(huán)中間體，L-蘋果酸可以促進NADH從細胞質(zhì)到線粒體的轉(zhuǎn)運，提高老齡大鼠電子傳遞鏈酶的活性并提高還原性谷胱甘肽的水平，增強機體抗氧化能力，緩解脂質(zhì)過氧化狀態(tài)[14]。與模式動物上的研究結(jié)果相一致，本研究中，日糧添加L-蘋果酸提高了空腸黏膜SOD、CAT和GSH-Px的活性，提高了T-AOC，顯著降低了MDA的水平，意味著斷奶仔豬腸道的抗氧化能力得到增強。

有研究發(fā)現(xiàn)，仔豬斷奶后第2天腸道CD4+和CD8+T淋巴細胞數(shù)量急劇增加，空腸中部炎癥細胞因子TNF-α、IL-6、白細胞介素-1β(IL-1β)以及白細胞介素-8(IL-8)的mRNA表達水平升高[15-16]。此外，斷奶應激可以通過激活免疫細胞和下調(diào)空腸黏膜I類主要組織相容性復合體的表達導致基質(zhì)金屬蛋白酶局部表達增加，造成絨毛萎縮[15,17]。在本研究中，日糧添加1%的L-蘋果酸制品顯著降低了空腸黏膜促炎因子TNF-α、IFN-γ和IL-6的水平，升高了抗炎因子IL-10的水平。IFN-γ和TNF-α等促炎因子主要介導細胞免疫應答作用，是臨床上常見的抗病毒細胞因子[18]。IL-6由白細胞產(chǎn)生又在白細胞間發(fā)揮作用，作為主要炎癥細胞因子，在機體感染后的病理生理過程中起到重要作用[19]。而幾乎所有淋巴細胞均能合成IL-10，IL-10等抗炎因子主要介導體液免疫。根據(jù)本試驗結(jié)果分析可知，日糧中添加L-蘋果酸可能通過增強細胞免疫和體液免疫來提高空腸的免疫能力，從而降低斷奶仔豬腸道炎癥反應，這很可能跟空腸抗氧化能力的提升有關(guān)。值得關(guān)注的是，添加1%的L-蘋果酸制品同樣降低了第14天血漿中TNF-α和IL-6的水平，顯著降低了第28天血漿中IL-6的水平，升高了第14和28天血漿中IL-10的水平，說明添加1%的L-蘋果酸制品可能通過增強腸道的抗炎能力緩解機體的炎癥反應。但令人迷惑的是，與對照組相比，日糧添加0.25%和0.5%的L-蘋果酸制品對機體抗炎能力產(chǎn)生了不利影響，其中的機制有待進一步的研究。

有研究報道，增強小腸的抗炎能力可以減輕腸道損傷，提高小腸絨毛高度[20]。微絨毛是腸黏膜上皮的特殊結(jié)構(gòu)，大量的上皮細胞有營養(yǎng)吸收的功能[21]。研究人員指出，氧化應激導致了十二指腸細胞周轉(zhuǎn)減少、微絨毛高度降低、部分微絨毛糜爛[22]。本研究顯示，添加L-蘋果酸顯著提高了空腸絨毛高度，升高了絨毛高度與隱窩深度的比值。腸道絨毛高度和隱窩深度作為腸道物理屏障功能的重要組成部分，與營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收密切相關(guān)[23]。絨毛高度/隱窩深度反映了斷奶仔豬腸道功能狀況，比值上升表示腸道健康且消化能力較強，下降表示腸道黏膜受損，消化吸收功能降低[24]。因此，L-蘋果酸能夠改善空腸形態(tài)，提高腸道的消化吸收能力，這可能得益于空腸抗炎能力提升和氧化應激的緩解。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，仔豬斷奶應激導致過多活性氧的釋放，引發(fā)促炎細胞因子的上調(diào)，增強腸道通透性[25]，這表明氧化應激對仔豬腸道屏障功能也會產(chǎn)生不利影響。本研究中，添加L-蘋果酸顯著降低了斷奶仔豬空腸黏膜Claudin-3的蛋白表達水平，Occludin的蛋白表達水平有升高的趨勢。Occludin介導了緊密連接鏈分支點的形成和穩(wěn)定，并有助于維持上皮屏障的完整性[26]。緊密連接調(diào)節(jié)的細胞旁通透性的主要決定因素是Claudins，Claudin-3的降解是腸道屏障功能受損的典型特征[27]。細胞因子能夠通過與細胞凋亡無關(guān)的信號通路直接改變緊密連接的組成和結(jié)構(gòu)[28]。緊密連接蛋白能夠適應細胞因子的刺激，在結(jié)構(gòu)完整的情況下具有分子重塑的潛力[29]。因此，在本研究中，Claudin-3和Occludin蛋白表達水平的變化可能與L-蘋果酸引起的炎癥因子水平的變化有關(guān)，但是細胞因子調(diào)節(jié)緊密連接的過程尚不清楚，L-蘋果酸對腸道屏障功能的影響還需要進一步的研究。

4 結(jié) 論

本研究表明，日糧添加1% L-蘋果酸制品可以降低斷奶仔豬的炎癥反應，改善空腸炎癥反應和氧化應激狀態(tài)，影響空腸形態(tài)和屏障功能，進而發(fā)揮改善腸道健康的作用。