劉志豪,賈 鵬,賴(lài) 琦,董利鋒,吳秋玨,高彥華,田忠紅,刁其玉*
(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所/反芻動(dòng)物及其幼畜營(yíng)養(yǎng)代謝中美聯(lián)合研究中心,北京 100081;2.河南科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,洛陽(yáng) 471003; 3.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,成都 610041;4.山東銀香偉業(yè)集團(tuán)有限公司,菏澤 274000)
人類(lèi)活動(dòng)向環(huán)境中排放大量的溫室氣體是全球變暖和極端氣候問(wèn)題的主要原因。溫室氣體主要包括二氧化碳(CO2)、甲烷(CH4)、氧化亞氮(N2O)等[1],其中CH4的排放量雖然遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于CO2,但是造成的危害性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于CO2,其增溫趨勢(shì)是CO2的28倍[2]。而反芻家畜胃腸道CH4排放是人類(lèi)農(nóng)業(yè)活動(dòng)產(chǎn)生的最主要的CH4排放源之一,其約占農(nóng)業(yè)CH4總排放量的59%,約占世界CH4總排放量的 17%,是絕對(duì)不可忽視的一大來(lái)源[3-4]。反芻動(dòng)物瘤胃內(nèi)微生物降解生成揮發(fā)性脂肪酸時(shí)產(chǎn)生H2和CO2,產(chǎn)甲烷菌可利用H2生成CH4[5],這部分CH4將造成奶牛6%~10%的能量損失[6]。因此,降低反芻動(dòng)物瘤胃CH4排放對(duì)于節(jié)約飼料能源和減緩全球變暖均有著重要意義。
我國(guó)作為奶牛養(yǎng)殖大國(guó),目前奶牛瘤胃CH4排放規(guī)律方面已有大量研究,王貝[7]采用六氟化硫(SF6)示蹤技術(shù)對(duì)泌乳早期(391.86 g·d-1)、泌乳中期(399.8 g·d-1)和泌乳后期(395.61 g·d-1)的奶牛瘤胃CH4排放量進(jìn)行了測(cè)定,李斌昌[8]對(duì)9月齡(97~118 g·d-1)、12月齡(119~159 g·d-1)、15月齡(194~230 g·d-1)月齡后備奶牛CH4排放量進(jìn)行了測(cè)定,發(fā)現(xiàn)隨著月齡增加,CH4排放量逐漸增加;王小林[9]則對(duì)犢牛(130.6 L·d-1)、青年牛(261.7 L·d-1)和干奶牛(340.5 L·d-1)的 CH4排放進(jìn)行了測(cè)定,發(fā)現(xiàn)不同生理階段奶牛隨著年齡和體重增加,CH4排放量極顯著增加。目前,國(guó)內(nèi)主流的CH4測(cè)定方法為呼吸室測(cè)定和SF6示蹤技術(shù)測(cè)定,與前兩者相比,GreenFeed測(cè)定系統(tǒng)具有自動(dòng)化、無(wú)創(chuàng)、非侵入性的特點(diǎn),可用于大批量動(dòng)物的測(cè)定,而我國(guó)通過(guò)GreenFeed測(cè)定系統(tǒng)對(duì)自然條件下奶牛CH4排放的研究尚處于空白,尤其是對(duì)于處于干奶期的不同胎次的荷斯坦奶牛的研究較少。干奶期在奶牛生產(chǎn)過(guò)程中至關(guān)重要,此階段牧場(chǎng)往往會(huì)調(diào)整飼糧配方,奶牛的采食量也會(huì)出現(xiàn)降低,這兩者的變化會(huì)對(duì)瘤胃內(nèi)溫室氣體排放量產(chǎn)生顯著的影響。假設(shè)干奶牛的CH4排放量隨著胎次和體重的增加而增加,本研究擬通過(guò)GreenFeed測(cè)定系統(tǒng),系統(tǒng)測(cè)定不同胎次的干奶牛的CH4排放和瘤胃發(fā)酵指標(biāo),在此基礎(chǔ)上建立瘤胃CH4預(yù)測(cè)模型,旨在探究奶牛瘤胃CH4排放規(guī)律,為提高奶牛能量利用效率和開(kāi)發(fā)減排調(diào)控方法提供支撐。
本試驗(yàn)于2020年10—11月在山東省菏澤市曹縣銀香偉業(yè)公司第三國(guó)際牧場(chǎng)完成。
本試驗(yàn)選取48頭體況健康,處于干奶期的荷斯坦奶牛,按照胎次將試驗(yàn)動(dòng)物分為4個(gè)處理組,每組12頭牛,4個(gè)處理組如下:一胎牛組、二胎牛組、三胎牛組、四胎及以上組。日糧配方參照NRC(2001)中干奶牛營(yíng)養(yǎng)需要配置,以全混合日糧(TMR)形式飼喂,日糧的組成及其營(yíng)養(yǎng)成分見(jiàn)表1。本試驗(yàn)預(yù)試期5 d,正試期40 d(產(chǎn)前60 d~產(chǎn)前15 d)。
表1 試驗(yàn)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))
試驗(yàn)所有用牛均采用舍飼,每天喂料兩次(07:00和15:00),自由采食和飲水,每天清理剩料,定期清理水槽,保證飼料和飲水的清潔性。所有奶牛的飼喂方式、飼養(yǎng)環(huán)境和飼糧均保持一致。
1.4.1 GreenFeed測(cè)定系統(tǒng) 該系統(tǒng)由美國(guó)某公司研發(fā),配備有頭室、抽風(fēng)機(jī)和顆粒料飼養(yǎng)器,可以在奶牛正常進(jìn)食條件下,測(cè)定奶牛排出的CH4,本研究使用的GreenFeed系統(tǒng)為我國(guó)引進(jìn)的第一套設(shè)備。當(dāng)奶牛采食時(shí),通過(guò)激光束保證牛的頭部處于正確位置,抽氣扇以大約20~40 L·s-1的速度從動(dòng)物的鼻子吸入空氣,系統(tǒng)內(nèi)的非色散紅外分析儀會(huì)連續(xù)測(cè)量空氣中的CH4濃度,同時(shí)測(cè)量空氣流量、溫度和相對(duì)濕度。每次動(dòng)物訪問(wèn)GreenFeed測(cè)定系統(tǒng)時(shí),CH4排放量計(jì)算公式如下:
CH4volume(L)=visit time (min)[CH4animal (%)-CH4background (%)]×air flow (L·min-1)[10]
式中:CH4volume——奶牛甲烷的排放量;
visit time——?jiǎng)游餃y(cè)定時(shí)間;
CH4animal——測(cè)定期間甲烷的平均濃度;
CH4background——背景空氣(即測(cè)定系統(tǒng)中沒(méi)有動(dòng)物訪問(wèn)時(shí))的甲烷的平均濃度;
air flow——測(cè)定期間氣體的流速;
GreenFeed測(cè)定系統(tǒng)收集的數(shù)據(jù)包括動(dòng)物測(cè)定次數(shù)、每次測(cè)定時(shí)間和持續(xù)時(shí)間、背景環(huán)境中的溫度和濕度以及測(cè)定時(shí)的CH4濃度,并將所獲得數(shù)據(jù)實(shí)時(shí)上傳至服務(wù)器,由測(cè)定系統(tǒng)生產(chǎn)商進(jìn)行數(shù)據(jù)處理后得到最終的測(cè)定結(jié)果。
1.4.2 基本數(shù)據(jù)測(cè)定 體重的測(cè)定:于正式試驗(yàn)結(jié)束前5 d,于晨飼前測(cè)定每頭奶牛的體重。
干物質(zhì)采食量的測(cè)定:在整個(gè)試驗(yàn)期間,每天記錄投料量和剩料量,計(jì)算每頭奶牛的日采食量,通過(guò)對(duì)試驗(yàn)期間采集日糧的干物質(zhì)含量測(cè)定,計(jì)算出奶牛每天的干物質(zhì)采食量。
1.4.3 瘤胃液采集與瘤胃發(fā)酵指標(biāo)測(cè)定 于正式試驗(yàn)結(jié)束前3 d,晨飼后3 h通過(guò)口腔導(dǎo)管的方式采集瘤胃液樣品,使用便攜式pH計(jì)立即測(cè)定pH,隨即將所取的瘤胃液樣品用4層紗布過(guò)濾后,分裝于2個(gè)10 mL離心管,保存于-20 ℃,留待測(cè)定揮發(fā)性脂肪酸,氨態(tài)氮和微生物蛋白。
其中揮發(fā)性脂肪酸(VFA)采用氣相色譜儀(6890 N, Agilent,美國(guó))測(cè)定。色譜柱為HP19091 N-213型毛細(xì)管柱,進(jìn)樣口溫度為200 ℃,載氣為高純氮?dú)?,流量?.0 mL·min-1?;鹧鏆潆x子檢測(cè)器的溫度為250 ℃[11]。
氨態(tài)氮(NH3-N):水楊酸鈉-次氯酸鈉比色法測(cè)定[12]。
微生物蛋白(MCP):使用嘌呤堿基法進(jìn)行測(cè)定[13]。
1.4.4 瘤胃甲烷排放測(cè)定 CH4排放量的測(cè)定采用GreenFeed測(cè)定系統(tǒng)進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定過(guò)程中,保持每頭牛每天最多可訪問(wèn)GreenFeed測(cè)定系統(tǒng)4次,每天最少訪問(wèn)2次,每次持續(xù)測(cè)量時(shí)間在3 min以上,每次訪問(wèn)間隔6 h。為保證數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性,每頭牛需測(cè)量30次以上,以其平均值為CH4排放量[14-16]。
1.4.5 飼料樣品的采集與分析 于正試期第15~17天,用四分法采集飼料樣品,于65 ℃烘箱中烘干48 h后,回潮24 h制成風(fēng)干樣,粉碎后過(guò)40目網(wǎng)篩留待測(cè)定干物質(zhì)(dry matter, DM)、粗蛋白質(zhì)(crude protein, CP)、粗脂肪(ether extract, EE)、粗灰分(Ash)、中性洗滌纖維(neutral detergent fiber, NDF)、酸性洗滌纖維(acid detergent fiber, ADF)和總能(gross energy, GE),測(cè)定方法參照《飼料分析及飼料質(zhì)量檢測(cè)技術(shù)》[17]。
通過(guò)Excel 2020進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,采用SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)正態(tài)分布檢驗(yàn)(正態(tài)Q-Q圖和正態(tài)P-P圖)和方差齊性檢驗(yàn),剔除異常值后進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA),采用Duncan氏法進(jìn)行差異顯著性分析,采用Pearson相關(guān)分析進(jìn)行相關(guān)性分析,采用SPSS構(gòu)建線性回歸模型,試驗(yàn)結(jié)果以P<0.05為差異顯著,以P>0.05為差異不顯著。
由表2可知,各個(gè)胎次的年齡之間均有顯著差異(P<0.05),三胎和四胎及以上組干奶牛的體重、代謝體重顯著高于一胎組和二胎組(P<0.05),而一胎和二胎組之間,三胎和四胎及以上組之間無(wú)顯著差異(P>0.05)。試驗(yàn)干奶牛的體重隨著年齡的增加而增加,代謝體重與體重變化規(guī)律一致,干物質(zhì)采食量的估測(cè)數(shù)據(jù)為12.38 kg·d-1。
表2 試驗(yàn)中干奶?;倔w況
如表3所示,三胎組牛的NH3-N顯著高于一胎組(P<0.05),與二胎和四胎及以上組之間沒(méi)有顯著差異(P>0.05),一胎、二胎、四胎及以上組的NH3-N也沒(méi)有顯著差異(P>0.05);一胎和二胎牛的瘤胃微生物蛋白顯著高于四胎及以上組(P<0.05),與三胎組無(wú)顯著差異(P>0.05),一胎和二胎之間,三胎和四胎及以上組之間均無(wú)顯著差異(P>0.05);一胎組瘤胃中戊酸顯著低于三胎組(P<0.05),與二胎和四胎之間無(wú)顯著差異(P>0.05)。此外,瘤胃中pH、TVFA、乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、異戊酸和乙丙比在各個(gè)胎次之間均無(wú)顯著差異(P>0.05)。
表3 胎次對(duì)干奶牛瘤胃發(fā)酵指標(biāo)的影響
由表4可知,干奶牛的CH4排放量的平均值為336 g·d-1,最大值為477 g·d-1,最小值為250 g·d-1,中位數(shù)為334 g·d-1。CH4/代謝體重的平均值為2.31 g·kg-1,最大值為3.04 g·kg-1,最小值為1.86 g·kg-1,中位數(shù)為2.29 g·kg-1。
表4 干奶牛瘤胃甲烷產(chǎn)量
由圖1可知,干奶牛的瘤胃CH4排放量在一胎組最低,三胎和四胎及以上組瘤胃CH4排放量顯著高于一胎組(P<0.05),二胎、三胎和四胎及以上組之間沒(méi)有顯著差異(P>0.05),一胎組和二胎組之間沒(méi)有顯著差異(P>0.05);各處理組之間的CH4排放量/代謝體重?zé)o顯著差異(P>0.05)。
*. 表示相關(guān)性顯著(P<0.05),**表示相關(guān)性極顯著(P<0.01)*. Indicates significant correlation, ** indicates a extremely significant correlation圖1 胎次對(duì)干奶牛甲烷排放量的影響Fig.1 The effect of parity on methane emissions of dry dairy cows
由表5可知,干奶牛的CH4排放量與胎次和體重均有著極顯著的相關(guān)關(guān)系(P<0.01),而與TVFA、乙酸、丙酸和乙丙比之間沒(méi)有顯著的相關(guān)關(guān)系(P>0.05)。對(duì)CH4排放量和體重進(jìn)行回歸分析可得到方程(圖2)。
表5 干奶牛甲烷排放量與體況及瘤胃發(fā)酵特征的相關(guān)性
圖2 基于體重的干奶牛CH4排放量預(yù)測(cè)模型Fig.2 Prediction equations of enteric methane emissions based on body weight
瘤胃pH是反映瘤胃酸堿平衡狀況和瘤胃微生物所處環(huán)境是否正常的重要生理指標(biāo),正常范圍在6.2~7.0之間[18],本試驗(yàn)中各個(gè)處理組干奶牛瘤胃pH均處在正常范圍。NH3-N是微生物合成菌體蛋白的前體物質(zhì),瘤胃內(nèi)氨態(tài)氮濃度反映瘤胃內(nèi)氮代謝的平衡情況,其質(zhì)量濃度范圍在6.58~36.7 mg·dL-1內(nèi)較佳[19-20],本試驗(yàn)各個(gè)處理組干奶牛瘤胃NH3-N均在此范圍內(nèi),能夠滿足微生物蛋白合成所需。瘤胃NH3-N濃度反映了瘤胃內(nèi)微生物對(duì)日糧蛋白的降解速度,其含量既受到日糧組成的影響,也與瘤胃內(nèi)微生物的利用速率密切相關(guān)[21]。本試驗(yàn)中三胎牛的瘤胃氨態(tài)氮濃度最高,顯著高于一胎牛,這可能是由于一胎組試驗(yàn)牛的瘤胃微生物利用氨態(tài)氮合成更多的微生物蛋白,試驗(yàn)測(cè)定的結(jié)果也表明一胎組牛瘤胃微生物蛋白含量高于三胎組牛。瘤胃揮發(fā)性脂肪酸是反芻動(dòng)物能量利用過(guò)程中的重要產(chǎn)物,主要包括乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸等,是反芻動(dòng)物能量的主要來(lái)源[22]。瘤胃揮發(fā)性脂肪酸主要受日糧組成、日糧加工方式、飼喂方式等的影響[23]。本試驗(yàn)中各個(gè)處理組的總揮發(fā)酸、乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、異戊酸均無(wú)顯著差異,這可能是由于試驗(yàn)中所有干奶牛均采用同樣的日糧和飼喂方式,而戊酸雖然在一胎和三胎組之間出現(xiàn)顯著性差異,但其占總揮發(fā)性脂肪酸的比例極小,戊酸的含量和比例也處在合理的區(qū)間范圍內(nèi)。Khazanehei等[24]對(duì)二胎和三胎及以上干奶牛的研究也表明,胎次對(duì)乙酸、丙酸、丁酸和其他揮發(fā)性脂肪酸沒(méi)有影響,但其研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn),二胎牛的總揮發(fā)性脂肪酸顯著高于三胎及以上牛。本試驗(yàn)中,各個(gè)胎次干奶??倱]發(fā)性脂肪酸之間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異,但一胎牛的總揮發(fā)性脂肪酸最高,這可能是由于與頭胎牛相比,經(jīng)產(chǎn)牛每次采食速度更快,反芻效率更高,咀嚼等量飼料所需時(shí)間更少[25],在短時(shí)間內(nèi)采食大量的飼料和有效咀嚼可能會(huì)增加瘤胃通過(guò)率,從而通過(guò)該途徑增加瘤胃通過(guò)VFA的能力[24]。
CH4是反芻動(dòng)物攝入的日糧在瘤胃中微生物發(fā)酵作用下產(chǎn)生的一種溫室氣體。本試驗(yàn)使用國(guó)際先進(jìn)的GreenFeed測(cè)定系統(tǒng)測(cè)定出干奶牛的CH4排放量處于250~477 g·d-1,平均CH4為336 g·d-1。Kasuya和Takahashi[26]的研究表明,干奶牛的CH4排放量處于285.2~396.5 L·d-1,其測(cè)定的范圍小于本試驗(yàn)結(jié)果,這可能是因?yàn)楸狙芯克鶞y(cè)定的奶牛涉及到各個(gè)胎次,體重上有著更大的差異。本研究發(fā)現(xiàn),隨著胎次增加,干奶牛的瘤胃CH4排放量也逐漸增加,尤其是三胎組和四胎及以上組干奶牛瘤胃CH4排放量顯著高于一胎組,而用單位代謝體重來(lái)衡量CH4排放強(qiáng)度時(shí),發(fā)現(xiàn)各個(gè)胎次組之間的CH4/代謝體重均無(wú)顯著差異。Neel等[27]的研究也表明,不同體重的牛其瘤胃CH4排放量在用單位代謝體重表示時(shí)其差異消失。這表明干奶牛瘤胃CH4排放量的差異可能是由于體重差異所造成的。Huhtanen等[28]基于瘤胃功能建模發(fā)現(xiàn),單位干物質(zhì)采食量CH4排放量的增加與飼料在瘤胃中的滯留時(shí)間、有機(jī)物消化率的增強(qiáng)和微生物細(xì)胞合成效率降低有關(guān)。較大體重的奶牛有著更大的瘤胃容量,減少了攝入對(duì)日糧在瘤胃中平均停留時(shí)間的影響,導(dǎo)致平均瘤胃停留時(shí)間增加。由于奶牛攝入的日糧中較易發(fā)酵部分先發(fā)酵,平均瘤胃停留時(shí)間的增加將會(huì)導(dǎo)致日糧纖維素在瘤胃中被消化的比例更大,而更大比例的瘤胃纖維素消化則會(huì)導(dǎo)致CH4產(chǎn)量增加[29]。
反芻動(dòng)物瘤胃CH4排放量的精準(zhǔn)測(cè)定是核算溫室氣體排放和研究減排措施的基礎(chǔ),目前測(cè)定反芻動(dòng)物瘤胃CH4排放量的方法主要包括直接測(cè)定法(呼吸代謝室法、六氟化硫示蹤法、GreenFeed測(cè)定系統(tǒng)等)和間接測(cè)定法(CO2示蹤法、嗅探器法、激光檢測(cè)器法等)[16,30],但無(wú)論哪種測(cè)定方法,在實(shí)際生產(chǎn)中測(cè)定CH4排放量都需要耗費(fèi)大量人力物力,無(wú)法對(duì)所有動(dòng)物全部進(jìn)行測(cè)定。因此,需要根據(jù)反芻動(dòng)物實(shí)測(cè)的CH4排放數(shù)據(jù),應(yīng)用統(tǒng)計(jì)方法建立的預(yù)測(cè)模型,核算排放因子,來(lái)預(yù)測(cè)動(dòng)物的CH4排放量。本試驗(yàn)結(jié)果表明,干奶牛的CH4排放量與胎次(相關(guān)系數(shù)=0.47)和體重(相關(guān)系數(shù)=0.61)之間均存在著極顯著的正相關(guān)關(guān)系。Bird-Gardine等[31]對(duì)安格斯母牛和公牛的CH4排放量進(jìn)行測(cè)定,發(fā)現(xiàn)其瘤胃CH4排放量與體重之間有著顯著的相關(guān)性,相關(guān)系數(shù)分別為0.74和0.66;Herd等[32]測(cè)定41頭安格斯牛的CH4排放量,也得到了相似的結(jié)果,相關(guān)系數(shù)為0.47;Donoghue等[33]測(cè)定了不同生長(zhǎng)階段的安格斯牛的CH4排放量,發(fā)現(xiàn)其與斷奶(相關(guān)系數(shù)0.53)、一歲(相關(guān)系數(shù)0.61)和成年后(相關(guān)系數(shù)0.56)的體重均有顯著的相關(guān)性;Jonker等[34]在母羊和羔羊上也發(fā)現(xiàn)了相似的結(jié)果,其利用兩種呼吸室測(cè)定CH4,發(fā)現(xiàn)CH4排放量與體重呈顯著的正相關(guān),相關(guān)系數(shù)為0.31~0.61。這表明反芻動(dòng)物體重越大,其CH4排放量就越高。在CH4排放量和體重呈極顯著正相關(guān)的基礎(chǔ)上,基于奶牛體重建立的預(yù)測(cè)模型的決定系數(shù)為R2=0.46。Bird-Gardine等[31]在安格斯母牛和公牛也基于體重建立了瘤胃CH4排放量線性預(yù)測(cè)模型,決定系數(shù)分別為0.46和0.26;Huhtanen等[35]在奶牛上的研究也得出CH4排放量與體重之間的預(yù)測(cè)模型決定系數(shù)R2=0.32;Jiao等[36]基于6、12、18和22月齡奶牛的甲烷排放量和體重建立預(yù)測(cè)模型發(fā)現(xiàn)其決定系數(shù)分別為0.26、0.34、0.18和0.45;董利鋒等[37]對(duì)后備奶牛的研究也表明基于體重及建立的CH4預(yù)測(cè)模型決定系數(shù)為0.42。與單一的指標(biāo)相比,增加預(yù)測(cè)模型中變量數(shù)量,建立多元預(yù)測(cè)模型有助于提高模型的決定系數(shù),Jenstch等[38]基于日糧中各種可消化營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)建立的四元一次模型決定系數(shù)達(dá)到0.896,而Jiao等[36]基于代謝能攝入量、中性洗滌纖維采食量和粗飼料比例建立的三元一次模型決定系數(shù)達(dá)到0.95,具有較高的模型精度。但在實(shí)際生產(chǎn)中,想要大量精確的測(cè)得這些指標(biāo)十分困難,因此有必要使用易于獲得的指標(biāo)來(lái)構(gòu)建高精度預(yù)測(cè)模型。本試驗(yàn)基于舍飼生理狀態(tài)和干奶期生理階段的荷斯坦奶牛,建立適用于我國(guó)典型養(yǎng)殖模式的奶牛CH4排放量預(yù)測(cè)模型,為我國(guó)精準(zhǔn)核算溫室氣體排放提供一定的數(shù)據(jù),也為研究分析出最佳飼料配方及相關(guān)的減排措施提供參考。
在本試驗(yàn)條件下,干奶牛CH4排放量處于250~477 g·d-1,平均CH4排放量為336 g·d-1,隨著胎次的增加,CH4排放量呈增加的趨勢(shì),一胎最低,四胎最高。此外,CH4排放量與胎次和體重之間呈極顯著的正相關(guān),基于體重建立的線性預(yù)測(cè)模型能夠用于反映和評(píng)估干奶時(shí)期奶牛的CH4排放量。