影響禽流感HA/HI試驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性的因素分析及糾正措施

劉青彥，張艷娜，宋智慧，呂文君

（河南省舞鋼市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，河南 舞鋼 462599）

高致病性禽流感是由正粘病毒科流感病毒屬A 型流感病毒引起的以禽類為主的急性傳染病，禽流感病毒顆粒表面的血凝素蛋白具有識(shí)別紅細(xì)胞表面受體并使紅細(xì)胞凝集的特性，因此，禽流感抗體可以通過(guò)HA/HI（血凝/血凝抑制）試驗(yàn)來(lái)檢測(cè)。筆者在多年的檢測(cè)工作中分析了一系列影響HA/HI 試驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性的因素?，F(xiàn)將這些因素加以總結(jié)，概述如下，希望為從事獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的從業(yè)者提供參考。

1 影響HA/HI試驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性的因素分析

1.1 待檢樣品不合格

樣品在采集、運(yùn)輸、保存等環(huán)節(jié)疏漏，導(dǎo)致樣品腐敗、溶血被污染或樣品編號(hào)弄混。

1.2 PBS液不合格

PBS液pH值在7.2時(shí)紅細(xì)胞沉降最好，所以PBS液一定要用鹽酸或氫氧化鈉溶液調(diào)pH 值至7.2。PBS 液最好現(xiàn)用現(xiàn)配，通常以新開(kāi)啟的生理鹽水代替PBS 液，也基本可避免這些情況。

1.3 1%紅細(xì)胞不合格

①1%紅細(xì)胞并非來(lái)自未經(jīng)免疫的健康公雞；②制作1%紅細(xì)胞的某一環(huán)節(jié)（采集、洗滌過(guò)程中或盛裝容器不干凈）被污染造成非特異性免疫，影響試驗(yàn)結(jié)果；③紅細(xì)胞在洗滌過(guò)程中，離心機(jī)轉(zhuǎn)速設(shè)置過(guò)高，導(dǎo)致紅細(xì)胞因強(qiáng)大離心力而被壓擠破壞；④配制1%紅細(xì)胞時(shí)把本該用的PBS液錯(cuò)用成蒸餾水，導(dǎo)致紅細(xì)胞因滲透壓差而崩解破壞。

1.4 HA試驗(yàn)操作不當(dāng)?shù)葘?dǎo)致抗原效價(jià)測(cè)定不準(zhǔn)確

①滴加抗原到反應(yīng)板上時(shí)滴頭未潤(rùn)濕導(dǎo)致抗原效價(jià)偏低，從而導(dǎo)致測(cè)得結(jié)果偏高；②滴頭深入抗原液面下過(guò)深，抗原倍比稀釋時(shí)又未更換滴頭，從而導(dǎo)致測(cè)得抗原效價(jià)偏高，因而測(cè)得待檢血清抗體偏低；③在抗原倍比稀釋過(guò)程中移液器未插入液面下，導(dǎo)致氣泡產(chǎn)生；④1%紅細(xì)胞不合格；⑤已測(cè)過(guò)效價(jià)的抗原再次使用時(shí)直接按原來(lái)的效價(jià)配制4單位抗原，導(dǎo)致4單位抗原濃度偏低，從而使測(cè)得抗體效價(jià)偏高（每次試驗(yàn)都需重新測(cè)定抗原效價(jià)）；⑥滴加紅細(xì)胞前未將其搖勻；⑦反應(yīng)時(shí)間過(guò)短，結(jié)果出現(xiàn)太慢，或反應(yīng)時(shí)間太長(zhǎng)，或溫度太高導(dǎo)致紅細(xì)胞解凝，影響結(jié)果觀察（溫度最好控制在20～25 ℃，反應(yīng)時(shí)間在30 min左右）。

1.5 計(jì)算錯(cuò)誤導(dǎo)致所配4HAU抗原不準(zhǔn)

雖然測(cè)得的抗原效價(jià)準(zhǔn)確，但因計(jì)算錯(cuò)誤或者雖計(jì)算正確但配制環(huán)節(jié)中出錯(cuò)都可能導(dǎo)致所配制的4HAU 抗原不準(zhǔn)。

1.6 HI試驗(yàn)過(guò)程操作不當(dāng)?shù)确矫嬖?/h3>

①因血清倍比稀釋過(guò)程中滴頭未插入液面下導(dǎo)致氣泡產(chǎn)生或吹吸次數(shù)過(guò)少，混合不均勻；②血清倍比稀釋過(guò)程中因用多道移液器未注意到個(gè)別滴頭是否松動(dòng)導(dǎo)致吸液量不夠，或者樣品呈果凍樣無(wú)法吸??；③滴加4HAU 抗原時(shí)因操作不熟練導(dǎo)致跳孔、串孔及液滴兒飛濺；④再加另一種樣品時(shí)未更換滴頭；⑤滴加4HAU 抗原或紅細(xì)胞后未立即震蕩混勻，或震蕩時(shí)間過(guò)長(zhǎng)；⑥未按操作規(guī)程，導(dǎo)致加樣順序錯(cuò)誤（即滴加抗原和滴加紅細(xì)胞順序顛倒）；⑦滴加紅細(xì)胞前未將其搖勻；⑧反應(yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或溫度過(guò)高導(dǎo)致已凝集的紅細(xì)胞解凝。

2 糾正措施

進(jìn)行4HAU抗原校正，其方法如下：①在反應(yīng)板的1～4孔內(nèi)加入25 ul的生理鹽水；②吸取25 ul 4HAU抗原加入第一孔，然后倍比稀釋到第4孔；③再吸入25 ul 1%雞紅細(xì)胞懸液依次加入1～4 孔；④在微量振蕩器上振蕩1 min，混合均勻；⑤室溫靜置30 min后觀察結(jié)果；⑥結(jié)果觀察：第1孔、第2孔完全凝集，第3孔紅細(xì)胞50%沉淀，第4孔完全沉淀，說(shuō)明所配4HAU 抗原準(zhǔn)確，校正成立。但如果出現(xiàn)第2 孔紅細(xì)胞50%沉淀，則說(shuō)明所配的4HAU 抗原濃度低一倍，這時(shí)需再向所配的4HAU抗原溶液中添加一倍量的抗原。如果出現(xiàn)第4 孔紅細(xì)胞50%沉淀，則說(shuō)明所配的4HAU 抗原濃度高一倍，這時(shí)需再向所配的4HAU 抗原溶液中添加一倍量的PBS液，不過(guò)這可能導(dǎo)致4HAU配得太多而造成浪費(fèi)。一般建議先少量配制，根據(jù)校正結(jié)果再適量配制。4HAU抗原校正可謂是驗(yàn)證所配4HAU（濃度）是否準(zhǔn)確的“定海神針”?！?/p>