非編碼RNA 對肺癌中鐵死亡調控作用的研究進展

杜林，陳峰，徐醫(yī)軍 綜述，張遜 審校

（天津市胸科醫(yī)院胸外科，天津 300222）

非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNA）是所有不被翻譯成蛋白質的功能性RNA 的統(tǒng)稱，按照核苷酸大小分類分為小RNA（miRNA）、長鏈非編碼RNA（lncRNA）和環(huán)狀RNA（circRNA）[1-3]。ncRNA 可通過調控mRNA 來影響相關靶基因的表達，各種ncRNA 之間也存在相互作用。在2012 年，研究人員意外發(fā)現(xiàn)了一種依賴Fe2+催化作用的細胞程序性死亡方式，將其命名為細胞鐵死亡[4]。鐵死亡的生物學特征主要表現(xiàn)為線粒體萎縮、膜密度增加、線粒體嵴減少以及活性氧簇（ROS）聚集等[5]。鐵死亡的發(fā)生機制包括：（1）Fe2+的代謝：轉鐵蛋白受體（transferring receptor，TFR）介導Fe2+的轉運，鐵蛋白的兩條肽鏈重鏈和輕鏈可以調控Fe2+的儲存。（2）脂代謝異常和ROS 的積累：脂氧合酶（LOX）催化不飽和脂肪酸的過氧化并影響鐵死亡，核因子e2 相關因子2-kelch 樣ECH 關聯(lián)蛋白1（NRF2-KEAP1）系統(tǒng)調節(jié)細胞內穩(wěn)態(tài)，抵抗外源性和內源性的氧化損傷，調節(jié)機體抗氧化蛋白的表達。（3）谷胱甘肽（GSH）的抗氧化作用：鐵蛋白和谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX4）調控GSH 的合成，GSH是一種鐵死亡的抑制劑，能通過清除細胞自由基抑制鐵死亡，而其合成異常也可導致鐵死亡。近期研究表明，鐵死亡在肺癌、肝癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉移過程中起重要作用，成為近年來研究的熱點。因此本文對近期ncRNA 調控肺癌中細胞鐵死亡的相關研究進展進行介紹，為肺癌鐵死亡相關研究提供參考。

1 lncRNA 通過影響脂代謝和ROS 積累，調節(jié)細胞鐵死亡

由于外界因素誘導，細胞內穩(wěn)態(tài)被擾亂，脂質相關基因表達異常，導致細胞內脂質氧化物大量積累，隨即引發(fā)細胞鐵死亡[6-7]。因此，對脂質氧化代謝的調控是影響鐵死亡的重要機制。Sato 等[8]采用肺癌PC9、A549 和H358 細胞系，對lncRNA LINC00336 調控細胞鐵死亡的機制進行了研究，發(fā)現(xiàn)LINC00336定位于細胞核內，過表達LSH 基因可誘導LINC00336轉錄水平的上調，無論是在肺腺癌細胞系還是在肺鱗癌細胞系中都有高表達。進一步研究發(fā)現(xiàn)，ELAV樣RNA 結合蛋白1（ELAV-like RNA-binding protein 1，ELAVL1）是LINC00336 的上游調控因子，LSH 可通過抑制p53 的活性來誘導ELAVL1 的表達，進而ELAVL1 通過穩(wěn)定其轉錄水平來上調LINC00336的表達。隨后，通過RNA 結合蛋白免疫沉淀（RNA binding protein immunoprecipitation，RIP）和RNA 蛋白拉拽沉淀證實了LINC00336 通過內源競爭RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）的吸附作用來抑制miR-6852 的活性，而miR-6852 的靶蛋白即是CBS，其同樣可發(fā)揮ceRNA 的作用來抑制CBS mRNA 的轉錄。因此，LINC00336 對CBS 有上調作用，最終抑制腫瘤細胞鐵死亡，促進腫瘤的形成與發(fā)展。該研究完整地呈現(xiàn)了LSH/p53/ELAVL1/LINC00336/miR-6852/CBS 軸的分子調控機制。另外，Chao 等[9]研究了lncRNA MT1DP 調節(jié)細胞鐵死亡的分子機制，發(fā)現(xiàn)MT1DP 可通過抑制miR-365a-3p 的表達，進而抑制細胞的抗氧化反應，最終導致細胞的氧化應激反應的激活與加重。MiR-365a-3p 的異常表達可顯著下調NRF2 的表達水平，從而調節(jié)erastin 介導的肺癌細胞鐵死亡。這項研究最終證實了可通過MT1DP/miR-365a-3p/NRF2 軸來調控erastin 介導的肺癌細胞鐵死亡，這兩項研究成果為后續(xù)研究lncRNA 調控鐵死亡的分子機制提供了理想范例。

2 miRNA 通過影響GPX4 的表達調控肺癌細胞 鐵死亡

胱氨酸可在胱氨酸谷氨酸轉運受體（System Xc-）的作用下還原為半胱氨酸，而后者是GSH 合成的原料之一[10]。GSH 可在GPX4 的催化作用下由還原型轉變?yōu)檠趸?，同時對細胞內的過氧化物進行還原，以抑制細胞鐵死亡[11]。因此System Xc-、GSH、GPX4 構成了細胞內重要的抗氧化體系，同時也是細胞鐵死亡的重要負調控因子。許多正負調控鐵死亡的相關因子都是通過調控這個重要的抗氧化體系來發(fā)揮作用的。

研究發(fā)現(xiàn)，miR-324-3p 是二甲雙胍誘導乳腺癌發(fā)生細胞鐵死亡的靶點，說明miR-324-3p 不僅是鐵死亡的誘導因素，而且參與了二甲雙胍抗乳腺癌的作用機制[12]。Huang 等[13]以A549/DDP 肺癌細胞系為研究對象，結果表明，過表達miR-324-3p 的細胞中GPX4 表達水平顯著降低，而熒光素酶標記的結果也表明，GPX4 是miR-324-3p 的直接靶點。該研究揭示了A549/DDP 細胞中miR-324-3p/GPX4信號軸的作用，且該信號軸也可能是逆轉非小細胞肺癌順鉑耐藥的潛在靶點。

miR-338 是另一種可靶向調控GPX4 的miRNA，在肝癌、胃癌、肺癌等腫瘤組織中的表達量與正常組織相比均顯著降低[14-15]。Chen 等[16]和Tarangelo等[17]采用PCR 對肺癌組織、癌旁組織、肺癌細胞系和正常肺部細胞系的miR-338 和GPX4 mRNA 水平進行檢測，并采用雙熒光素酶法驗證miR-338 和GPX4 的關系，結果表明，與癌旁組織、正常細胞相比，肺癌組織以及肺癌細胞系中miR-338 表達水平均顯著降低，雙熒光素酶也證實miR-338 和GPX4的直接作用。此外，對miR-338 進行過表達處理，可以明顯提高腫瘤細胞系ROS 水平，并有效抑制腫瘤細胞生長和遷移，而加入細胞鐵死亡抑制劑，可以削弱甚至逆轉miR-338 的抑制腫瘤細胞生長和遷移作用。最終證實miR-338 可通過負調控GPX4 的表達進而促進腫瘤細胞鐵死亡，從而抑制腫瘤細胞的生長和遷移。

3 lncRNA 通過調控p53 的表達促進肺癌細胞鐵死亡

眾所周知，p53 介導的細胞衰老和細胞凋亡是抑制腫瘤生長、遷移的關鍵。但除此之外，p53 還可以通過調節(jié)RNA 轉錄或蛋白質翻譯來誘導細胞鐵死亡的發(fā)生[18-19]。一方面，p53 通過抑制溶質載體家族7 成員11 的表達，或通過提高亞精胺/精胺n1-乙酰轉移酶和谷氨酰胺酶2 兩種重要蛋白的表達來增強細胞鐵死亡；另一方面，p53 可通過直接抑制二肽基肽酶4 的蛋白活性來抑制erastin 所誘導的細胞鐵死亡的發(fā)生，還可通過誘導cyclin 依賴激酶抑制因子表達、減緩細胞內GSH 的消耗和減少ROS 積累來抑制細胞鐵死亡。由此可見，p53 對細胞鐵死亡的調控具有明顯的生物雙向性，這與細胞系、細胞環(huán)境息息相關。因此p53 上下游相關通路的調控對鐵死亡的影響是十分復雜的。Song 等[20]和Kenneth 等[21]對比了A549 等7 種肺癌細胞系和MRC-5 等2 種正常肺部細胞系的細胞質中l(wèi)ncRNA p53RRA 的表達水平，結果表明，在腫瘤細胞中，p53RRA 表達水平顯著下調。證明p53RRA 可以直接作用于靶蛋白功能域，從而調控p53 的表達和移位，促進細胞鐵死亡，抑制腫瘤的進展。

4 ncRNA 調控肺癌鐵死亡的其他機制

Lu 等[22]采用A549 肺癌細胞系進行順鉑耐藥誘導實驗，研究敲降或過表達miR-4443 對細胞鐵死亡的影響。實驗結果表明，過表達miR-4443 可以通過與鐵死亡抑制蛋白1（FSP1）相互作用，進而抑制順鉑介導的細胞鐵死亡，并促進肺部腫瘤的體內生長。另一項研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA NEAT1 在肺癌細胞鐵死亡中具有重要調節(jié)作用[23]。?；o酶A 合成酶長鏈家族成員4（ACSL4）是一種重要的脂肪酸激活酶，可通過調節(jié)細胞脂質組合來影響細胞鐵死亡的敏感性，是一種經(jīng)典的細胞鐵死亡抑制因子。通過生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，NEAT1 和ACSL4 具有直接結合的分子靶區(qū)，表明NEAT1 與ACSL4 的靶向結合可以抑制ACSL4 的正常表達，導致肺癌細胞對細胞鐵死亡的敏感性。同時，NEAT1 增強了肺癌細胞對erastin 誘導細胞鐵死亡的敏感性，最終導致肺癌細胞的鐵死亡。

5 肺癌細胞鐵死亡ncRNA 的潛在調控靶點

5.1 參與肺癌細胞中鐵離子的轉運調控 細胞鐵死亡離不開鐵離子的介導。TFR1 可以與其配體結合并內化，以維持細胞內鐵離子的穩(wěn)定[24]。TFR1 受多種ncRNA 調控，其水平下調可激活細胞鐵死亡通路[25-26]。lncRNA PVT1 在肺癌細胞中有表達，且其對肺癌細胞增值的促進作用也已被證實[27]。PVT1 的下游靶向miR-214-3p 也可通過下調TFR1，從而對細胞鐵死亡有調節(jié)作用。但PVT1/miR-214-3p 軸對肺癌中鐵死亡的作用尚未見報道。

5.2 肺癌鐵死亡調控相關ncRNA 的生物信息學分析 Kirill 等[28]對TCGA 數(shù)據(jù)庫中的肺腺癌轉錄組數(shù)據(jù)進行分析，發(fā)現(xiàn)9 個與鐵死亡預后相關的lncRNA，均可獨立地用來預測肺腺癌患者的預后，并可能成為新的治療靶點。Wu 等[29]則對非小細胞肺癌的臨床樣本基因表達譜進行生物信息學分析，最終確定了10 個既與非小細胞肺癌預后相關，又與細胞鐵死亡相關的lncRNA，然后選取其中9 個lncRNA 分子用于構建非小細胞肺癌預后模型，并將非小細胞肺癌患者分為高風險和低風險兩組。結果顯示，高風險組患者的預后更差。上述研究為臨床探索相應的治療靶點與生物標志物提供了新穎而有益的科研思路。但是，關于ncRNA 調控肺癌中細胞鐵死亡機制的研究仍在起步階段，現(xiàn)有的文獻報道尚未完全揭示肺癌中鐵死亡的發(fā)生、發(fā)展與調控可靠的機制。首先，各項研究都是以肺癌細胞系樣本（如A549、H358 等）為主[30]，并未對臨床樣本進行大規(guī)模、系統(tǒng)化的深入研究與探討。其次，只有少部分研究探尋了某個lncRNA/miRNA 軸對下游因子以及鐵死亡相關因子的調控作用，很多研究都只停留在某個lncRNA 或miRNA 的單一作用上，也未研究其上游有哪些調控因子可以影響其表達，也并未對ncRNA 調控系統(tǒng)進行全面分析。第三，circRNA 對腫瘤中鐵死亡的影響已于其他腫瘤報道[31]，但是在肺癌領域仍未發(fā)現(xiàn)circRNA 對細胞鐵死亡的調控作用。第四，細胞鐵死亡有其特殊的細胞形態(tài)學特征，如線粒體嵴減少、細胞膜破裂等，但有某些關于細胞鐵死亡的研究并未給出明確的細胞電鏡結果，而現(xiàn)在的學術界普遍認為電鏡結果是證明細胞發(fā)生鐵死亡的金標準[32]。第五，細胞鐵死亡與藥物耐藥之間的研究僅停留在順鉑等1～2 種藥物上[33]，對于靶向藥、免疫檢查點抑制劑的耐藥，鐵死亡抵抗究竟是否參與其中尚不得知。相信隨著研究的不斷深入，一定能揭示出更多關于鐵死亡與腫瘤之間的奧秘，為對抗腫瘤提供更為有利的醫(yī)學武器。