分子標(biāo)記在澳洲堅(jiān)果遺傳育種中的應(yīng)用研究進(jìn)展

李 冰，楊祥燕，蔡元保，曾黎明，林玉虹，李季東

（廣西壯族自治區(qū)亞熱帶作物研究所，廣西南寧 530001）

澳洲堅(jiān)果（Macadamiaspp.）屬山龍眼科（Proteaceae）澳洲堅(jiān)果屬（MacadamiaF.Muell.）多年生常綠喬木果樹，源自澳大利亞亞熱帶雨林氣候地區(qū)。1843 年德國(guó)探險(xiǎn)家Leichhardt 最先發(fā)現(xiàn)，命名為昆士蘭堅(jiān)果，1857 年正式命名為澳洲堅(jiān)果，隨之先后被引入世界各熱帶、亞熱帶地區(qū)。雖然20世紀(jì)70 年代我國(guó)才開始引種試種澳洲堅(jiān)果，但目前我國(guó)澳洲堅(jiān)果的種植面積居于世界首位，已在云南、廣西、廣東、海南和貴州等地區(qū)廣泛種植。澳洲堅(jiān)果果仁含油量高，多為單一不飽和脂肪酸，且富含蛋白質(zhì)，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值，被譽(yù)為“堅(jiān)果皇后”。澳洲堅(jiān)果單產(chǎn)和總產(chǎn)量低，且產(chǎn)品在世界各地供不應(yīng)求，因此，選育出高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的澳洲堅(jiān)果品種以提高其產(chǎn)量，是目前澳洲堅(jiān)果遺傳育種工作的重中之重。

DNA 分子標(biāo)記技術(shù)與傳統(tǒng)育種技術(shù)相結(jié)合，可以極大的縮短育種年限，加快作物育種進(jìn)程。目前分子標(biāo)記技術(shù)已經(jīng)在水稻[1]、蘋果[2]、龍眼[3]、番木瓜[4]等作物中得到廣泛的應(yīng)用，在作物遺傳育種改良中發(fā)揮重要的作用。隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，RFLP（Restriction Fragment Length Polymorphism，限制性內(nèi)切酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性）、AFLP（Amplified Fragment Length Polymorphism，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性）、RAPD（Random Amplified Polymorphic DNA，隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA 標(biāo)記）、ISSR（Inter-Simple Sequence Repeat，簡(jiǎn)單序列重復(fù)區(qū)間）、SNP（Single Nucleotide Polymorphism，單核苷酸多態(tài)性）、SSR（Simple Sequence Repeats，簡(jiǎn)單重復(fù)序列標(biāo)記）、SCoT（Start Codon Targeted Polymorphism，目標(biāo)起始密碼子多態(tài)性）等分子標(biāo)記技術(shù)也逐漸應(yīng)用于澳洲堅(jiān)果遺傳育種研究。本文主要綜述了分子標(biāo)記技術(shù)在澳洲堅(jiān)果種質(zhì)資源遺傳多樣性分析、DNA 分子指紋圖譜構(gòu)建和遺傳圖譜構(gòu)建中的研究進(jìn)展，并分析了其在澳洲堅(jiān)果研究中的發(fā)展前景。

1 分子標(biāo)記的類型及用途

分子標(biāo)記是物種基因組中有其特有位置的DNA片段，是形態(tài)學(xué)標(biāo)記、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記和生化標(biāo)記之外的第四種遺傳標(biāo)記，其主要分為三大類：以分子雜交為基礎(chǔ)的第一代分子標(biāo)記（RFLP 等）、以PCR技術(shù)為核心的第二代分子標(biāo)記（AFLP、RAPD、SSR、ISSR、SCoT 等）以及以序列測(cè)序?yàn)榛A(chǔ)的新一代分子標(biāo)記SNP、InDel（Insertion Deletion Length Polymorphism，插入缺失長(zhǎng)度多態(tài)性）、EST（Expressed Sequence Tag，表達(dá)序列標(biāo)簽）等。分子標(biāo)記與其他三種遺傳標(biāo)記相比，具有許多優(yōu)點(diǎn)，包括不受組織類別、發(fā)育階段和生存環(huán)境的影響，標(biāo)記數(shù)量分布于整個(gè)基因組且多為共顯性標(biāo)記，多態(tài)性高、能遺傳穩(wěn)定等，是一種相對(duì)理想的遺傳標(biāo)記類型。分子標(biāo)記可應(yīng)用于標(biāo)記重要性狀基因、構(gòu)建遺傳連鎖圖譜、分子標(biāo)記輔助選擇及分析種質(zhì)遺傳多樣性等方面，并在植物遺傳育種和基因組研究中發(fā)揮著重要作用。

2 分子標(biāo)記在澳洲堅(jiān)果中的研究進(jìn)展

2.1 澳洲堅(jiān)果種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析

澳洲堅(jiān)果種質(zhì)資源豐富，但是由于交叉引種、自然變異、雜交等因素，遺傳背景復(fù)雜，親緣關(guān)系比較雜亂。植物的遺傳多樣性是品種遺傳改良的基礎(chǔ)，種質(zhì)遺傳背景分析可為作物品種鑒定和品種純度監(jiān)測(cè)提供科學(xué)依據(jù)。利用DNA 分子標(biāo)記開展澳洲堅(jiān)果種質(zhì)資源的遺傳多樣性等研究，可以有效地提高澳洲堅(jiān)果育種效率，加速澳洲堅(jiān)果育種進(jìn)程。

Peace 等[5]利用分子標(biāo)記技術(shù)，分析了80 多個(gè)來自澳大利亞，美國(guó)夏威夷、加州，南非，以色列等地收集的澳洲堅(jiān)果品種，將其品種分為7 個(gè)基因庫。其中基因庫1 和2 包含幾乎所有的夏威夷品種和一些以色列品種，基因庫3 和4 主要包含澳大利亞品種，基因庫5 和6 主要是澳大利亞雜交品種，基因庫7 包含來自澳大利亞和南非的雜交種和粗殼種。而且，還分析了75 個(gè)澳洲堅(jiān)果自然種群（共400 多份種質(zhì)），并確定了光殼種、粗殼種和三葉澳洲堅(jiān)果這3 個(gè)物種特有的分子標(biāo)記（共120 多個(gè)），從DNA 分子水平上闡明了澳洲堅(jiān)果品種資源的分類。此外，Peace 等[6]還利用RAF 標(biāo)記輔助篩選出38 個(gè)南非澳洲堅(jiān)果品種，并分析其品種間的遺傳特性和親緣關(guān)系，結(jié)果表明品種741u 即是741（Mauka），741s 則是800（Makai），791 可能是M.ternifolia第二代雜交種，Nelmak1 是M.inegrifolia和M.tetraphylla的第一代雜交種。這一結(jié)果為南非地區(qū)澳洲堅(jiān)果種質(zhì)資源的科學(xué)利用和產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展提供了重要依據(jù)。

Steiger 等[7]利用105 個(gè)AFLP 標(biāo)記鑒定26 份澳洲堅(jiān)果材料，明確分離出4 個(gè)澳洲堅(jiān)果種，并對(duì)三葉澳洲堅(jiān)果可能為全緣葉澳洲堅(jiān)果變種這一觀點(diǎn)提出質(zhì)疑。在澳洲堅(jiān)果屬物種分類的主類群中，9 個(gè)已明確的光殼種品種被分為兩個(gè)亞類群，這表明原始基因庫的雜合性有助于澳洲堅(jiān)果品種的改良。

唐瑩瑩等[8]利用單因素設(shè)計(jì)法，優(yōu)化了澳洲堅(jiān)果RAPD-PCR 反應(yīng)體系，并通過不同引物和種質(zhì)驗(yàn)證表明該反應(yīng)體系可靠性、穩(wěn)定性和分辨率較高，為澳洲堅(jiān)果種質(zhì)資源鑒定和遺傳多樣性分析提供了重要工具。Barbosa 等[9]利用RAPD 標(biāo)記對(duì)澳洲堅(jiān)果栽培種的不同無性系進(jìn)行遺傳特征分析。通過提取來自巴西和夏威夷的12 份澳洲堅(jiān)果無性繁殖系葉片的DNA，并利用15 對(duì)RAPD 標(biāo)記引物進(jìn)行擴(kuò)增，構(gòu)建親緣關(guān)系樹狀圖。該結(jié)果表明，大多數(shù)遺傳變異發(fā)生在群體內(nèi)部并非群體之間，推測(cè)遠(yuǎn)緣群體可用于近親繁殖或者雜交。

賀熙勇等[10]利用ISSR 分子標(biāo)記技術(shù)，對(duì)收集到的64 個(gè)澳洲堅(jiān)果種質(zhì)進(jìn)行分子聚類分析，將64 份種質(zhì)分為5 類，但是其聚類結(jié)果與形態(tài)學(xué)分類的一致性相差較大，只有部分種質(zhì)的親緣關(guān)系和種類與已知的分類體系一致。郭凌飛等利用單因素設(shè)計(jì)法，建立與優(yōu)化了澳洲堅(jiān)果ISSR-PCR 反應(yīng)體系[11]，并利用該分子標(biāo)記分析17 份澳洲堅(jiān)果品種的親緣關(guān)系[12]。其UPGMA 法的聚類結(jié)果表明，17 個(gè)品種間遺傳相似系數(shù)較大，可分為4 個(gè)類群，在最大的一個(gè)類群中包括所有夏威夷選育出的品種，而在澳大利亞選育出的品種則為獨(dú)立的類群。因此，推測(cè)現(xiàn)育的夏威夷品種可能來源于2 個(gè)遺傳多樣性不同的群體；而澳大利亞現(xiàn)育品種的遺傳背景和選育過程應(yīng)該與夏威夷品種有所不同，其遺傳關(guān)系可能更復(fù)雜。

譚秋錦等[13]對(duì)45 份澳洲堅(jiān)果種質(zhì)的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)（SNPs）進(jìn)行了基因分型、群體結(jié)構(gòu)和UPGMA 聚類分析，將這45 份澳洲堅(jiān)果種質(zhì)分為4個(gè)類群，其中第1 類群有2 份種質(zhì)，第2 類群有1份種質(zhì)，第3 類群有4 份種質(zhì)，第4 類群有38 份種質(zhì)，其結(jié)果表明澳洲堅(jiān)果種質(zhì)資源存在很多品系。通過45 份澳洲堅(jiān)果種質(zhì)的親緣關(guān)系與遺傳多樣性分析，可為SNP 標(biāo)記在澳洲堅(jiān)果輔助育種的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

SSR 分子標(biāo)記重復(fù)性高，其實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定可靠，兼具PCR 反應(yīng)的優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于作物遺傳多樣性分析、種質(zhì)資源鑒定以及遺傳育種工作中[14]。2006年，Schmidt 等[15]開發(fā)利用SSR 引物，分離出33個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)，為SSR 標(biāo)記在澳洲堅(jiān)果中的應(yīng)用提供重要的位點(diǎn)標(biāo)記。2013 年，李玉宏等[16]從100 對(duì)引物中篩選得到19 對(duì)SSR 引物，其中2 對(duì)可以應(yīng)用于900×294 雜交組合的F1 代鑒定，為澳洲堅(jiān)果分子標(biāo)記輔助育種提供了理論依據(jù)。2019 年，唐瑩瑩等[17]利用單因素設(shè)計(jì)法，對(duì)SSR-PCR 的反應(yīng)體系進(jìn)行了優(yōu)化，優(yōu)化后的反應(yīng)體系穩(wěn)定可靠，對(duì)不同引物和澳洲堅(jiān)果種質(zhì)驗(yàn)證的分辨率更高，可適用于澳洲堅(jiān)果SSR 分析，也為后續(xù)基于PCR 擴(kuò)增反應(yīng)的澳洲堅(jiān)果相關(guān)試驗(yàn)提供一定理論和技術(shù)基礎(chǔ)。2022 年，井敏敏等[18]利用9 對(duì)SSR 引物對(duì)91 份國(guó)外引進(jìn)以及自主選育澳洲堅(jiān)果品種進(jìn)行遺傳多樣性分析，結(jié)果表明供試澳洲堅(jiān)果具有較高的多態(tài)性。其UPGMA 聚類分析將91 份澳洲堅(jiān)果材料分為2大類，親緣關(guān)系與地理來源關(guān)系無明顯相關(guān)性；AMOVA 分析結(jié)果表明澳洲堅(jiān)果群體內(nèi)遺傳變異顯著高于群體間變異。這些研究結(jié)果可為澳洲堅(jiān)果種質(zhì)資源的創(chuàng)新與利用提供雜交親本的遺傳背景。

2022 年，Ranketse[19]等利用13 個(gè)nSSRs（Nuclear microsatellite markers，核微衛(wèi)星標(biāo)記）對(duì)南非栽培澳洲堅(jiān)果種質(zhì)的遺傳多樣性和結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究，對(duì)來自夏威夷農(nóng)業(yè)實(shí)驗(yàn)站31 份、澳大利亞19份、加州2 份、以色列1 份、南非31 份、兩家當(dāng)?shù)剞r(nóng)戶的26 份供試材料進(jìn)行了比較。研究結(jié)果為南非所選澳洲堅(jiān)果材料含有豐富的雜種基因型，夏威夷和澳大利亞的供試材料大多含有M.integrifolia或者混合基因。這一結(jié)果為南非澳洲堅(jiān)果基因育種改良提供了依據(jù)。

2.2 澳洲堅(jiān)果DNA 分子指紋圖譜的構(gòu)建

以DNA 分子標(biāo)記為基礎(chǔ)的DNA 指紋鑒定技術(shù)在品種鑒定和純度監(jiān)測(cè)等方面具有高效的準(zhǔn)確性。利用DNA 分子標(biāo)記技術(shù)獲得品種的DNA 分子指紋圖譜，可用于鑒定品種的真實(shí)性與純度，新品種登記、注冊(cè)與知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)等。

Steiger 等[7]利用105 個(gè)AFLP 標(biāo)記鑒定26 份澳洲堅(jiān)果材料，分離出了四個(gè)澳洲堅(jiān)果種，且每個(gè)堅(jiān)果種都顯示出不同的AFLP 指紋圖譜，表明這些種質(zhì)中含有大量的遺傳變異。蔡元保等[20]利用單因素設(shè)計(jì)法建立了澳洲堅(jiān)果SCoT 最適反應(yīng)體系，通過3 對(duì)SCoT 引物可將供試材料完全區(qū)分，并構(gòu)建了12 份澳洲堅(jiān)果種質(zhì)材料的指紋圖譜，置信概率到達(dá)99.99%，為澳洲堅(jiān)果種質(zhì)（品種）鑒定和遺傳多樣性分析等提供技術(shù)支持，也為澳洲堅(jiān)果品種的登記注冊(cè)和產(chǎn)權(quán)保護(hù)提供了一種有效的技術(shù)手段。劉小翠等[21]利用SRAP 分子標(biāo)記對(duì)45 份澳洲堅(jiān)果材料進(jìn)行基因組擴(kuò)增和遺傳多樣性分析，將45 份澳洲堅(jiān)果種質(zhì)資源分為6 個(gè)種群；并構(gòu)建DNA 指紋圖譜，有效的鑒定了澳洲堅(jiān)果種質(zhì)資源間的遺傳關(guān)系，為澳洲堅(jiān)果種質(zhì)資源利用和種質(zhì)鑒定提供科學(xué)依據(jù)。李志強(qiáng)等[22]以4 份差異較大的種質(zhì)為材料，從240對(duì)SSR 引物中最終選擇22 對(duì)擴(kuò)增穩(wěn)定、多態(tài)性高的SSR 引物進(jìn)行熒光標(biāo)記。利用篩選出的22 對(duì)多態(tài)性引物對(duì)83 份澳洲堅(jiān)果種質(zhì)資源進(jìn)行熒光檢測(cè)，獲得了83 份澳洲堅(jiān)果基因組數(shù)據(jù)，并利用其中9 對(duì)熒光引物組合，構(gòu)建該種質(zhì)的SSR 指紋圖譜，為澳洲堅(jiān)果種質(zhì)資源的鑒定工作提供了指紋數(shù)據(jù)信息。

2.3 澳洲堅(jiān)果遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建

遺傳連鎖圖譜是在染色體重組的基礎(chǔ)上，用遺傳標(biāo)記為路標(biāo)，以兩位點(diǎn)間的重組值作為遺傳標(biāo)記間的距離構(gòu)建的圖譜。構(gòu)建遺傳連鎖圖譜是識(shí)別與控制性狀表達(dá)的基因相關(guān)標(biāo)記的第一步，在闡明數(shù)量性狀方面起著重要作用[23]。高密度遺傳圖譜的構(gòu)建對(duì)于分子標(biāo)記輔助育種和基因圖位克隆在農(nóng)作物發(fā)展應(yīng)用起了重大推動(dòng)作用。Peace 等[24]以Keauhou 和A16 的56 個(gè)F1 代為供試材料，通過RAF、RAPD、SSR 三種分子標(biāo)記，分析出382 個(gè)標(biāo)記，繪制了第一張澳洲堅(jiān)果遺傳圖譜，為澳洲堅(jiān)果遺傳育種方面的QTL 定位和分子標(biāo)記輔助育種打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

Langdon[25]等利用澳洲堅(jiān)果品種741 自交和雙親雜交（‘741’ × ‘A4’，‘741’ × ‘268’，‘A4’ × ‘268’）等組合建立了四個(gè)定位群體，總共構(gòu)建了9 個(gè)遺傳連鎖圖譜。其中741 自交圖譜完全由共顯性SNP 標(biāo)記構(gòu)建，而親本雜交圖譜同時(shí)包含了SNP 和PAV 標(biāo)記。每個(gè)圖譜由14 個(gè)連鎖群組成，與澳洲堅(jiān)果單倍體染色體數(shù)目一致。這些遺傳連鎖圖譜被成功地用于澳洲堅(jiān)果基因組支架的錨定和定位以及第一個(gè)假染色體尺度組裝的構(gòu)建，增強(qiáng)了對(duì)澳洲堅(jiān)果遺傳背景和基因組的了解，為未來澳洲堅(jiān)果育種提供了重要工具。

3 分子標(biāo)記在澳洲堅(jiān)果研究中的應(yīng)用前景

培育出穩(wěn)定遺傳、高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的澳洲堅(jiān)果品種是目前澳洲堅(jiān)果產(chǎn)業(yè)急需解決的問題。雜交育種是澳洲堅(jiān)果新品種選育的常用方法，雜交種與親本相比也具有更高的生產(chǎn)潛力。已有研究表明SSR 分子標(biāo)記可被用于鑒定澳洲堅(jiān)果雜交種[16，26]。通過連鎖分子標(biāo)記進(jìn)行基因型和表型篩選，實(shí)現(xiàn)將多種優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)基因聚合到同一澳洲堅(jiān)果品種中，形成形狀優(yōu)良的聚合品種，是未來澳洲堅(jiān)果分子標(biāo)記育種的重要方向。近年來，澳洲堅(jiān)果主產(chǎn)區(qū)十分重視澳洲堅(jiān)果品種鑒定和分子遺傳多樣性分析，并取得了一些重要進(jìn)展。這為世界澳洲堅(jiān)果種質(zhì)資源遺傳多樣性評(píng)價(jià)、種質(zhì)創(chuàng)新與利用、分子標(biāo)記輔助育種和新品種培育方面奠定了基礎(chǔ)。隨著澳洲堅(jiān)果重要農(nóng)藝性狀的優(yōu)異基因挖掘與功能驗(yàn)證[27-29]，其連鎖的分子標(biāo)記也將深入開發(fā)，從而使分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)在澳洲堅(jiān)果遺傳育種中的應(yīng)用更加精準(zhǔn)高效。尤其是隨著澳洲堅(jiān)果葉綠體基因組的公開及其基因組序列特性的分析[30]，基于葉綠體基因組的cpSSR 標(biāo)記也將逐步應(yīng)用到澳洲堅(jiān)果種質(zhì)資源和雜交品種的遺傳特性分析。

利用分子標(biāo)記分析澳洲堅(jiān)果種質(zhì)（品種）的遺傳多樣性，明確其分子遺傳背景及其親緣關(guān)系，可以對(duì)澳洲堅(jiān)果種質(zhì)資源進(jìn)行創(chuàng)新與利用，有利于對(duì)澳洲堅(jiān)果種質(zhì)資源的保護(hù)。目前，澳洲堅(jiān)果品種選育還是多選取傳統(tǒng)育種方法，難以實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)性狀快速高效的改良選育。轉(zhuǎn)基因技術(shù)、分子標(biāo)記技術(shù)等分子育種技術(shù)具有周期短、效率高、定向育種精確度高等優(yōu)點(diǎn)，將這些現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)應(yīng)用于遺傳育種以提高果實(shí)的產(chǎn)量與品質(zhì)，是澳洲堅(jiān)果遺傳改良的最重要育種目標(biāo)。但與水稻、玉米、棉花等大田作物相比，澳洲堅(jiān)果分子育種技術(shù)的研究和應(yīng)用較為滯后，加強(qiáng)分子生物學(xué)技術(shù)在果樹育種領(lǐng)域的研究應(yīng)用將是未來育種的重要方向。但是，分子標(biāo)記在澳洲堅(jiān)果應(yīng)用研究中存在技術(shù)含量不高和未能有效利用的問題，導(dǎo)致通過該技術(shù)獲得的澳洲堅(jiān)果新品種并不多。因此，開發(fā)出更多更有效的分子標(biāo)記，并將分子標(biāo)記育種技術(shù)與常規(guī)育種技術(shù)有效結(jié)合起來，將會(huì)有效提高澳洲堅(jiān)果育種效率，選育出更多優(yōu)良品種。