益生菌影響骨質(zhì)疏松相關(guān)機(jī)制的研究進(jìn)展

譚 鋼，徐 靜，康成為，蒲小兵，康鵬德，董長超

(1.四川大學(xué)華西公共衛(wèi)生學(xué)院 華西第四醫(yī)院骨科，四川 成都 610041；2.四川大學(xué)華西醫(yī)院麻醉手術(shù)中心 四川大學(xué)華西護(hù)理學(xué)院，四川 成都 610041；3.四川大學(xué)華西醫(yī)院骨科，四川 成都 610041)

骨質(zhì)疏松是一種常見的骨骼疾病，臨床分為原發(fā)性、繼發(fā)性和特發(fā)性三種。原發(fā)性骨質(zhì)疏松主要表現(xiàn)為絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松和老年性骨質(zhì)疏松；繼發(fā)性骨質(zhì)疏松是由某些代謝性疾病或者長期服用某些藥物等因素所誘發(fā)[1]。在中國，60歲以上人群骨質(zhì)疏松總體患病率為36%，其中男23%，女49%[2]。人體和極大多數(shù)動物的胃腸道內(nèi)定植著種類和數(shù)量繁多的腸道菌群，在腸道菌群中，有一類對機(jī)體代謝極其重要的微生物就是益生菌。益生菌主要具備營養(yǎng)作用、提高防御能力、延緩衰老、抑腫瘤、調(diào)節(jié)骨代謝等作用。因此，益生菌對于機(jī)體健康具有重要作用，目前國內(nèi)外較多研究表明益生菌能夠影響骨代謝，從而導(dǎo)致或改善骨質(zhì)疏松，但是具體作用機(jī)制尚未得到完全闡明，現(xiàn)對其與骨質(zhì)疏松相互關(guān)系的相關(guān)機(jī)制研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，本次研究經(jīng)過本院醫(yī)學(xué)倫理委員會同意。

1 益生菌與骨質(zhì)疏松的相互關(guān)系

1.1益生菌可能通過影響宿主腸道免疫系統(tǒng)而調(diào)節(jié)骨代謝：腸道免疫系統(tǒng)是人體內(nèi)最大的免疫系統(tǒng)之一，可識別宿主體內(nèi)的病原體、飲食成分以及共生和有益微生物并對其作出不同反應(yīng)[3-4]，其中免疫細(xì)胞、潘氏細(xì)胞和杯狀細(xì)胞(特殊上皮細(xì)胞)在這一過程中起著極其重要的作用。許多疾病，如炎性反應(yīng)性腸病(IBD)和腹腔疾病等，可以導(dǎo)致腸道免疫系統(tǒng)失調(diào)。這些疾病與細(xì)胞因子的表達(dá)異常有關(guān)，而這些細(xì)胞因子也是調(diào)節(jié)骨代謝的重要因素[5-6]，因此，許多腸道疾病都可以導(dǎo)致骨質(zhì)流失[7]。國外學(xué)者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)形成結(jié)腸炎會導(dǎo)致骨髓內(nèi)免疫細(xì)胞組成和細(xì)胞因子表達(dá)的變化[8]。在IBD動物模型中，細(xì)胞因子[腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1α(IL-1α)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)]的失調(diào)與骨丟失相關(guān)[9-13]。同時，與動物模型一致，IBD患者的細(xì)胞因子水平升高[10-11]并表現(xiàn)出骨丟失。

腸道菌群是腸道免疫系統(tǒng)的重要調(diào)節(jié)因子，腸道菌群失調(diào)會增加破骨細(xì)胞前體細(xì)胞的活性，從而上調(diào)破骨細(xì)胞的生成。有研究者通過實(shí)驗(yàn)給小鼠口服“壞”細(xì)菌會導(dǎo)致腸道炎性反應(yīng)失調(diào)和相應(yīng)的骨丟失[12]。因此，腸道微生物群的變化會影響免疫反應(yīng)和骨骼健康。Sjogren等人[14]使用無菌小鼠的研究表明，與傳統(tǒng)小鼠相比，無菌小鼠具有更高的骨量。這與破骨細(xì)胞前體數(shù)量減少及骨髓中CD4+T細(xì)胞頻率降低有關(guān)。

益生菌在腸道中大量定殖并且能夠幫助機(jī)體進(jìn)行消化吸收并抵抗病原體的入侵，宿主則為益生菌提供生存環(huán)境[15]。然而，在宿主處于病理狀態(tài)等情況下都將改變腸道益生菌的數(shù)量及活性，從而引起一系列疾病發(fā)生[16-18]。既往的研究表明益生菌可以調(diào)節(jié)免疫功能[19-20]。由于益生菌是口服的，它們很容易與腸道免疫成分相互作用，從而影響局部和遠(yuǎn)處的器官功能。研究表明益生菌中的羅伊菌治療降低了雄性小鼠腸道TNFα的表達(dá)，相應(yīng)地增加了骨密度[21]，但是羅伊桿菌影響骨密度的確切免疫機(jī)制仍在積極研究中。然而有趣的是，羅伊桿菌逆轉(zhuǎn)了卵巢切除引起的骨丟失，這與骨髓CD4+T細(xì)胞的相應(yīng)變化有關(guān)，這與抗破骨細(xì)胞活性有關(guān)，被認(rèn)為是在L.reuteri條件培養(yǎng)基中，它抑制了單核巨噬細(xì)胞向破骨細(xì)胞的分化[22]。早期的研究表明，羅伊桿菌分泌的組胺參與抑制人單核細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α[23]。因此，羅伊桿菌對骨的作用可能涉及對腸道的抗炎作用和對骨細(xì)胞的潛在直接作用。這些因素是否影響腸道免疫或體內(nèi)骨免疫成分仍在積極研究中。

國內(nèi)外很多研究組已經(jīng)表明服用鼠李糖乳桿菌和VSL3益生菌可降低去卵巢小鼠腸道和骨髓中TNF-α、IL-17和核因子κB受體活化因子配體(RANKL)的表達(dá)[24]。Ohlsson等人[24]證明，補(bǔ)充益生菌可部分逆轉(zhuǎn)卵巢切除對骨髓T調(diào)節(jié)細(xì)胞的抑制作用。與抗炎T細(xì)胞的調(diào)節(jié)一致，補(bǔ)充益生菌可降低去卵巢小鼠的骨腫瘤壞死因子α和其他促炎細(xì)胞因子，并觀察到TGF-β1表達(dá)增強(qiáng)(與T-regs增加相關(guān))。Wang等人[25]發(fā)現(xiàn)，益生菌干酪乳桿菌改變了巨噬細(xì)胞表型。具體表現(xiàn)在髖關(guān)節(jié)植入產(chǎn)生的磨損碎屑激活巨噬細(xì)胞，導(dǎo)致促炎狀態(tài)和骨溶解；然而，干酪乳桿菌治療抑制了巨噬細(xì)胞的骨溶解和促炎狀態(tài)。其他研究表明，益生菌可以有益地影響骨髓中的造血，進(jìn)一步表明口服益生菌可以顯著影響骨髓中的免疫細(xì)胞，從而影響骨骼健康[26-27]。綜上所述，雖然這些研究表明益生菌可以顯著影響免疫系統(tǒng)和骨骼，但還需要進(jìn)一步的明確研究來確定具體的機(jī)制。

另外也有研究表明無菌小鼠的CD4+T 細(xì)胞、TNFα、破骨細(xì)胞前體細(xì)胞(CD4+/GR1-) 顯著少于常規(guī)條件小鼠。由于結(jié)腸內(nèi)容物含有大量微生物，作為抗原引起機(jī)體內(nèi)T細(xì)胞的增多，進(jìn)而導(dǎo)致TNF-α 增加等一系列免疫反應(yīng)[28]，由此表明，腸道菌群對于機(jī)體免疫系統(tǒng)有重要作用[16]。

1.2益生菌可能通過調(diào)節(jié)腸道屏障功能而影響骨代謝：腸上皮能夠?yàn)槿梭w提供一個選擇性屏障，防止有害物質(zhì)和病原體及其產(chǎn)品轉(zhuǎn)移到血液中。它由幾層組織構(gòu)成，尤為重要的是由緊密連接蛋白連接在一起的腸上皮細(xì)胞(IECs)，提供了關(guān)鍵的屏障支持，僅允許選擇性轉(zhuǎn)運(yùn)。此外，杯狀細(xì)胞產(chǎn)生的黏液層覆蓋在上皮細(xì)胞表面，阻止腸道細(xì)菌和病原體進(jìn)入宿主上皮細(xì)胞。腸道還分泌免疫球蛋白、防御素和其他有助于維持健康環(huán)境的抗菌物質(zhì)。

腸上皮屏障的破壞可導(dǎo)致病原體轉(zhuǎn)移到血流中，引起全身炎性反應(yīng)，并引發(fā)胃腸道疾病，如炎性反應(yīng)性腸病(IBD)、腹腔疾病和結(jié)腸癌[29-31]。國外很多研究表明，胃腸道屏障失調(diào)也會促進(jìn)骨丟失[32-33]，最終引起骨質(zhì)疏松。因此，痢疾可以通過增加腸道通透性和血清內(nèi)毒素水平來促進(jìn)骨質(zhì)丟失[34-35]。益生菌治療有利于改善腸道菌群失調(diào)，可以通過增強(qiáng)腸屏障功能來調(diào)節(jié)骨代謝。國外很多研究表明益生菌可以改善機(jī)體腸道屏障功能[36]，從而調(diào)節(jié)骨代謝，防止骨質(zhì)流失和發(fā)生骨質(zhì)疏松，與腸道屏障功能和骨骼健康之間的聯(lián)系一致。在動物模型研究中，對雌激素缺乏小鼠使用益生菌治療不僅可以防止腸道通透性，還可以防止骨質(zhì)流失[24]。

1.3益生菌可能通過改變腸道菌群組成調(diào)節(jié)骨代謝:人體為約100萬億個微生物提供宿主環(huán)境，除了微生物數(shù)量超過人類細(xì)胞外，腸道微生物群表達(dá)的基因也比人類基因組多100倍。微生物群組成的變化可能對人類健康產(chǎn)生有益或有害的影響。筆者通過自然攝入的益生菌的劑量可以從每天108～1012CFU不等[37]，雖然攝入時的益生菌數(shù)量是很多的，同時活性也是很好的，但胃和膽汁的酸性環(huán)境以及腸道內(nèi)分泌的酶可以使腸道內(nèi)的活益生菌數(shù)量減少50%或更多[38]。攝入的益生菌數(shù)量相對于小腸內(nèi)本身的細(xì)菌數(shù)量要多得多，而在結(jié)腸中，攝入的益生菌遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過現(xiàn)有的常駐細(xì)菌。攝入的益生菌在胃腸道內(nèi)維持?jǐn)?shù)天，但很少能維持到1周以后[39]。因此，益生菌需要連續(xù)攝取才能獲得最佳效果。

腸道菌群的組成與骨生長之間存在明顯的聯(lián)系[40-41]。如國外研究表明生長發(fā)育不良的營養(yǎng)不良兒童的腸道菌群與健康兒童的差異很大，當(dāng)將此類患兒的腸道菌群轉(zhuǎn)移到無菌小鼠腸道內(nèi)時，會導(dǎo)致無菌小鼠生長不良，更有趣的是，補(bǔ)充益生菌后改善了這批無菌小鼠的生長異常狀況[42]。其他研究也報道了益生菌治療恢復(fù)了營養(yǎng)不良小鼠的正常生長率且使血清胰島素樣生長因子-1(IGF-1)和胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白(IGFBP-3)升高至正常水平[43]。另外，益生菌中的雙歧桿菌有益于人類免疫缺陷病毒母親所生嬰兒的生長[44]。這些研究表明，益生菌的使用能夠有利于骨骼生長。

腸道菌群的變化也與骨密度的變化有關(guān)。在炎性反應(yīng)性腸病中觀察到骨密度與腸道功能平衡狀態(tài)之間存在負(fù)相關(guān)[45]，即腸道菌群中益生菌的增多可以提高骨密度。國外研究者用益生菌Reuteri乳桿菌治療去卵巢小鼠會引起微生物組成的顯著變化，并防止雌激素缺乏引起的骨丟失[22]，此外，許多文獻(xiàn)表明，攝入益生菌可以改變骨密度。其他許多研究也證明了微生物群在牙周病中的作用。糖尿病改變了口腔微生物群的組成，通過轉(zhuǎn)移到無菌小鼠身上，顯示出其致病性，并促進(jìn)牙周病和牙齒脫落，益生菌如鼠李糖乳桿菌GG、雙歧桿菌或Gasseri乳桿菌可以減少牙周病和骨丟失，但是目前尚未完全研究清楚該現(xiàn)象發(fā)生的具體機(jī)制[46]。

2 益生菌調(diào)節(jié)骨代謝的可能信號通路

前期研究表明腸道菌群調(diào)節(jié)骨代謝的可能機(jī)制有以下幾種：誘導(dǎo)產(chǎn)生腸源性5-羥色胺；發(fā)育過程中免疫系統(tǒng)的成熟，以及脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的全身炎性反應(yīng)等。

2.1益生菌可能通過影響5-羥色胺水平從而調(diào)節(jié)骨代謝：5-羥色胺又名血清素，是一種吲哚衍生物，分子式C10H12N2O，英文名：5-hydroxytryptamine，簡稱5-HT，廣泛存在于哺乳動物組織中，也是一種抑制性神經(jīng)遞質(zhì)。5-HT由腸嗜鉻細(xì)胞在腸道內(nèi)合成。色氨酸羥化酶-1(Tph1)負(fù)責(zé)催化十二指腸合成5-HT[47]。腸道菌群中的非益生菌可誘導(dǎo)腸內(nèi)分泌細(xì)胞產(chǎn)生5-HT，這些能夠刺激5-HT產(chǎn)生的微生物種類還不完全清楚。功能性5-HT受體在骨細(xì)胞上有表達(dá)，先前的研究表明5-HT對小鼠骨形成有負(fù)面影響[48]以及一些研究表明，通過抑制5-HT的產(chǎn)生可防止去卵巢嚙齒動物模型中的骨丟失[49]。當(dāng)腸道菌群中益生菌的數(shù)量顯著高于其他非益生菌后，占優(yōu)勢的益生菌則能夠降低5-HT的合成和再吸收，從而阻止5-HT導(dǎo)致的骨質(zhì)流失，以預(yù)防骨質(zhì)疏松形成。

2.2益生菌可能通過影響RANK水平調(diào)節(jié)骨代謝： 在骨骼中，骨髓基質(zhì)細(xì)胞可以根據(jù)微環(huán)境分化為骨吸收作用為主破骨細(xì)胞、成骨作用為主的成骨細(xì)胞以及其他免疫細(xì)胞，包括巨噬細(xì)胞或髓樣樹突狀細(xì)胞[50]。在巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)刺激下，破骨細(xì)胞前體細(xì)胞增加RANK的表達(dá)，從而使RANK配體(RANKL)結(jié)合并啟動信號級聯(lián)反應(yīng)促進(jìn)破骨細(xì)胞形成[51]。M-CSF和RANKL均由骨髓中的基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)，能夠?qū)Υ碳す俏盏募?xì)胞因子和激素作出響應(yīng)[52]，如TNF-α及其下游調(diào)節(jié)因子白細(xì)胞介素-1(IL-1)可以通過刺激M-CSF和RANK的表達(dá)，從而促進(jìn)破骨細(xì)胞生成[53]。益生菌可以下調(diào)TNF-α及其他炎性因子的表達(dá)，從而導(dǎo)致M-CSF和RANK的表達(dá)下降，這樣破骨細(xì)胞的生成就會減少，骨吸收作用就會降低，骨質(zhì)疏松的進(jìn)展就會放慢。

2.3益生菌可能通過TLR信號通路調(diào)節(jié)骨代謝：腸道菌群及包括脂多糖(LPS)和肽聚糖(PGN)在內(nèi)的細(xì)胞膜成分，可以通過Toll樣受體(TLR)對宿主產(chǎn)生影響，尤其是分別通過TLR-4和TLR-2。LPS與脂多糖結(jié)合蛋白(LBP)和分化簇14(CD14)蛋白因子形成復(fù)合物，以便通過TLR-4發(fā)出信號，最終引起腸道炎性反應(yīng)。

破骨細(xì)胞前體細(xì)胞可同時表達(dá)TLR-4和RANKL，其命運(yùn)取決于RANKL、骨保護(hù)素(OPG；RANK的誘餌受體)和LPS。在骨吸收過程中，RANKL較OPG高，導(dǎo)致破骨細(xì)胞前體細(xì)胞分化為破骨細(xì)胞。而脂多糖在破骨細(xì)胞生成中則起著雙面功能，當(dāng)破骨細(xì)胞前體細(xì)胞只暴露于LPS而不暴露于RANKL的情況下，破骨細(xì)胞前體細(xì)胞則分化為吞噬細(xì)胞。因此，LPS有潛力抑制破骨細(xì)胞的產(chǎn)生，防止骨吸收。同樣，如果RANKL在沒有LPS刺激的情況下與RANK結(jié)合，破骨前細(xì)胞分化為成熟的破骨細(xì)胞，開始骨吸收。然而，如果在RANKL刺激下LPS與TLR-4結(jié)合，則干細(xì)胞生成加速，導(dǎo)致破骨細(xì)胞分化和細(xì)胞存活的更強(qiáng)烈誘導(dǎo)，最終導(dǎo)致更嚴(yán)重的骨破壞。益生菌細(xì)胞膜存在大量的脂多糖，且益生菌能夠抑制RANKL的表達(dá)，因此雙重作用下破骨細(xì)胞前體細(xì)胞分化為成熟破骨細(xì)胞的數(shù)量將會明顯降低，骨吸收作用就會顯著削弱，骨質(zhì)疏松的進(jìn)展就會明顯減慢。

3 小結(jié)

腸道菌群中存在益生菌和非益生菌，對人體骨代謝起著兩種方向相反、作用截然不同的重要影響。雖然目前的研究尚未完全闡明益生菌調(diào)節(jié)骨代謝和改善骨質(zhì)疏松的具體機(jī)制，但是現(xiàn)有大量研究已經(jīng)表明益生菌能夠改善骨質(zhì)疏松的情況，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步深入的研究，從而減輕因?yàn)楣琴|(zhì)疏松造成的社會危害性和負(fù)擔(dān)。