外泌體在毛乳頭細(xì)胞誘導(dǎo)毛發(fā)再生中的作用 ①

曹貴媛，祝寧俠

(桂林醫(yī)學(xué)院，廣西 桂林 541199)

隨著生活方式的改變和工作壓力的增加，脫發(fā)性疾病在人群中發(fā)病率逐漸升高，缺乏高效治療手段，嚴(yán)重影響患者形象和生理健康，降低生活質(zhì)量。毛囊是活性微小型器官，由間質(zhì)和上皮成分構(gòu)成，其生長周期分為生長期、退行期和休止期三個(gè)階段，各周期功能狀態(tài)與脫發(fā)性疾病的發(fā)生密切相關(guān)[1]。毛乳頭(dermal papilla，DP)細(xì)胞作為毛囊單位的主要間充質(zhì)成分，在維持毛發(fā)生長和誘導(dǎo)毛囊再生中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用[1]。雄激素性脫發(fā)(androgenic alopecia，AGA)是臨床上最常見的脫發(fā)病理類型，研究人員從AGA患者頭皮分離的DP細(xì)胞中檢測(cè)到高水平的雄激素受體，并認(rèn)為DP細(xì)胞誘導(dǎo)功能丟失導(dǎo)致了AGA發(fā)生[2]。因而維持DP細(xì)胞誘導(dǎo)毛發(fā)再生功能，成為了治療脫發(fā)性疾病的關(guān)鍵。外泌體(exosomes)由各種細(xì)胞分泌，包含蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和miRNA等物質(zhì)，在細(xì)胞間通信中發(fā)揮重要的作用。近年來研究發(fā)現(xiàn)外泌體具有維持DP細(xì)胞毛發(fā)誘導(dǎo)能力，為脫發(fā)類疾病的研究提供了新的方向。本文通過對(duì)國內(nèi)外文獻(xiàn)的整理，對(duì)DP細(xì)胞誘導(dǎo)維持毛發(fā)再生機(jī)制及幾種細(xì)胞來源的外泌體在毛發(fā)再生中的作用進(jìn)行綜述，期望為脫發(fā)類疾病的實(shí)驗(yàn)研究和臨床治療提供思路。

1 DP細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能

在早期毛囊發(fā)育過程中，單層上皮細(xì)胞接收來自真皮細(xì)胞的“第一真皮信號(hào)”Wnt后，增厚、局部形成毛囊基板并誘導(dǎo)下方的真皮細(xì)胞聚集成團(tuán)；隨后毛囊基板收到由Wnt5a介導(dǎo)的“第二真皮信號(hào)”Shh，誘導(dǎo)上皮細(xì)胞向下生長增殖，形成毛母質(zhì)細(xì)胞。毛母質(zhì)細(xì)胞在多次增殖的過程中逐漸包裹聚集細(xì)胞團(tuán)，并向上生長、分化為毛干和內(nèi)根鞘，毛母質(zhì)細(xì)胞包裹的細(xì)胞團(tuán)逐漸發(fā)育成成熟的毛乳頭[3]。DP細(xì)胞位于毛囊底部，其通過與毛囊干細(xì)胞相互作用，在胚胎時(shí)期中毛囊的形成以及出生后毛囊周期性生長過程中扮演重要角色，機(jī)制與Wnt等多種信號(hào)通路相關(guān)[3-4]。研究表明，DP細(xì)胞通過分泌miR-22-5p靶向調(diào)控Wnt信號(hào)通路關(guān)鍵因子LEF-1，抑制毛囊干細(xì)胞增殖和分化，阻滯毛囊周期[4]。研究者提取AGA患者“禿發(fā)區(qū)”和“非禿發(fā)區(qū)”DP細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)“禿發(fā)區(qū)”DP細(xì)胞更早呈現(xiàn)衰老表型，丟失毛囊誘導(dǎo)功能[5]。目前，脫發(fā)治療方法主要有藥物和毛囊單位移植，存在副作用及供體有限等問題[6]。因此，維持或恢復(fù)DP細(xì)胞毛發(fā)誘導(dǎo)能力因子的探索成為脫發(fā)治療研究的關(guān)注點(diǎn)。

2 外泌體的生物特性及其功能

細(xì)胞主動(dòng)釋放且具有膜結(jié)構(gòu)的囊泡統(tǒng)稱為細(xì)胞外囊泡，基于大小和生物物理性質(zhì)可進(jìn)一步分為外泌體、凋亡小體和微囊泡等。研究表明，外泌體與細(xì)胞外囊泡在大小、膜定位等方面具有相似的生物物理特征[7]。在1893年，Pan等[8]在綿羊網(wǎng)織紅細(xì)胞中首次發(fā)現(xiàn)外泌體，其為一種直徑約30～150 nm的膜結(jié)合納米囊泡，密度為1.11～1.19 g/ml，典型標(biāo)志物為CD9、CD63和CD81[9]。隨后，研究者發(fā)現(xiàn)此類細(xì)胞外囊泡并不是細(xì)胞廢棄物，它能夠?qū)⑿盘?hào)傳遞給其他細(xì)胞，從而進(jìn)行細(xì)胞間交流[10]。外泌體形成早期表現(xiàn)為細(xì)胞膜內(nèi)陷，將一些細(xì)胞外成分(蛋白質(zhì)、miRNA和脂質(zhì)等)包裹進(jìn)胞內(nèi)，形成早期內(nèi)涵體；而后早期內(nèi)涵體經(jīng)高爾基體作用融合成晚期內(nèi)涵體，最終形成含有腔內(nèi)囊泡的細(xì)胞內(nèi)多膜體；這些細(xì)胞內(nèi)多膜體釋放到細(xì)胞外形成外泌體，被靶細(xì)胞吸收后通過物質(zhì)交換或釋放胞內(nèi)物質(zhì)實(shí)現(xiàn)信息交流[10]。

大量聚焦外泌體的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞等都可以釋放外泌體，對(duì)多種生理和疾病病理發(fā)展過程有重大影響[10]。人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞衍生的神經(jīng)元外泌體，能促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞增殖，影響軸突的形成和形態(tài)發(fā)生[11]。在2型糖尿病中，脂肪細(xì)胞來源的外泌體通過傳遞miRNA和蛋白質(zhì)等，調(diào)節(jié)胰島素敏感性，改善2型糖尿病癥狀[12]。靶向神經(jīng)退行性疾病的研究表明，外泌體可干預(yù)細(xì)胞內(nèi)毒性蛋白質(zhì)的累積，緩解阿爾茨海默癥相關(guān)癥狀[13]。由于外泌體包含各種物質(zhì)，如miRNA、脂質(zhì)和DNA片段等，對(duì)外泌體內(nèi)容物的檢測(cè)可作為不同腫瘤細(xì)胞的早期診斷潛在的重要選擇[14]。Zeng等[15]的研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌細(xì)胞通過衍生的外泌體將腫瘤轉(zhuǎn)移促進(jìn)因子miR-25-3P輸送至血管內(nèi)皮細(xì)胞，增加血管通透性和血管生成，并結(jié)合臨床數(shù)據(jù)提出外泌體miR-25-3P的定量檢測(cè)能夠早期識(shí)別患者腫瘤轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)，從而進(jìn)行預(yù)防性治療。

3 外泌體與DP細(xì)胞誘導(dǎo)功能

3.1 外泌體與Wnt信號(hào)通路

毛囊形成和周期性生長涉及到多種信號(hào)通路，如轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)、Shh、Wnt等。有研究結(jié)果表明，Wnt信號(hào)能夠促進(jìn)毛囊干細(xì)胞增殖，加速毛囊從休止期向生長期過渡[16]。事實(shí)上，目前已經(jīng)明確Wnt/β-catenin在DP細(xì)胞誘導(dǎo)毛發(fā)再生的關(guān)鍵作用，其與DP細(xì)胞促進(jìn)毛囊發(fā)育和周期性生長作用均密切相關(guān)[16]。在AGA脫發(fā)機(jī)制研究中，研究者利用雙氫睪酮(DHT)干預(yù)DP細(xì)胞，觀察到Wnt10b表達(dá)下調(diào)和Wnt通路抑制因子DKK1表達(dá)上調(diào)，激活糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)，磷酸化β-連環(huán)蛋白(β-catenin)，使Wnt通路失活，影響下游基因c-myc等的表達(dá)，導(dǎo)致DP細(xì)胞丟失毛囊誘導(dǎo)功能，并以旁分泌方式抑制毛囊干細(xì)胞分化[17]。鑒于Wnt信號(hào)通路與DP細(xì)胞誘導(dǎo)功能有緊密相關(guān)，研究者針對(duì)外泌體和Wnt信號(hào)通路進(jìn)行了深入的探索。Gross等[18]闡述外泌體包含活性Wnt因子(Wnt5a和Wnt3a)，Stem Cells Dev雜志報(bào)告了CD63+外泌體通過運(yùn)輸Wnt信號(hào)通路配體蛋白及mRNA進(jìn)行細(xì)胞間信息交流，促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞刺激皮膚修復(fù)和再生進(jìn)程[19]。在腫瘤微環(huán)境中，外泌體介導(dǎo)Wnt信號(hào)分子的轉(zhuǎn)移，調(diào)節(jié)Wnt信號(hào)通路活化，從而影響腫瘤細(xì)胞狀態(tài)，而間充質(zhì)干細(xì)胞通過衍生的富含Wnt4a外泌體，激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路，促進(jìn)皮膚組織的修復(fù)和再生[20]。另外，Zhou等[21]在毛囊不同周期應(yīng)用DP細(xì)胞衍生的外泌體，發(fā)現(xiàn)其通過激活Wnt信號(hào)通路，促進(jìn)外根鞘細(xì)胞增殖和遷移，進(jìn)一步證實(shí)了外泌體通過Wnt信號(hào)通路影響毛囊再生的潛在作用環(huán)路。

3.2 DP細(xì)胞與其衍生的外泌體

毛囊底部的DP細(xì)胞可以通過釋放多種因子，如Wnt信號(hào)通路相關(guān)因子、成纖維生長因子7(FGF7)和TGF-β等，以自分泌或旁分泌的作用方式促進(jìn)毛囊上皮細(xì)胞增殖分化，調(diào)控間充質(zhì)-上皮細(xì)胞相互作用，調(diào)節(jié)毛囊再生和周期[22]。DP細(xì)胞功能異常導(dǎo)致AGA發(fā)生，而外泌體與DP細(xì)胞誘導(dǎo)功能關(guān)鍵通路Wnt信號(hào)通路關(guān)聯(lián)密切，DP細(xì)胞來源外泌體在毛發(fā)生長中的作用是毛囊生物學(xué)的研究熱點(diǎn)。

低代細(xì)胞有毛囊誘導(dǎo)功能，隨著傳代，高代DP細(xì)胞(>6代)逐漸失去此功能。曹丹霞等[23]提取低代DP3細(xì)胞來源的外泌體培養(yǎng)高代DP8細(xì)胞，觀察到后者細(xì)胞生物學(xué)特性改善，能夠維持誘導(dǎo)毛發(fā)再生能力。在6周齡C57BL/6小鼠背部脫毛后，注射DP細(xì)胞衍生的外泌體(dermal papilla cell-derived exosomes，DPC-Exos)能夠促進(jìn)外根鞘(ORS)細(xì)胞增殖和遷移，同時(shí)上調(diào)β-catenin和Shh的表達(dá)，加速毛囊休止期至生長期過渡[21]。Kwack等[24]應(yīng)用7周齡雌性C57BL/6小鼠，背部皮膚脫毛后每周注射DP-Exos，周期為26 d，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與上述研究一致，進(jìn)一步表明DPC-Exos在毛發(fā)生長過程中的重要作用。此外，有研究將間充質(zhì)干細(xì)胞和DP細(xì)胞來源的外泌體毛發(fā)再生作用進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)DPC-Exos對(duì)TGF-β通路的激活，促進(jìn)DP細(xì)胞增殖和毛發(fā)生長作用更明顯[25]。這些結(jié)果均顯示DP細(xì)胞可以分泌外泌體促進(jìn)毛發(fā)生長，機(jī)制與Wnt等關(guān)鍵信號(hào)通路相關(guān)。

通常，獲取DP細(xì)胞來源的外泌體可以通過二維和三維培養(yǎng)細(xì)胞方式。研究者通過對(duì)比兩種培養(yǎng)方式，發(fā)現(xiàn)三維培養(yǎng)的DP球狀體能夠有效地誘導(dǎo)毛囊從休止期向生長期轉(zhuǎn)換，而DP球狀體衍生的外泌體miR-218-5p高水平表達(dá)，通過上調(diào)Wnt信號(hào)通路關(guān)鍵因子β-catenin的表達(dá)及下調(diào)Wnt信號(hào)通路抑制因子SFRP2，活化Wnt信號(hào)通路，加速毛囊從休止期進(jìn)入生長期[26]。Chen等[27]發(fā)現(xiàn)三維培養(yǎng)DP球狀體釋放的DPC-Exos中miR-140-5p表達(dá)水平較高，可以抑制BMP信號(hào)通路，調(diào)控毛囊周期，由此推測(cè)球狀體培養(yǎng)的DPC-Exos促進(jìn)毛發(fā)生長的作用更明顯。

3.3 間充質(zhì)干細(xì)胞與其衍生的外泌體

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSC)存在于骨髓、臍帶血等器官間質(zhì)中，可分化為多種間充質(zhì)組織，如肌腱、脂肪骨髓基質(zhì)、肌肉和軟骨等[28]。研究人員在骨髓和臍帶血中提取間充質(zhì)干細(xì)胞，體外培養(yǎng)后形成自聚集的球狀毛乳頭樣組織，隨后注射裸鼠，6周后觀察到毛發(fā)長出[29]。Bak等[30]使用0.1%地塞米松局部用藥誘導(dǎo)毛發(fā)進(jìn)入退化期，發(fā)現(xiàn)應(yīng)用人臍帶血來源的間充質(zhì)干細(xì)胞能通過下調(diào)Wnt通路抑制因子DKK1緩解局部使用地塞米松誘導(dǎo)的毛發(fā)退化進(jìn)程，顯著促進(jìn)DP細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞增殖，提示間充質(zhì)細(xì)胞通過分泌某種因子的方式在皮膚附屬器再生中的重要作用。在深Ⅱ度大鼠皮膚燒傷模型中，人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞衍生的外泌體“加速”Wnt/β-catenin信號(hào)促進(jìn)1型和3型膠原的產(chǎn)生，加速傷口處皮膚的愈合，同時(shí)調(diào)節(jié)YAP信號(hào)的“剎車”抑制膠原蛋白的沉積，調(diào)控皮膚組織再生[20]。Rajendran等[31]用MSC衍生的細(xì)胞外囊泡處理DP細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)DP細(xì)胞血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和胰島素樣生長因子I(IGF-I)的mRNA表達(dá)水平上調(diào)，而MSC衍生的細(xì)胞外囊泡注射C57BL/6小鼠皮膚能夠誘導(dǎo)小鼠背部毛發(fā)出現(xiàn)再生，顯示MSC衍生出的細(xì)胞外囊泡具有激活DP細(xì)胞，促進(jìn)DP細(xì)胞增殖，發(fā)揮促進(jìn)毛囊從休止期向生長期進(jìn)行轉(zhuǎn)化的作用。上述結(jié)果顯示，MSC衍生的外泌體類細(xì)胞外囊泡能夠調(diào)控DP細(xì)胞的毛囊的誘導(dǎo)能力，促進(jìn)毛發(fā)再生。

3.4 其他細(xì)胞衍生的外泌體

隨著外泌體的研究深度和廣度的增加，研究者發(fā)現(xiàn)外泌體的應(yīng)用有益于解決條件介質(zhì)中生長因子和細(xì)胞因子半衰期短的問題。如將脂肪來源的干細(xì)胞中分離出的外泌體加入DP細(xì)胞中，熒光顯微鏡下觀察到外泌體能夠進(jìn)入DP細(xì)胞的胞質(zhì)和核周，促進(jìn)DP細(xì)胞的增殖和遷移能力，上調(diào)DP細(xì)胞誘導(dǎo)活性標(biāo)志物堿性磷酸酶(ALP)的表達(dá)水平[32]。為了探究毛囊外根鞘細(xì)胞和血小板裂解液來源的外泌體能否維持DP細(xì)胞誘導(dǎo)毛囊的能力，研究人員進(jìn)行外泌體的形態(tài)和DP細(xì)胞對(duì)外根鞘細(xì)胞和血小板裂解物外泌體攝取等系列實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)外根鞘細(xì)胞外泌體能夠維持DP細(xì)胞傳代后的毛囊誘導(dǎo)能力[33]。同樣，人真皮成纖維細(xì)胞衍生的外泌體也能夠促進(jìn)DP細(xì)胞增殖，并激活DP細(xì)胞中Wnt/β-catenin配體的分泌，從而活化Wnt信號(hào)傳導(dǎo)，影響毛發(fā)生長[34]。此外，從人角質(zhì)形成細(xì)胞條件培養(yǎng)液中分離出外泌體加入到黑素細(xì)胞中進(jìn)行培養(yǎng)，能夠上調(diào)黑素細(xì)胞相關(guān)蛋白的表達(dá)，調(diào)節(jié)黑素細(xì)胞色素化能力，調(diào)控皮膚再生[35]。

4 結(jié)語

在脫發(fā)類疾病中，市面上暫且缺乏安全高效的治療手段。藥物非那雄胺和米諾地爾等能在一定程度上改善脫發(fā)癥狀，但需要長期服用，存在明顯的不良反應(yīng)。除了藥物治療，毛囊移植手術(shù)在臨床上也較為常用，通過將患者健康毛囊單位移植至禿發(fā)區(qū)，改善患者脫發(fā)外觀和自信心，但費(fèi)用較高且自體毛囊供體短缺。在這種背景下，具有毛囊誘導(dǎo)功能的DP細(xì)胞成為脫發(fā)類疾病細(xì)胞療法的“明星”種子選手，但體外培養(yǎng)的DP細(xì)胞容易發(fā)生衰老失去誘導(dǎo)功能，成為限制其臨床應(yīng)用的主要障礙。因而，靶向維持DP細(xì)胞誘導(dǎo)功能各種因子的研究成為毛發(fā)領(lǐng)域的研究焦點(diǎn)。外泌體能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移和血管生成，加速組織修復(fù)和再生，且安全性較高，適合開發(fā)個(gè)性化藥物，所以引起了研究者的關(guān)注。研究結(jié)果表明，包括DP細(xì)胞、不同來源的間充質(zhì)干細(xì)胞、來源于脂肪干細(xì)胞和外根鞘細(xì)胞等在內(nèi)的多種細(xì)胞通過外泌體的形式調(diào)控DP細(xì)胞的毛囊誘導(dǎo)能力，促進(jìn)毛發(fā)再生，機(jī)制與Wnt等關(guān)鍵信號(hào)通路活化相關(guān)。隨著對(duì)外泌體在毛發(fā)再生領(lǐng)域的研究，尤其是對(duì)DP細(xì)胞的增殖和誘導(dǎo)功能作用研究日益深入，發(fā)現(xiàn)其有利于延緩和干預(yù)DP細(xì)胞衰老，維持誘導(dǎo)功能，從而為雄激素性脫發(fā)的研究和治療提供新的思路。目前，雖然外泌體在毛發(fā)再生方面的研究已取得了一些進(jìn)展，但如何優(yōu)化、分離、提純和應(yīng)用外泌體以及外泌體在毛發(fā)再生相關(guān)研究的具體分子機(jī)制還需進(jìn)一步研究和探索。