微小RNA調(diào)控肝纖維化相關(guān)信號通路的研究進(jìn)展*

高曉陽，張春艷，顏羽昕，馬月宏

內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，呼和浩特 010059

肝纖維化作為全球主要公共衛(wèi)生問題之一，被一致認(rèn)為是由多種因素引起的慢性肝損傷的必然發(fā)展階段。這些因素主要包括病毒性感染(乙型和丙型)、酒精性脂肪性肝炎(alcoholic fatty liver disease，ALD)、非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)、膽汁淤積癥、自身免疫性疾病(原發(fā)性膽汁性肝硬化和自身免疫性肝炎)、鐵負(fù)荷、與藥物有關(guān)的毒性反應(yīng)、遺傳代謝性疾病(血色素沉著癥、威爾遜病和α1-抗胰蛋白酶缺乏癥)[1-3]。在肝纖維化進(jìn)展中，受損的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞和非實(shí)質(zhì)細(xì)胞會(huì)釋放出各種復(fù)雜的刺激信號，如轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor β，TGF-β)、血小板衍生生長因子(platelet-derived growth factor，PDGF)、結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF)等[4]。當(dāng)這些細(xì)胞因子與其它炎性介質(zhì)或調(diào)節(jié)因子之間形成信號通路作用在靜止的肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells，HSCs)時(shí)，HSCs將處于持續(xù)活化狀態(tài)，失去儲(chǔ)備維生素A的能力，轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞[5]。有報(bào)道指出，在慢性纖維增生性疾病中，肌成纖維細(xì)胞的存在是一個(gè)關(guān)鍵的共同特性[6]。增殖、收縮、遷移的肌成纖維細(xì)胞表現(xiàn)出較強(qiáng)的促纖維化轉(zhuǎn)錄和分泌特性，分泌出大量的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)蛋白，使ECM基因表達(dá)增強(qiáng)，降解基因表達(dá)下降，尤其增加了Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原的表達(dá)[7]。不足的是，有研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞因子及信號通路僅在ECM基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)階段發(fā)揮作用，而ECM的基因轉(zhuǎn)錄過程或翻譯水平需要有其他某種特定物質(zhì)干預(yù)才能進(jìn)行[8]，這種物質(zhì)就是非編碼RNA(non-coding RNA，ncRNA)。

人類基因組多經(jīng)轉(zhuǎn)錄得來，其中只有2%編碼蛋白質(zhì)，余多數(shù)轉(zhuǎn)錄組均由具有調(diào)控功能的ncRNA組成，包括miRNA、小干擾RNA(siRNA)、小核仁RNA(snoRNA)、PIWI相互作用RNA(piRNA)和長鏈非編碼RNA(lncRNA)等[9]。目前研究較廣泛的是miRNA，它通過降低mRNA的穩(wěn)定性或抑制mRNA的翻譯，實(shí)現(xiàn)對基因組表達(dá)的微調(diào)，對生物體發(fā)育、分化、增殖、凋亡、免疫等生理活動(dòng)的精準(zhǔn)調(diào)節(jié)[10]。并有越來越多證據(jù)表明，miRNA調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡、脂肪酸代謝等一系列相關(guān)信號通路，在肝纖維化中發(fā)揮重要的生物學(xué)作用[11]。在這里，我們主要通過以下幾個(gè)方面的探討，找出miRNA參與的信號通路及作用靶點(diǎn)，了解其與肝纖維化之間的相關(guān)性及可能存在的治療靶點(diǎn)。

1 miRNA的功能與作用機(jī)制

miRNA是一種物種間高度保守的非編碼單鏈RNA分子，長度約為21～23個(gè)核苷酸，主要通過識(shí)別同源序列和干擾轉(zhuǎn)錄、翻譯或表觀遺傳過程來調(diào)控基因表達(dá)[12-13]。然而，經(jīng)證實(shí)發(fā)現(xiàn)單個(gè)miRNA可同時(shí)靶向數(shù)百個(gè)mRNA，所以其生物學(xué)特性遠(yuǎn)比我們最初認(rèn)為的要更復(fù)雜[14]。事實(shí)上，該領(lǐng)域的最新進(jìn)展已經(jīng)揭示了許多分子機(jī)制，這些分子機(jī)制在生理?xiàng)l件下或在疾病中以細(xì)胞依賴性方式緊密地調(diào)節(jié)著它們的生物發(fā)生、成熟和相互作用，例如RNA編輯、單核苷酸多態(tài)性、DNA甲基化、不對稱miRNA鏈選擇以及與其他編碼和非編碼RNA分子或RNA結(jié)合蛋白(RNA binding proteins，RBPs)的相互作用[15]。

1.1 RNA編輯

RNA編輯事件幾乎發(fā)生在所有真核生物中，它的分子機(jī)制過程依賴不同的分類群，涉及不同的酶，最終導(dǎo)致不同的RNA修飾[16]。例如：腺苷到肌苷(A-to-I)編輯，是腺苷脫氨酶(ADAR)和ADAT蛋白家族的成員，是選擇性剪接和轉(zhuǎn)錄控制的重要調(diào)節(jié)因子；胞苷到尿苷(C-to-U)編輯，作為AID/APOBEC家族的成員，與先天性免疫和獲得性免疫密切相關(guān)，在抗體多樣化和抗病毒應(yīng)答中有不可替代的作用[17]。生理上，這些酶多數(shù)存在于細(xì)胞核和(或)細(xì)胞質(zhì)中，在那里它們可以修飾各種RNA分子(包括miRNA、tRNA和mRNA等)，其中一些也可以進(jìn)行DNA編輯[18]。目前與RNA編輯相關(guān)的各種疾病中，研究相對成熟的有中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)疾病和癌癥。Lorenzini等[19]從AMPA受體、血清素受體、電壓門控鉀通道3個(gè)方面論述了CNS RNA編輯目標(biāo)，數(shù)據(jù)顯示RNA編輯的調(diào)節(jié)可能與結(jié)合腦中區(qū)域的受體和細(xì)胞類型的時(shí)空特異性有關(guān)。在慢性神經(jīng)病變中，AMPA受體中Ca2+滲透性增加，毒性運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元被興奮致細(xì)胞死亡，也伴隨著ADAR2的下調(diào)；精神疾病則主要抑制血清素或5-羥色胺(5-HT)受體，使5-HT2C受體在經(jīng)歷RNA編輯轉(zhuǎn)錄后改性，影響大腦前額葉皮質(zhì)中ADAR2表達(dá)?？傊?，研究RNA編輯事件除了可以為識(shí)別新的疾病生物標(biāo)志物鋪平道路，還可能為各種疾病提供更專業(yè)、更個(gè)體化的治療。

1.2 單核苷酸多態(tài)性

單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)是人類基因組中最常見的變異類型，其中只有位于蛋白質(zhì)編碼和非編碼RNA基因中的功能性SNP才具有改變各種生物學(xué)過程的功能，并不斷賦予疾病多因素風(fēng)險(xiǎn)[20]。到目前為止，通過對人類SNP數(shù)據(jù)庫的生物信息學(xué)搜索得出，已知的SNP共有227個(gè)，其中12個(gè)位于miRNA前體內(nèi)，1個(gè)位于成熟miR-125a的第8位核苷酸，并在miRNA識(shí)別mRNA靶標(biāo)中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[21]。Duan等[22]在實(shí)驗(yàn)中構(gòu)建了miR-125a主、次等位基因的表達(dá)載體，結(jié)果表明當(dāng)主要等位基因表達(dá)時(shí)，miR-125a SNP能以RNA二級結(jié)構(gòu)依賴的方式將pri-miRNA加工為前miRNA；而次要等位基因表達(dá)時(shí)，miR-125a SNP可能導(dǎo)致堿基失配對，除了抑制miRNA介導(dǎo)的翻譯外，還顯著阻止pri-miRNA向pre-miRNA的轉(zhuǎn)錄后加工。與此同時(shí)，在乳腺癌miRNA圖譜中也發(fā)現(xiàn)了miR-125a的下調(diào)。Louer等[23]研究氧化應(yīng)激對各種疾病的影響過程時(shí)，發(fā)現(xiàn)琥珀酸受體(SUCNR1)基因轉(zhuǎn)錄本中有一個(gè)特殊的SNP(Rs13079080)，它主要在人類視網(wǎng)膜中表達(dá)，并與miRNA-4470結(jié)合于C等位基因，這時(shí)mRNA表達(dá)將降低，引發(fā)老年性黃斑變性(AMD)。

1.3 DNA甲基化

DNA甲基化是基因表觀遺傳學(xué)中的一種化學(xué)修飾，指生物體以S-腺苷甲硫氨酸(SAM)為甲基供體，在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferase，DNMT)的催化下將甲基連接到胞嘧啶環(huán)上的過程。它主要參與基因表達(dá)調(diào)控、重金屬修飾、蛋白質(zhì)功能調(diào)節(jié)以及核糖核酸加工等，此外甲基化狀態(tài)的改變還會(huì)引起基因表達(dá)異常或染色體結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定[24]。Holubekova等[25]采用全基因組測序、微陣列等新技術(shù)證實(shí)組織特異性DNA甲基化對miRNA分子或mRNA基因表達(dá)的影響，從中獲得的數(shù)據(jù)還表明了DNA甲基化模式和miRNA表達(dá)譜可以表征腫瘤組織的起源和轉(zhuǎn)移潛能，是早期癌癥可能觀察到的較精確的預(yù)后標(biāo)志物。Tao等[26]則通過對動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)中miRNA和DNA甲基化的表達(dá)監(jiān)控，得出AS形成的潛在機(jī)制可能與miRNA(如miR-145、miR-210、miR-124)中的DNA甲基化/去甲基化有關(guān)。反過來，DNA甲基化改變也需要miRNA通過一些與甲基化修飾相關(guān)的蛋白(如DNMT1、DNMT3a、DNMT3b、TET2)來調(diào)節(jié)。

2 miRNA調(diào)控肝纖維化信號通路

肝纖維化的發(fā)生機(jī)制極為復(fù)雜，涉及大量的細(xì)胞和分子事件。一方面，由外源性因素刺激，使HSCs轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，分泌過量的ECM致肝纖維化。同時(shí)大量研究證實(shí)，肝纖維化的發(fā)生發(fā)展與整合的信號通路有關(guān)，包括TGF-β/Smads通路、Hedgehog(Hh)/Gli通路、Wnt/β-catenin通路、NF-κB通路、PDGF通路、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/Akt通路、Notch通路、Toll樣受體2(TLR2)和TLR4通路等[27-28]。另一方面，受內(nèi)源性調(diào)節(jié)，機(jī)體中的miRNA與靶mRNA的3′非翻譯區(qū)(3′-UTR)結(jié)合，抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄或降低靶基因的穩(wěn)定性[29]。在生物進(jìn)化和發(fā)育過程中，由于miRNA序列的高度相似性，多個(gè)miRNA可以形成一個(gè)具有同源性序列的miRNA家族。miRNA家族的協(xié)同效應(yīng)，無論是全局的還是單獨(dú)的，都能通過與一個(gè)或幾個(gè)信號通路相關(guān)分子的結(jié)合與HSCs的活化和肝纖維化的進(jìn)展聯(lián)系在一起。

2.1 miRNA調(diào)控TGF-β/Smads通路

TGF-β是一種主要的促纖維化細(xì)胞因子，在調(diào)控組織和器官動(dòng)態(tài)平衡所必需的多種細(xì)胞過程中發(fā)揮重要作用。且TGF-β功能具有多樣性和多效性，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的失控將導(dǎo)致疾病的發(fā)生[30]。就肝臟而言，TGF-β通路參與疾病發(fā)展的所有階段，從最初的肝損傷到炎癥和纖維化，再到肝硬化和肝癌[31]。在現(xiàn)代研究中，TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)領(lǐng)域隨著細(xì)胞程序間的新發(fā)現(xiàn)而得到拓展。現(xiàn)通過多種研究均證明miRNA介導(dǎo)的RNA干擾能與TGF-β/Smads信號通路共同表達(dá)于基因轉(zhuǎn)錄水平，表現(xiàn)為TGF-β通過調(diào)節(jié)不同的促纖維化和抗纖維化miRNA，誘導(dǎo)造血干細(xì)胞的表觀遺傳學(xué)改變，表觀遺傳調(diào)節(jié)因子調(diào)節(jié)TGF-β信號通路上、下游成分的活性和表達(dá)等[32]。Jiang等[33]研究了miR-29家族在肝纖維化中的表達(dá)，論證了miRNA與TGF-β/Smads信號通路的相關(guān)性，顯示TGF-β信號可導(dǎo)致有Smads依賴性的miR-29家族成員下調(diào)，并伴隨著HSCs和成纖維細(xì)胞中ECM相關(guān)基因的下調(diào)，最后把miRNA整合到由細(xì)胞因子、轉(zhuǎn)錄因子和其他經(jīng)典細(xì)胞功能介質(zhì)組成的復(fù)雜的纖維化相關(guān)網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮作用。Gupta等[34]首次設(shè)計(jì)了關(guān)于TGF-β通路能否通過miRNA-181a誘導(dǎo)肝纖維化的實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TGF-β在誘導(dǎo)miRNA-181a表達(dá)上調(diào)時(shí)，能反作用地促進(jìn)HSCs的纖維化并抑制肝細(xì)胞再生，對TGF-β誘導(dǎo)的HSCs纖維化起抑制作用的是它們的中間產(chǎn)物，即堿性磷酸酶和上皮細(xì)胞鈣粘蛋白。Roderburg等[35]在原代小鼠和人的肝纖維化模型中觀察到，重組TGF-β能下調(diào)HSCs中的miR-133a，但對原代肝臟中的其他細(xì)胞無顯著改變。此外，為了更好地闡述HSCs miR-133a下調(diào)的可能機(jī)制，他們還進(jìn)行了HSCs的Smad2/Smad3轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，得出Smad2的轉(zhuǎn)染能顯著阻止依賴TGF-β的miR-133a的下調(diào)，而Smad3的影響卻較小。這些數(shù)據(jù)均提示了TGF-β/Smads通路在HSCs特異性調(diào)節(jié)miR-133a中的潛在作用。Lakner等[36]則對靜止和激活的大鼠HSCs進(jìn)行MIR基因芯片分析，發(fā)現(xiàn)miR-17-92簇(19a、19b、92a)成員在活化的HSCs中均明顯下調(diào)，其中miR-19b變化最大。miR-19b通過負(fù)調(diào)控TGF-β信號成分，減少TGF-β受體Ⅱ(TGF-βRⅡ)和Smad3的表達(dá)，降低Ⅰ型膠原的表達(dá)，阻斷TGF-β誘導(dǎo)的a1和a2前膠原mRNA的表達(dá)，最終鈍化HSCs的活化表型，使α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)的表達(dá)受到抑制。以上miRNA均將有望成為一種新的肝干細(xì)胞TGF-β信號調(diào)節(jié)因子，為治療肝纖維化提供了一種新的思路。

2.2 miRNA調(diào)控Hedgehog(Hh)/Gli通路

Hedgehog(Hh)/Gli信號通路作為發(fā)育器官的形態(tài)原、有絲分裂原和誘導(dǎo)因子，在胚胎形態(tài)形成和生長調(diào)控中起關(guān)鍵作用。Hedgehog具有多種多樣的功能，如胚胎發(fā)生、細(xì)胞增殖、細(xì)胞粘附、細(xì)胞遷移、細(xì)胞分化等，此外它還調(diào)節(jié)肝臟組織的傷口愈合反應(yīng)[37-38]。這些通常通過自分泌或旁分泌信號發(fā)生，目的是控制Hedgehog反應(yīng)細(xì)胞群體的大小和定位，以響應(yīng)局部/遠(yuǎn)距離信號[39]。就肝纖維化過程來說，Hedgehog信號傳導(dǎo)在促進(jìn)靜態(tài)HSCs轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維原肌纖維細(xì)胞時(shí)，其中一些細(xì)胞能在部分肝切除后成為再生肝上皮組織的前體細(xì)胞[40]。另有研究發(fā)現(xiàn)靜止的HSCs會(huì)產(chǎn)生大量的Hedgehog抑制劑(HHIP)，相反，當(dāng)HSCs在某種刺激下向其激活態(tài)過渡時(shí)，HHIP將迅速下調(diào)，致使Gli2靶基因表達(dá)增加[41]。最新研究已將Hedgehog(Hh)/Gli信號通路對肝纖維化組織的調(diào)控與miRNA的表達(dá)相關(guān)聯(lián)，調(diào)節(jié)Hedgehog的miRNA能誘導(dǎo)HSCs失活并減少肝纖維化發(fā)生。Ma等[42]發(fā)現(xiàn)在四氯化碳(CCl4)處理的肝纖維化模型、高脂飲食(high fat diet，HFD)誘導(dǎo)的脂肪性肝炎小鼠模型和肝硬化患者中，miR-214的表達(dá)會(huì)隨肝纖維化的進(jìn)展而不斷上調(diào)，所以他們認(rèn)為miR-214是肝纖維化中最顯著的miRNA上調(diào)基因。在機(jī)制上，miR-214的表達(dá)還受到轉(zhuǎn)錄因子Twist1的控制。當(dāng)Twist1與miR-214啟動(dòng)子中的E-box元件結(jié)合，miR-214能通過抑制Hedgehog(Hh)/Gli信號途徑中Sufu的表達(dá)來增強(qiáng)HSCs的活性及調(diào)節(jié)自身過表達(dá)，從而加快纖維化病理進(jìn)程。Sun等[43]得出miR-9通過直接靶向Hedgehog(Hh)途徑中多藥耐藥相關(guān)蛋白1(MRP1/ABCC1)的3′-UTR，抑制HSCs的增殖能力和ECM相關(guān)基因(α-SMA、COL-1和TIMP-1)的表達(dá)水平，在治療肝纖維化中發(fā)揮重要作用。

2.3 miRNA調(diào)控Wnt/β-catenin通路

Wnt/β-catenin通路是一種在進(jìn)化上比較保守的細(xì)胞信號系統(tǒng)。曾有研究報(bào)道指出Wnt/β-catenin通路在許多正常的未受刺激的成體細(xì)胞中是不活躍的，而確保這一穩(wěn)態(tài)平衡的是Wnt蛋白的缺失和β-catenin的降解[44]。近期，來自器官纖維化研究的新證據(jù)表明，Wnt/β-catenin信號途徑的持續(xù)激活與人類纖維化疾病的發(fā)病機(jī)制有關(guān)，如肺纖維化、腎纖維化和肝纖維化[45]。而這里我們主要總結(jié)Wnt/β-catenin通路與HSCs活化、增殖、凋亡的關(guān)系。Yang等[46]在對鋅指蛋白家族的研究中得知，鋅指E盒結(jié)合同源框1(ZEB1)作為一種轉(zhuǎn)錄抑制因子，通常正向調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號通路，促進(jìn)造血干細(xì)胞的激活和纖維化形成。但這種調(diào)控機(jī)制常常受到miR-708表達(dá)的干擾，當(dāng)miR-708在活化的HSCs和肝組織中的表達(dá)受到抑制，將伴隨ZEB1增加；而miR-708的過表達(dá)又會(huì)以負(fù)向調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號通路的形式使ZEB1下調(diào)，并降低HSCs的激活和增殖。Yu等[47]在CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化和活化的HSCs中檢測到miR-378a-3p的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)miR-378a-3p下調(diào)是導(dǎo)致膠原蛋白過量積累致纖維化的重要原因，上調(diào)可抑制HSCs的活化、增殖及α-SMA的表達(dá)，過表達(dá)時(shí)Wnt/β-catenin信號途徑完全被阻斷。Wnt/β-catenin途徑中的Wnt10a成員是miR-378a-3p的靶標(biāo)，轉(zhuǎn)染后的miR-378a-3p細(xì)胞會(huì)降低Wnt10a的mRNA和蛋白表達(dá)?？傊芯繑?shù)據(jù)證明miR-378a-3p可通過抑制Wnt10a來抑制HSCs活化/增殖而抗纖維化。Yu等[48]除分析了miR-378a-3p對HSCs活化及Wnt/β-catenin通路的影響，還開展了miR-17-5p激活與Wnt/β-catenin通路間的研究。miR-17-5p是miR-17-92家族中的成員之一，過表達(dá)時(shí)能促進(jìn)HSCs的活化和增殖，增加原代造血干細(xì)胞中α-SMA和結(jié)蛋白的水平。在該發(fā)展機(jī)制中還存在一個(gè)關(guān)鍵的靶點(diǎn)WIF1，miR-17-5p的上調(diào)或下調(diào)均需要負(fù)向調(diào)節(jié)WIF1來決定Wnt/β-catenin通路的活性。

2.4 miRNA調(diào)控NF-κB通路

核因子-κB(NF-κB)屬于二聚體轉(zhuǎn)錄因子家族，常在不同信號通路中作為整合因子(控制核定位和翻譯后修飾)來微調(diào)NF-κB反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄水平，主要參與協(xié)調(diào)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答及分化和增殖等[49]。隨著學(xué)術(shù)界對NF-κB通路的進(jìn)一步探索，發(fā)現(xiàn)NF-κB信號通路能通過促進(jìn)一些直接或間接激活HSCs的炎性因子(IL-1、IL-6、TNF-α)、趨化因子、炎性基因及TGF-β基因的表達(dá)，在肝纖維化的發(fā)生機(jī)制中起作用[50]。Zhang等[51]研究顯示在HFD小鼠模型和脂肪性肝炎患者的肝臟中均有miR-378家族的上調(diào)，使肝細(xì)胞衍生的促炎介質(zhì)合成增加，肝臟炎癥加重。除此之外，還發(fā)現(xiàn)miR-378家族能顯著增強(qiáng)NF-κB的活性和激活腫瘤壞死因子α(TNF-α)的表達(dá)，加快肝纖維化演化進(jìn)程。所以常常把miR-378家族作為是脂肪性肝炎肝纖維化治療的關(guān)鍵點(diǎn)。Kim等[52]和Zhang等[53]均提出了miR-125b是NF-κB的直接轉(zhuǎn)錄靶點(diǎn)的觀點(diǎn)。在肝纖維化中，miR-125常直接靶向腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)的蛋白3(TNFAIP3)來促進(jìn)NF-κB介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。然而當(dāng)他們將miR-125b抑制劑與TNFAIP3 siRNA共同作用在NF-κB信號通路上時(shí)，發(fā)現(xiàn)單獨(dú)的miR-125b抑制劑能大大改善肝纖維化誘導(dǎo)的肝損傷和炎癥反應(yīng)，但與TNFAIP3 siRNA共同治療反而會(huì)促纖維化。Zou等[54]發(fā)現(xiàn)miRNA-146a-5p也是治療肝纖維化的潛在靶點(diǎn)。在CCl4處理的原代大鼠HSCs自然激活期間會(huì)下調(diào)miRNA-146a-5p和上調(diào)腸源性內(nèi)毒素(IET)，通過靶向抑制NF-κB信號傳導(dǎo)通路上的IL-1受體相關(guān)激酶1(IRAK1)和TNF受體相關(guān)因子-6(TRAF6)，能間接抑制TGF-β/Smads信號通路并阻斷肝纖維化進(jìn)程。

2.5 miRNA調(diào)控其他信號通路

Matsumoto等[55]研究發(fā)現(xiàn)miR-29a是體內(nèi)少有的無細(xì)胞毒性的抗纖維化基因，能直接調(diào)節(jié)Ⅰ型膠原α1(COLI-α1)和血小板衍生生長因子C(PDGF-C)的mRNA表達(dá)，顯著抑制LX-2細(xì)胞系中COLI-α1 mRNA表達(dá)和誘導(dǎo)LX-2細(xì)胞凋亡。Yang等[56]確定了miR-26b-5p在肝纖維化和血管生成中的重要作用。miR-26b-5p在纖維化肝臟中表達(dá)下調(diào)，與PDGFR-β和血管生成標(biāo)志物呈負(fù)相關(guān)，過表達(dá)時(shí)減少PDGFR-β mRNA和蛋白的上調(diào)，抑制體內(nèi)HSCs活化和血管生成。miR-26b-5p還可以與lncRNA母系表達(dá)的基因3(lncMEG3)相互作用，抑制肝纖維化和血管再生，這將可能是肝纖維化的有效治療策略。Lei等[57]實(shí)驗(yàn)證明在體外肝纖維化模型中，miR-101是一種有效的抗纖維化因子，它可以顯著抑制HSCs的活化和增殖，減少ECM積聚，改善肝功能。而在CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠體內(nèi)過表達(dá)miR-101后，PI3K/Akt信號通路被抑制甚至失活，且肝臟中p-PI3K、p-Akt水平顯著下調(diào)?？偨Y(jié)體內(nèi)體外兩種結(jié)果，發(fā)現(xiàn)抑制PI3K/Akt信號通路可能是miR-101抗實(shí)驗(yàn)性肝纖維化的機(jī)制之一。Yang等[58]報(bào)道HSCs激活模型中的SIRT1不僅是調(diào)節(jié)miR-200a的新靶點(diǎn)，而且對Notch信號途徑的表達(dá)具有負(fù)性調(diào)節(jié)作用。在活化的HSCs中，miR-200a的缺失與SIRT1上調(diào)和Notch1下調(diào)相關(guān)，SIRT1下調(diào)增加了Notch1-細(xì)胞間域(NICD)蛋白的表達(dá)，反之，Notch的mRNA和蛋白水平的改變也可能在SIRT1影響Notch活性的降低中起作用。

3 miRNA相關(guān)的抗纖維化治療

肝纖維化是多數(shù)慢性肝病患者發(fā)展為肝硬化、肝癌的必然階段，它的預(yù)防或逆轉(zhuǎn)已成為新型肝臟特異性藥物臨床試驗(yàn)的主要終點(diǎn)[3]。我們可以從膠原合成、整合素和細(xì)胞及其特異性機(jī)制等多個(gè)方面著手[59]，在基于miRNA表達(dá)上來研究治療肝纖維化的潛在方法。

miRNA是一種很有吸引力的治療方法，因?yàn)閙iRNA能夠靶向多個(gè)基因，有助于同時(shí)操縱多個(gè)代償途徑。但將治療性miRNA遞送到相關(guān)靶組織中仍是一項(xiàng)艱巨的任務(wù)，一些已用于病毒性感染、ALD、NAFLD治療的miRNA模擬物和抗miRNA還處于Ⅰ期試驗(yàn)或Ⅱ期試驗(yàn)[60]。Kumar等[61]實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Hedgehog抑制劑(GDC-0449)和miR-29b1均能抑制促纖維化基因，便設(shè)想若將miRNA和化合物組合是否有協(xié)同治療效果。結(jié)果證實(shí)與單獨(dú)使用miR-29b1治療的小鼠相比，將miR-29b1和GDC-0449包裹的納米顆粒輸送到小鼠肝纖維化模型中，在靶向膠原沉積和改善肝損傷血清標(biāo)志物方面都產(chǎn)生了更好的效果。RG-101是一種與肝細(xì)胞靶向N-乙酰半乳糖胺偶聯(lián)的抗miR-122注射劑，Ⅰ期實(shí)驗(yàn)已證實(shí)RG-101可以顯著降低慢性丙型病毒感染患者體內(nèi)的病毒載量，從疾病早期阻斷其向纖維化轉(zhuǎn)變；Ⅱ期實(shí)驗(yàn)研究還在進(jìn)行中，目的是確定RG-101與直接作用抗病毒藥物聯(lián)合使用是否可以縮短療程且達(dá)到治療效果[62]。Lou等[63]曾大膽推測miR-122修飾是治療肝纖維化的一種新的潛在策略。他們調(diào)查發(fā)現(xiàn)單純的間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell，MSC)移植可能不足以治療肝纖維化，便鑒于miR-122對HSCs增殖和反式激活的負(fù)性調(diào)節(jié)作用，利用慢病毒介導(dǎo)的前miR-122轉(zhuǎn)染構(gòu)建了miR-122修飾的AMSC(AMSC-122)，結(jié)果表明miR-122修飾不但抑制了HSCs的活化和減少膠原蛋白的沉積，而且能增強(qiáng)AMSC在治療CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化中的療效。

4 問題與展望

miRNA是肝纖維化研究領(lǐng)域中一種很有前景的新方向，但以人類現(xiàn)有的技術(shù)條件，想把miRNA真正應(yīng)用于臨床實(shí)踐之中，還需要跨越許多障礙?，F(xiàn)階段，大多數(shù)研究都是作為單中心研究進(jìn)行的，只包括少數(shù)患者。而且由于qPCR和基于微陣列的測量依賴于miRNA特異性引物或微陣列探針的設(shè)計(jì)，不同miRNA之間的相似性可能會(huì)導(dǎo)致研究之間的比較更困難、更難以分辨。此外，數(shù)據(jù)歸一化問題也有待解決，主要是由于人類血清樣本中缺乏固有的有效的RNA管家基因，以及miRNA定量效率的平臺(tái)間差異較大，導(dǎo)致研究之間的可比性差[64]。最重要的是，到目前還沒有就樣本收集、數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化和分析的最佳方案達(dá)成共識(shí)。以我們研究miRNA、信號通路與肝纖維化之間的相關(guān)性來講，也存在著一些問題。首先，單一miRNA與miRNA家族對肝纖維化是否具有一樣的影響，在靶向治療上是否可以相互替代；其次，當(dāng)不同miRNA家族作用于同一信號通路的相同靶標(biāo)時(shí)，作用是加強(qiáng)，還是相互拮抗；最后，從實(shí)踐應(yīng)用角度來看，miRNA作為治療手段，是否可以被大多數(shù)患者接受。

總而言之，只有克服目前的局限性，miRNA才有可能進(jìn)一步運(yùn)用于診斷及治療中，上調(diào)或下調(diào)miRNA家族的表達(dá)也將是未來治療肝纖維化的最有前景的方法。