MicroRNA在缺血性腦卒中發(fā)生發(fā)展及其診斷治療中的作用研究進(jìn)展

楊利強 關(guān)欣 徐偉杰 武煜明 (昆明衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院，云南 昆明 650600；云南中醫(yī)藥大學(xué))

腦卒中是一種腦血管病變引起的神經(jīng)功能喪失的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，具有死亡率高、發(fā)病率高、致殘率高等特點〔1,2〕。我國現(xiàn)有1 100萬例急性腦缺血患者，且每年新發(fā)病約240萬例〔3〕。最新研究表明，腦卒中已成為我國居民致死原因第一位〔3〕。存活的患者中70%～80%有不同程度的神經(jīng)功能缺陷，重度致殘者占40%，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，加大了家庭和社會負(fù)擔(dān)〔4,5〕。因此，研究其發(fā)病機制及發(fā)病過程中人體生理的動態(tài)變化有重要意義。MicroRNA(miRNA)是一類高度保守的內(nèi)源性非編碼小RNA。大量研究表明，腦內(nèi)的miRNA表達(dá)水平變化與腦缺血發(fā)生過程具有一定的相關(guān)性，即miRNA參與缺血性腦卒中的病理發(fā)生發(fā)展過程〔6〕。本文綜合近年的相關(guān)研究，重點討論miRNA在缺血性腦卒中病理發(fā)生發(fā)展過程中的作用，為腦卒中新的治療方向提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 miRNA的生物學(xué)特性

miRNA是一類由20～24個核苷酸組成的內(nèi)源性非編碼單鏈小分子RNA〔7〕。廣泛存在于真核生物體內(nèi)，大量研究證實miRNA在各類物種中均具有高度保守性〔8〕。miRNA從生成到成熟涉及一系列步驟。miRNA首先在細(xì)胞核內(nèi)通過RNA聚合酶Ⅱ作用轉(zhuǎn)錄形成具有帽子結(jié)構(gòu)和多聚腺苷酸尾巴的pri-miRNA，在核酸酶Drosha和輔助因子Pasha作用下pri-miRNA被加工處理成含有發(fā)夾結(jié)構(gòu)，長60～70核苷酸的pre-miRNA〔9〕。pre-miRNA被RNA-GTP和exportin5從細(xì)胞核輸送到細(xì)胞質(zhì)，然后在核酸內(nèi)切酶ⅢDicer作用下剪切形成21～23 bp的成熟miRNA〔10〕。miRNA可以通過完全互補或部分互補靶向mRNA的3′-非編碼區(qū)(UTR)，誘導(dǎo)mRNA降解或抑制mRNA翻譯，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因的表達(dá)，從而參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡等生物體發(fā)育生長、衰老、死亡等過程〔11,12〕。目前，在人類基因組中已經(jīng)證實約1 500個基因由miRNAs編碼，在不同的生理和生存環(huán)境下調(diào)節(jié)各種mRNA表達(dá)〔13〕。在生物體中，每個miRNA可以作用于多個靶基因，而多個miRNAs也可以共同調(diào)控同一個靶基因表達(dá)，因此，miRNA和靶基因在體內(nèi)形成了一個復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

2 miRNA與缺血性腦卒中病理發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性

缺血性腦卒中的發(fā)生發(fā)展機制較為復(fù)雜，是時間和空間上同時激活的級聯(lián)反應(yīng)。具體機制主要包括大腦血腦屏障的破壞、神經(jīng)炎癥反應(yīng)的激活、自由基的氧化應(yīng)激及細(xì)胞自噬、凋亡等一系列反應(yīng)〔14〕。從病理發(fā)生發(fā)展的具體機制進(jìn)行靶點阻斷，對缺血后神經(jīng)功能的保護(hù)及腦功能區(qū)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的重塑具有重要作用，因此深入探尋miRNA與缺血性腦卒中病理發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性對缺血治療策略具有重要的指導(dǎo)意義。

2.1miRNAs與血腦屏障 腦缺血發(fā)生后會引起基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)、水通道蛋白(AQP)等因子表達(dá)水平升高。MMPs是破壞血腦屏障(BBB)的關(guān)鍵成分，缺血性腦損傷發(fā)生后，由促炎性因子誘導(dǎo)產(chǎn)生，從而破壞BBB的完整性，導(dǎo)致缺血性損傷可能向出血性損傷轉(zhuǎn)變。研究證實miRNA-21、miRNA-105和miR-128在表達(dá)水平升高時會引起MMPs活化，導(dǎo)致其表達(dá)水平增加，促進(jìn)腦水腫的形成，加劇腦損傷〔15,16〕。有研究表明，抑制腦缺血后miR-15a、miR-497表達(dá)水平，可以增加B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2蛋白水平和減少半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)-3活性，從而減輕腦缺血后BBB的破壞和腦梗死體積，對神經(jīng)功能缺損起到改善作用〔17,18〕。因此，深入研究miRNA與BBB兩者間的相互關(guān)系對腦缺血治療具有重要作用。

2.2miRNAs與腦缺血炎癥反應(yīng)的關(guān)系 缺血發(fā)生后會激活神經(jīng)炎癥反應(yīng)并在之后的病理過程中持續(xù)產(chǎn)生影響。大量研究表明，炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致急性缺血階段腦損傷的重要因素之一，其中中性粒細(xì)胞的聚集、浸潤是炎癥反應(yīng)激活的關(guān)鍵〔19〕。研究證實，miR-155和miR-328影響中性粒細(xì)胞的募集，同時通過負(fù)反饋調(diào)節(jié)影響中性粒細(xì)胞的吞噬作用、彈性蛋白酶的活性及活性氧(ROS)的產(chǎn)生，從而減輕了中性粒細(xì)胞的殺傷能力〔20,21〕。在急性缺血階段炎癥反應(yīng)的爆發(fā)會引起谷氨酸、ROS、NO等有害因子的大量分泌，而體外研究表明，過表達(dá)miRNA-23A可減少氧化應(yīng)激反應(yīng)中產(chǎn)生的ROS，從而起到保護(hù)作用〔19〕。最近研究還證實，低氧誘導(dǎo)因子(HIF)-1可以調(diào)控低氧條件下miRNA-210表達(dá)水平，而miRNA-210能夠抑制呼吸電子傳遞鏈復(fù)合體Ⅰ中鐵硫蛋白的支架蛋白ISCU1/2的表達(dá)，因此可以通過調(diào)節(jié)呼吸電子傳遞鏈復(fù)合體Ⅰ的正常表達(dá)，從而調(diào)控缺血過程中ROS的產(chǎn)生來減少缺血損傷〔22〕。miR-124也可以調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞的生存狀態(tài)，使其從促炎狀態(tài)向抗炎狀態(tài)轉(zhuǎn)化〔23〕。這些miRNAs在炎癥反應(yīng)中的作用均為臨床腦缺血治療中控制炎癥反應(yīng)減輕神經(jīng)損傷提供了更廣闊的思路。

2.3miRNAs與細(xì)胞凋亡 當(dāng)腦部血流中斷時，缺血中心區(qū)域的營養(yǎng)和能量供應(yīng)在幾分鐘內(nèi)會消耗枯竭，從而導(dǎo)致缺血核心區(qū)的神經(jīng)元出現(xiàn)不可逆的壞死性死亡。然而在缺血半影區(qū)和周邊區(qū)域的神經(jīng)元會受到不同程度的缺血影響，呈現(xiàn)不同的命運。這個過程中會導(dǎo)致酪氨酸激酶(JAK)2、蛋白激酶B(AKT)、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)等多種信號通路激活，調(diào)控下游相關(guān)凋亡基因的表達(dá)水平，從而影響神經(jīng)元的凋亡〔24〕。研究證實，腦卒中后過表達(dá)miR-582-5p會通過激活蛋白酶活化受體(PRA)-1來調(diào)控神經(jīng)元凋亡，而低表達(dá)miR-134可以通過調(diào)節(jié)靶基因HSPA12B表達(dá)來保護(hù)缺血再灌注損傷〔25〕。研究表明，在腦缺血再灌注損傷模型中注射miR-106b-5p拮抗劑可顯著降低體內(nèi)由于自由基脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生的丙二醛對細(xì)胞的損傷作用，同時恢復(fù)超氧化物歧化酶(SOD)的活性，增加髓樣細(xì)胞白血病(Mcl)-1和Bcl-2蛋白表達(dá)水平，從而減少細(xì)胞凋亡的損傷〔26〕。體外實驗也證實，在PC12細(xì)胞中添加miR-106b-5p抑制劑增加了Mcl-1和Bcl-2表達(dá)水平，從而減輕了谷氨酸誘導(dǎo)的氧化損傷和細(xì)胞凋亡〔26〕。以上結(jié)果表明，在缺血缺氧過程中miRNAs可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡來減輕缺血損傷，這可能是一種潛在的神經(jīng)保護(hù)機制。

2.4miRNAs與神經(jīng)發(fā)生 腦缺血發(fā)生后會出現(xiàn)大量的神經(jīng)元死亡，從而導(dǎo)致患者神經(jīng)功能障礙。腦缺血后神經(jīng)發(fā)生在時間和空間上是一個動態(tài)發(fā)展的過程，需要大量的神經(jīng)生長因子和一系列信號通路的級聯(lián)反應(yīng)參與。近年來的研究也表明，miRNA在胚胎的發(fā)育成熟、成體神經(jīng)的發(fā)生及缺血性腦損傷后的神經(jīng)發(fā)生過程中都發(fā)揮著重要的調(diào)控作用〔27〕。

研究發(fā)現(xiàn)，在嗅球、海馬和紋狀體等腦內(nèi)再生能力旺盛的區(qū)域，由神經(jīng)干細(xì)胞分化的新生神經(jīng)元整合到現(xiàn)有神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的過程中，被CREB上調(diào)的miR-132顯著促進(jìn)突觸連接的形成和神經(jīng)遞質(zhì)傳遞〔28,29〕。體外研究也證實，高表達(dá)狀態(tài)的miR-132促進(jìn)神經(jīng)突的生長發(fā)育和新突觸的建立，而抑制miR-132的表達(dá)會導(dǎo)致樹突生長能力顯著減弱和突觸密度降低〔30〕。在大鼠原代皮層神經(jīng)元中有20%～40%的miRNA表達(dá)可能受神經(jīng)發(fā)育調(diào)節(jié)，同時，一些miRNA的表達(dá)水平(如miR-128、-191、-323、-324-5p、-326、-329和-344)顯著增加，和其在皮層神經(jīng)發(fā)育中的表達(dá)趨勢一致〔31〕。在神經(jīng)元分化(miR-23、-23b)和突觸形成中也發(fā)現(xiàn)了特異性表達(dá)的miRNA譜圖〔31〕。研究發(fā)現(xiàn)阻斷腦富集非編碼小RNA miR-124會引起腦室下區(qū)(SVZ)細(xì)胞保持分裂狀態(tài)，而miR-124的異位表達(dá)能夠促進(jìn)早熟神經(jīng)元分化〔32〕。在神經(jīng)再生期間敲低內(nèi)源性miR-124會導(dǎo)致增生的形成和神經(jīng)元再生的延遲。鑒定發(fā)現(xiàn)Sox9是SVZ成神經(jīng)細(xì)胞中miRNA-124的重要生理靶點，在SVZ細(xì)胞中過表達(dá)Sox9會抑制神經(jīng)元的產(chǎn)生；相反，敲低Sox9基因則導(dǎo)致神經(jīng)發(fā)生增加和神經(jīng)膠質(zhì)形成減少〔33〕。因此，我們應(yīng)該增加腦缺血后通過調(diào)控相關(guān) miRNA 的表達(dá)水平來干預(yù)或刺激神經(jīng)發(fā)生來恢復(fù)腦卒中患者神經(jīng)功能的研究，為腦卒中治療提供一種新的治療方向。

3 miRNAs在腦缺血診治過程中的應(yīng)用

目前，在臨床上治療腦缺血疾病得到認(rèn)可并有效使用藥物依然很少。組織型纖維蛋白溶酶原激活劑(tPA)就是公認(rèn)的能夠有效使用的溶栓藥物，但由于其在使用過程中有應(yīng)用時間窗(3～6 h)要求，從而受到了極大的使用限制〔34〕。當(dāng)前關(guān)于腦缺血疾病治療的研究主要集中在缺血核心區(qū)血流運輸?shù)闹厮芗吧窠?jīng)元的再生，然而血管重塑和神經(jīng)元再生涉及的機制比較復(fù)雜，所以仍然需要我們積極深入探尋新的治療靶點。通過對急性缺血性腦卒中患者的血清進(jìn)行miRNA芯片分析發(fā)現(xiàn)115種miRNA呈現(xiàn)差異性表達(dá)，其中hsa-let-7f、miR-126、miR-1259、miR-142-3p、miR-15b、miR-186、miR-519e、miR-768-5p表達(dá)下調(diào)及rno-miR-19b，rno-miR-290，rno-miR-292-5p表達(dá)上調(diào)〔35〕。用C57BL/6小鼠構(gòu)建大腦中動脈栓塞(MCAO)模型研究腦缺血再灌注損傷后miRNAs變化時，發(fā)現(xiàn)缺血模型組有24種循環(huán)miRNAs表達(dá)豐度出現(xiàn)了上調(diào)，其中miR-1264、miR-1298、miR-448在再灌注3 h后表達(dá)量達(dá)到高峰，此后呈現(xiàn)逐漸下降趨勢，而在出血性模型組中循環(huán)miRNAs水平并沒有變化〔36〕。這些結(jié)果提示我們這些miRNAs不僅可以作為急性腦缺血診斷的生物學(xué)標(biāo)志物，還可以成為潛在的治療靶點。

miRNA除了作為腦缺血診斷和預(yù)測的生物學(xué)標(biāo)志物，對于腦缺血的治療也有一定意義。miRNA可以同時調(diào)控多個靶基因的表達(dá)水平，參與腦缺血病理發(fā)生發(fā)展過程的調(diào)節(jié)〔37〕，因此有望成為缺血性腦卒中治療的潛在靶點。目前，針對miRNA進(jìn)行干預(yù)或影響主要是通過antagomi與miRNA強競爭性結(jié)合，阻止miRNA與其靶基因mRNA的互補配對，從而抑制miRNA發(fā)揮作用或使用miRNA mimics增強內(nèi)源性miRNA的功能，從而提高其沉默作用。上述研究方法在體內(nèi)體外實驗的成功驗證讓我們相信隨著研究的進(jìn)一步深入，miRNA有治療缺血性腦卒中的潛力。

綜上，miRNAs在生物體內(nèi)的基因表達(dá)網(wǎng)絡(luò)中起著重要的調(diào)控作用，參與了發(fā)育、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定及多種生理病理的反應(yīng)和多種信號通路途徑的調(diào)節(jié)。缺血性腦卒中的病理發(fā)生發(fā)展和修復(fù)在時間、空間上是一個動態(tài)變化的過程，其中涉及BBB的破壞、神經(jīng)炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、神經(jīng)發(fā)生等。眾所周知，隨著miRNA的研究深入，其在疾病診斷治療應(yīng)用中越來越廣泛，miRNA在缺血性腦卒中病理發(fā)生發(fā)展和修復(fù)過程中的研究也是目前的熱點之一。同時，miRNA由于其結(jié)構(gòu)簡單易于合成，而且可以穿越BBB，并且在外周血清中穩(wěn)定表達(dá)的特點，揭示了它在臨床疾病診斷和治療中的潛力，為其成為缺血性腦卒中臨床診斷的生物標(biāo)志物和治療靶點提供了可能。