不同色譜技術(shù)測定乳制品中N-乙酰神經(jīng)氨酸的比較研究

宋戈,劉九陽,苗晶,李博群

（1.黑龍江省綠色食品科學(xué)研究院，哈爾濱 150028；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，哈爾濱 150030）

0 引言

N-乙酰神經(jīng)氨酸廣泛存在于多種生物組織中，是構(gòu)成細(xì)胞膜上糖蛋白和糖脂的重要成分，在大部分哺乳動物組織中發(fā)現(xiàn)的唾液酸主要是N-乙酰神經(jīng)氨酸，所以通常把N-乙酰神經(jīng)氨酸稱為唾液酸，它參與細(xì)胞表面的多種生理功能。另外，N-乙酰神經(jīng)氨酸是一種天然的大腦營養(yǎng)素，它能促進(jìn)嬰兒的記憶力和智力發(fā)育[1]。N-乙酰神經(jīng)氨酸的食物來源主要是母乳，尤其是初乳中的含量最高，也存在于牛奶、雞蛋和奶酪中。隨著國家衛(wèi)生計(jì)生委發(fā)布2017年7號公告，N-乙酰神經(jīng)氨酸已作為營養(yǎng)素添加到除嬰幼兒食品外的食品中，尤其是調(diào)制配方粉。分析N-乙酰神經(jīng)氨酸的方法很多，主要有高效液相色譜法[2-10]、氣相色譜法[11]、高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[12-14]、脈沖電化學(xué)高效陰離子交換色譜檢測法[15-18]等。

本研究嘗試建立離子交換色譜測定乳制品中N-乙酰神經(jīng)氨酸的方法，優(yōu)化水解提取的條件和離子色譜分析條件。比較離子交換色譜法、超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法和液相色譜法測定乳制品中N-乙酰神經(jīng)氨酸后，采用離子交換色譜法測定N-乙酰神經(jīng)氨酸，操作簡便，結(jié)果可靠，干擾較小，可為乳制品中N-乙酰神經(jīng)氨酸含量的測定提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

N-乙酰神經(jīng)氨酸(≥99%)，德國Dr.Ehretorfer公司；50%氫氧化鈉(色譜純)、乙酸鈉(色譜純)、乙酸銨（色譜純）、甲酸（色譜純），SIGMA公司；濃硫酸（分析純）、氫氧化鈉（分析純）,西隴公司；乙腈（色譜純）、四氫呋喃（色譜純）,美國默克公司；磷酸（色譜純），科密歐公司；所有用水均為電阻率≥18.2 MΩ·cm的超純水；以上試劑除標(biāo)注的外均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

AB4500超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀,美國AB公司；ICS-5000離子色譜儀配脈沖安培檢測器,thermo公司；LC-20A高效液相色譜儀配熒光檢測器，日本島津公司；TTL-DCⅡ水浴加熱儀,北京同泰聯(lián)科技有限公司；pB-10酸度計(jì)，德國Sartorius公司；KQ-250DE超聲波振蕩器，昆山市超聲儀器公司；VORTEX3渦旋混合器，德國IKA公司；SQP天平，德國Sartorius公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液與淋洗液的配制

N-乙酰神經(jīng)氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液(500 mg/L)：準(zhǔn)確稱取0.05 g(精確至0.1 mg)的N-乙酰神經(jīng)氨酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)于25 mL容量瓶中，加入約10 mL水，超聲溶解后冷卻至室溫,用水定容、搖勻。

N-乙酰神經(jīng)氨酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：取適量N-乙酰神經(jīng)氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用水配制成質(zhì)量濃度為1.0、5.0、10.0、25.0、50.0、100.0、1 000.0 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液，用于離子色譜法和液相色譜法測定。取適量10.00 mg/L的N-乙酰神經(jīng)氨酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，用乙腈 配 制 成 質(zhì) 量 濃 度 為5.0、10.0、50.0、100.0、200.0、500.0 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液，用于超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定。

淋洗液A純水：電阻率≥18.2 MΩ·cm的超純水。

淋洗液B氫氧化鈉溶液(200 mmol/L)：取10.4 mL 50%氫氧化鈉溶液，用水稀釋至1 000 mL，通入氮?dú)獗Ｗo(hù)，緩慢搖勻。

淋洗液C乙酸鈉(500 mmol/L)混合溶液：稱取41 g無水乙酸鈉(精確至0.01 g)，用約500 mL水溶解，0.22 μm濾膜過濾，脫氣10 min，加入7.8 mL 50%氫氧化鈉溶液，并用水稀釋至1 000 mL，通入氮?dú)獗Ｗo(hù)，緩慢搖勻。

1.3.2 樣品處理

稱取調(diào)制乳粉或配方乳粉約10.0 g于50 mL三角瓶中，加入50 mL(50±5℃）的水將試樣振蕩溶解并超聲20 min；稱取液奶或酸奶約50 g，用水轉(zhuǎn)移定容至100 mL搖勻。準(zhǔn)確移取10 mL定容搖勻的溶液，加入10 mL 0.1 mol/L硫酸，80度水浴1 h，取出冷卻用1.0 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH到4.5～4.6后轉(zhuǎn)移，用水定容到25 mL，離心過濾，濾液備用。

1.3.3 離子交換色譜法測定

色譜柱：CarboPac PA10，250×4.6 mm；保護(hù)柱：CarboPac PA10，50×4 mm；檢測器參數(shù)：Au電極，AgCl參比模式，標(biāo)準(zhǔn)四電位波形；流速：1.0 mL/min。

淋洗條件：0～15 min，120 mmol/L NaOH 60 mmol/L NaAc（50%淋洗液B,12%淋洗液C）；15.1～25 min，100 mmol/L NaOH 500 mmol/L NaAc（100%淋洗液C）；25.1～35 min，200 mmol/L NaOH（100%淋洗液B）；35.1～45 min，120 mmol/L NaOH 60 mmol/L NaAc（50%淋洗液B，12%淋洗液C）。進(jìn)樣方式：自動進(jìn)樣；進(jìn)樣體積：25 μL；柱溫：30℃。

取備用濾液和標(biāo)準(zhǔn)工作液過膜上機(jī)測定。

1.3.4 超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定

色譜柱：Waters HILIC 100×2.1 mm,1.7 μm；流動相：A10 mmol/L乙酸銨溶液，B乙腈。

洗脫梯度：0～1.0 min，95% B；1.0～2.0 min，95% B～50%B；2.0～5.0min，50%B；5.0～6.0 min，50% B～95%B；6.0～9.0 min，95%B。進(jìn)樣方式：自動進(jìn)樣；進(jìn)樣量：5 μL；柱溫：30℃；流速：400 μL/min。

質(zhì)譜參考條件：電離方式，電噴霧正離子模式；檢測方式，多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；離子源溫度(TEM):550℃；霧化氣(Gas1)：45；輔助氣(Gas2)：55；氣簾氣(Gurtain Gas)：30；電 噴 霧 電 壓：5 500 V；碰 撞 氣（CAD）：12；定性離子、定量離子、碎裂電壓和碰撞能量見表1。

表1 化合物定性、定量離子和質(zhì)譜分析參數(shù)

移取備用濾液1 mL于10 mL容量瓶中，用乙腈定容搖勻過膜后和標(biāo)準(zhǔn)工作液直接上機(jī)測定。

1.3.5 液相色譜法測定

色譜柱：島津AQ-C18，250×4.6 mm，5 μm；檢測器參數(shù)：熒光檢測器，激發(fā)波長230 nm，發(fā)射波長425 nm；流速：1.0 mL/min。流動相：95%乙腈水溶液+1%四氫呋喃水溶液(含0.2%磷酸)=9∶1；進(jìn)樣方式:自動進(jìn)樣；進(jìn)樣體積:25 μL；柱溫:30℃。

分別取備用濾液和系列標(biāo)準(zhǔn)工作液1.0 mL，于15 mL離心管中，再加入1.0 mL濃度為5 mg/mL鄰苯二胺溶液(用0.1 mol/L硫酸氫鈉配制)，搖勻后置于80℃水浴下衍生50 min，冷卻，過膜上機(jī)測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 水解條件的優(yōu)化

N-乙酰神經(jīng)氨酸是一種碳水化合物,它以九碳酮糖酸-神經(jīng)氨酸為骨架,通常在糖蛋白或糖脂的末端以糖苷的形式存在[1,19]。乳制品中的N-乙酰神經(jīng)氨酸主要以3種形式存在：游離態(tài)、蛋白結(jié)合態(tài)以及低聚糖結(jié)合態(tài)。為準(zhǔn)確測定乳制品中N-乙酰神經(jīng)氨酸的含量，需要釋放出結(jié)合態(tài)的N-乙酰神經(jīng)氨酸。依據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[2-4]選取0.1 mol/L硫酸在80℃的溫度條件下水解條件,以盡可能地完全水解釋放N-乙酰神經(jīng)氨酸，對含N-乙酰神經(jīng)氨酸的乳粉樣品及加標(biāo)樣品進(jìn)行不同水解條件的測試?？疾炝嗽?0℃的溫度條件下,當(dāng)加入10 mL 0.1 mol/L硫酸溶液，不同反應(yīng)時間對測定結(jié)果的影響如圖1所示；考察了當(dāng)反應(yīng)時間為60 min，加入不同體積的0.1 mol/L硫酸溶液對測定結(jié)果的影響如圖2所示。最終確定為1.3.2中的水解條件：10 mL樣品溶液加入10 mL、0.1 mol/L硫酸溶液，在80℃水浴60 min水解，用離子交換色譜法進(jìn)行測定，結(jié)果較為穩(wěn)定，回收率較好。

圖1 80℃下加入10 mL0.1 mol/L硫酸溶液水解反應(yīng)時間與回收率

圖2 80℃下水解反應(yīng)60 min加入0.1 mol/L硫酸溶液體積與回收率

2.2 離子色譜法色譜條件的確定

N-乙酰神經(jīng)氨酸是一種酸性化合物,在堿性淋洗液條件下易變成陰離子,所以N-乙酰神經(jīng)氨酸在陰離子交換柱上的保留比樣品溶液中單糖、雙糖都強(qiáng)很多。結(jié)合實(shí)驗(yàn)室的條件,選取色譜柱容量一般的陰離子交換柱CarboPacPA10，雖然N-乙酰神經(jīng)氨酸與乳糖很容易分離，但N-乙酰神經(jīng)氨酸在強(qiáng)堿性條件下容易發(fā)生結(jié)構(gòu)改變或取代基移位,所以不能只通過增大NaOH濃度來達(dá)到使N-乙酰神經(jīng)氨酸在陰離子交換色譜柱上盡快洗脫的目的[16]，洗脫開始采用120 mmol/LNaOH和60 mmol/LNaAc等度淋洗15 min的有效淋洗，使N-乙酰神經(jīng)氨酸在盡可能短的時間內(nèi)得到理想分離。另外,乳制品成分復(fù)雜，酸化后的溶液還常常伴隨著更難洗脫的低聚糖和糖蛋白，如果沒能洗脫下來，會對下一個樣品的測定產(chǎn)生影響，導(dǎo)致保留時間的不穩(wěn)定和測定結(jié)果的重復(fù)性差，必須采用具有更強(qiáng)淋洗能力的溶液進(jìn)行洗脫。待N-乙酰神經(jīng)氨酸洗脫出來后，采用大濃度500 mmol/L NaAc溶液和高濃度200 mmol/L NaOH溶液交替沖洗色譜柱，最后再回到初始濃度的NaAc溶液和NaOH溶液平衡，準(zhǔn)備運(yùn)行下一個樣品，最終確定為1.3.3中的淋洗條件。樣品中N-乙酰神經(jīng)氨酸測定結(jié)果的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性較好，標(biāo)樣和樣品測定色譜如圖3和圖4所示。

圖3 標(biāo)樣測定色譜

圖4 配方粉樣品測定色譜

2.3 超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法條件的確定

在ESI+和ESI-模式下對N-乙酰神經(jīng)氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液母離子進(jìn)行全掃描，結(jié)果表明在正離子模式下較理想[14]，N-乙酰神經(jīng)氨酸正離子模式下的響應(yīng)或靈敏度比負(fù)離子模式[13]高出一倍。在ESI+模式下，對N-乙酰神經(jīng)氨酸的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行母離子全掃描，以確定N-乙酰神經(jīng)氨酸的準(zhǔn)分子離子并優(yōu)化質(zhì)譜條件。以其準(zhǔn)分子離子為其母離子，對其子離子進(jìn)行全掃描，選擇碎片離子豐度較高的兩個離子分別作為定性和定量離子（響應(yīng)值高的子離子為定量離子，另外一個為定性離子），在ESI+和MRM模式下優(yōu)化各種質(zhì)譜調(diào)諧參數(shù)見表1。N-乙酰神經(jīng)氨酸是一種極性酸性化合物,在一般的鍵合C18色譜柱上保留很弱或幾乎不保留。為了增強(qiáng)保留，可以在流動相中添加陽離子對試劑[12]，但對質(zhì)譜儀會造成污染，甚至?xí)种颇繕?biāo)物的電離。結(jié)合實(shí)驗(yàn)室條件，選擇N-乙酰神經(jīng)氨酸有特殊保留的HILIC色譜柱[14]和經(jīng)特殊處理有氫鍵作用的C18色譜柱T3[13]進(jìn)行分離分析比對。同一濃度的N-乙酰神經(jīng)氨酸經(jīng)色譜柱分離后在質(zhì)譜上的響應(yīng)或靈敏度相差無幾，但HILIC色譜柱比色譜柱T3的保留和分離效果更好，如圖5和圖6所示。

圖5 HILIC色譜柱分離選擇子離子流色譜

圖6 T3色譜柱分離選擇子離子流色譜

2.4 液相色譜法探討

N-乙酰神經(jīng)氨酸無紫外吸收，但在酸性條件下可與鄰苯二氨反應(yīng)，生成有強(qiáng)紫外吸收及熒光的衍生物[20-24]，可以用液相色譜儀熒光檢測器檢測。依據(jù)文獻(xiàn)[4]對系列標(biāo)準(zhǔn)工作液和樣品溶液進(jìn)行衍生測定，不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液疊加色譜和標(biāo)準(zhǔn)工作液與樣品溶液疊加色譜如圖7和圖8所示。從不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液疊加色譜圖中可以看出標(biāo)樣衍生后的標(biāo)志物有不少，而且均呈比例，相互間分離度較差，不利于準(zhǔn)確定性和定量計(jì)算。

圖8 標(biāo)準(zhǔn)工作液與樣品溶液疊加色譜

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

取不同濃度1.0、5.0、10.0、25.0、50.0、100.0、1 000.0 mg/L的N-乙酰神經(jīng)氨酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，用離子交換色譜儀測定，記錄目標(biāo)峰峰面積。取不同濃度5.0、10.0、50.0、100.0、200.0、500.0 μg/L的N-乙酰神經(jīng)氨酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀測定，記錄目標(biāo)峰峰面積。以峰面積與標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度繪制線性回歸曲線，并以3倍信噪比計(jì)算出固體樣品稱取10.0 g的檢出限，結(jié)果見表2。

表2 不同方法的線性和檢出限

2.6 回收率和精密度

以同一個全脂乳粉為實(shí)驗(yàn)材料，稱取10 g樣品后，再分別加入1.0 mg和5.0 mg的N-乙酰神經(jīng)氨酸標(biāo)樣，對樣品及兩個不同濃度的加標(biāo)樣品進(jìn)行6次平行測定，計(jì)算樣品的精密度、回收率及回收率的精密度(RSD)。離子交換色譜法和超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法的回收率和精密度見表3。由此可以看出，離子交換色譜法測定結(jié)果較為穩(wěn)定，重復(fù)性和準(zhǔn)確性較好。

表3 不同方法的回收率和精密度 (n=6)

2.7 實(shí)際樣品的測定

按照本方法對市售的乳制品樣品進(jìn)行N-乙酰神經(jīng)氨酸含量的測定，結(jié)果見表4。從實(shí)際樣品的檢測結(jié)果來看，離子交換色譜法的靈敏度和準(zhǔn)確度可以滿足實(shí)際測試的需求。

表4 不同方法測定樣品中N-乙酰神經(jīng)氨酸的含量mg/100 g

3 結(jié)論

本文重點(diǎn)探討了乳制品中N-乙酰神經(jīng)氨酸水解的條件，建立了檢測N-乙酰神經(jīng)氨酸的離子交換色譜法。比較了離子交換色譜法、超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法、液相色譜法測定N-乙酰神經(jīng)氨酸的優(yōu)劣。離子交換色譜法具有良好的線性，操作簡便，結(jié)果可靠，干擾小，同時重復(fù)性好，準(zhǔn)確度高，適合乳制品中N-乙酰神經(jīng)氨酸含量的生產(chǎn)監(jiān)測和監(jiān)管檢測。