低分子質(zhì)量殼寡糖對鰱魚冷藏過程中魚肉品質(zhì)及菌相的影響

賈世亮，楊 月，賈志芳，周緒霞

（浙江工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，浙江省深藍漁業(yè)資源高效開發(fā)利用重點實驗室，浙江 杭州 310014）

鰱魚，又稱白鰱，屬于鯉形目、鯉科，是著名的四大家魚之一。根據(jù)中國漁業(yè)年鑒統(tǒng)計數(shù)據(jù)，2021年我國鰱魚產(chǎn)量為383.7 萬t[1]，是我國產(chǎn)量第二高的淡水魚類，分布在全國各大水系。鰱魚生長速度快、營養(yǎng)價值高、價格低廉，肉色白、質(zhì)嫩、加工性能優(yōu)良，是加工前景非常廣闊的淡水魚種[2]。但由于富含水分和蛋白質(zhì)，鰱魚在貯藏過程中極易發(fā)生腐敗變質(zhì)。目前市場上白鰱魚銷售通常以鮮活為主，而且不容易?；?，有很大的產(chǎn)地局限性；而大型超市低溫冷藏銷售的鰱魚片也存在質(zhì)量劣變快、貨架期短的問題。然而，隨著經(jīng)濟發(fā)展、生活水平的提高以及消費觀念的轉(zhuǎn)變，人們越來越關(guān)注水產(chǎn)品的新鮮度。新鮮度是水產(chǎn)品重要的品質(zhì)指標(biāo)，也是決定其價格及市場的主要因素[3]，因此亟需研發(fā)針對淡水魚類的高效保鮮技術(shù)。目前，水產(chǎn)品保鮮主要有冷凍保鮮和化學(xué)保鮮等，但以上技術(shù)存在蛋白質(zhì)變性、營養(yǎng)成分流失和化學(xué)藥品殘留等問題[4]，因而安全、無毒的天然保鮮劑的應(yīng)用越來越受到青睞。

殼寡糖，學(xué)名β-1,4-寡糖-葡萄糖胺，是殼聚糖經(jīng)過物理、化學(xué)或生物等方法降解得到的一種聚合度在20以下、分子質(zhì)量小于3 900 Da的糖[5]。許多科學(xué)家把殼寡糖與蛋白質(zhì)、脂肪、糖類、維生素、礦物質(zhì)并列，譽為第六生命要素。根據(jù)《中華人民共和國食品安全法》和《新食品原料安全性審查管理辦法》有關(guān)規(guī)定，已批準(zhǔn)殼寡糖為新的食品原料應(yīng)用于食品加工領(lǐng)域。與大分子質(zhì)量的殼聚糖相比，殼寡糖分子鏈較短，水溶性較好，生物活性更高，更容易被生物吸收。同時，殼寡糖具有抗氧化、抗衰老、降膽固醇及免疫調(diào)節(jié)等功能活性[6-8]，因此，在農(nóng)業(yè)、食品、化妝品、醫(yī)藥等領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用。目前，殼寡糖在食品保鮮領(lǐng)域的應(yīng)用越來越廣泛，大量研究表明，用殼寡糖制成的純天然保鮮劑，保鮮效果顯著，可滿足果蔬貯藏、運輸和銷售等環(huán)節(jié)的保鮮要求[9-10]，然而，殼寡糖應(yīng)用于水產(chǎn)品保鮮上的研究較少。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮活鰱魚30 條（平均體質(zhì)量（1 203±76） g，體長（47.5±1.7） cm）購自北京小月河農(nóng)貿(mào)市場，所有魚均活體送至實驗室。

殼寡糖（分子質(zhì)量≤1 000 Da，脫乙酰度≥90%，聚合度2～6） 大連中科格萊克生物科技有限公司；ATP、二磷酸腺苷（adenosine-5’-diphosphate，ADP）、一磷酸腺苷（adenosine-5’-monophosphate，AMP）、肌苷酸（inosine-5’-monophosphate，IMP）、肌苷（inosine，HxR）、次黃嘌呤（hypoxanthine，Hx）標(biāo)準(zhǔn)品（均為色譜純） 美國Sigma公司；細(xì)菌基因組DNA快速提取試劑盒 北京博邁德基因技術(shù)有限公司；AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒 美國Axygen公司；其他試劑均為分析純 北京化學(xué)試劑公司。

1.2 儀器與設(shè)備

CXTH-3000高效液相色譜儀 北京創(chuàng)新通恒科技有限公司；FE20/EL20插入式pH計 梅特勒-托利多（上海）儀器有限公司；GL-21M高速冷凍離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司；5424R高速臺式冷凍離心機德國Eppendorf公司；IKA-T18高速勻漿機 艾卡（廣州）儀器設(shè)備有限公司；QL-901旋渦混合器 海門其林貝爾儀器制造有限公司；ABI GeneAmp?9700聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；YT-CJ-1ND超凈工作臺 北京亞泰科隆實驗科技開發(fā)中心；高壓滅菌鍋 合肥華泰醫(yī)療設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 鰱魚片樣品制備

鰱魚擊暈后，立即去鱗和內(nèi)臟，用流動自來水沖洗干凈后切成魚片，將魚片清洗干凈并瀝水后放入聚乙烯保鮮袋中。將準(zhǔn)備好的魚片（158±7） g隨機分為2 組：對照組（未處理魚片）和殼寡糖組（0.5 g/100 mL殼寡糖溶液浸泡30 min的魚片）。將2 組魚片分別裝入聚乙烯保鮮袋中，置于4 ℃冰箱中冷藏。于0、2、4、6、8 d隨機選取3 個魚片進行指標(biāo)測定。

1.3.2 感官評價

數(shù)學(xué)概念、定理內(nèi)涵豐富、外延廣泛，學(xué)生對它的認(rèn)識不可能一蹴而就，需要經(jīng)歷一個由感性認(rèn)識到理性認(rèn)識的循環(huán)往復(fù)的過程，因此，教師要為學(xué)生提供合適的時間和思維空間，挖掘“微型探究”資源，使學(xué)生在反思中達成對知識本質(zhì)的再認(rèn)識，領(lǐng)悟其奧妙，揭示其深刻性，從而不斷升華對概念、定理的理解，完善認(rèn)知結(jié)構(gòu)，提升數(shù)學(xué)素養(yǎng).

參照Meilgaard等[12]的方法進行，感官小組成員根據(jù)感官評價標(biāo)準(zhǔn)（表1）對魚片的感官指標(biāo)（色澤、氣味、質(zhì)地及總體評價）進行打分。打分使用9 分制，1 分代表質(zhì)量最差，9 分代表質(zhì)量最好，低于5 分表示魚片感官不能接受。

表1 鰱魚感官評分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Criteria for sensory evaluation of silver carp fillets

1.3.3 菌落總數(shù)測定

參照GB 4789.2—2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 菌落總數(shù)測定》進行菌落總數(shù)測定。準(zhǔn)確稱取5.0 g背部肌肉魚片于無菌均質(zhì)袋中，加入45 mL無菌生理鹽水，于拍打式均質(zhì)機中拍打30 s，制得1∶10的樣品稀釋液。隨后將0.5 mL樣品稀釋液用4.5 mL無菌生理鹽水進行連續(xù)10 倍梯度稀釋。選擇2～3 個合適稀釋度，取100 μL樣品均勻涂布于平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基。以上操作在超凈工作臺中進行，將平板置于30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后計數(shù)。

1.3.4 菌相組成測定

1.3.4.1 DNA提取及16S rDNA PCR擴增

細(xì)菌DNA提取主要參照Zhuang Shuai等[13]的方法，采用細(xì)菌基因組DNA快速提取試劑盒提取基因組，-20 ℃凍藏，PCR擴增前融化，將3 次取樣均勻混合后，通過PCR擴增細(xì)菌16S rRNA的V3～V4區(qū)，引物為338F（5’-barcode-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’）和907R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）。PCR反應(yīng)體系（20 μL）：4 μL 5×FastPfu緩沖液、2 μL 2.5 mmol/L dNTPs、0.8 μL正向引物（5 μmol/L）、0.8 μL反向引物（5 μmol/L）、0.4 μL Trans Gen FastPfuDNA聚合酶、10 ng模板DNA，ddH2O補齊至20 μL。PCR擴增反應(yīng)程序：95 ℃變性3 min；以95 ℃、30 s，55 ℃、30 s，72 ℃、45 s擴增25 個循環(huán)；72 ℃、5 min。2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，等濃度混樣，通過凝膠回收試劑盒回收純化PCR產(chǎn)物。

1.3.4.2 Illumina MiSeq高通量測序

MiSeq建庫及基因測序委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行，DNA序列測序、拼接、質(zhì)控及生物信息學(xué)高級分析由該公司協(xié)助完成。

1.3.5 ATP關(guān)聯(lián)物含量及K值測定

ATP關(guān)聯(lián)物的測定采用反相高效液相色譜法，參照Zhang Longteng等[14]的方法并稍作修改。稱取1.00 g絞碎魚肉，加入預(yù)冷的體積分?jǐn)?shù)10%高氯酸2 mL，研磨，漿液在4 000 r/min條件下離心3 min，取上清液，沉淀用2 mL預(yù)冷的體積分?jǐn)?shù)5%高氯酸洗滌并離心，重復(fù)該步驟1 次，合并上清液。用1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至6.40±0.04，4 000 r/min離心3 min，沉淀用pH 6.40的高氯酸洗滌，合并上清液并定容至10 mL。樣液用0.22 μm濾膜過濾，用反相高效液相色譜法進行分析。色譜條件：COSMOSIL 5C18-PAQ色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為pH 6.8的磷酸鹽緩沖液；流速1 mL/min、進樣量50 μL、檢測波長254 nm、室溫。將ATP、ADP、AMP、IMP、HxR和Hx標(biāo)準(zhǔn)品分別配制成質(zhì)量濃度梯度為0.01、0.02、0.04、0.08、0.10、0.20 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，在與樣品相同的高效液相色譜條件下進行測定，利用各標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度和相應(yīng)峰面積建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，ATP關(guān)聯(lián)物含量按照標(biāo)準(zhǔn)曲線來定量。K值按下式計算。

式中：各物質(zhì)含量單位均為μmol/g。

1.3.6 TVB-N含量測定

采用凱氏定氮儀按半微量蒸餾法[15]測定TVB-N含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有實驗均重復(fù)3 次，數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。采用SPSS 20.0軟件進行單因素方差分析，Duncan’s多重檢驗進行數(shù)據(jù)間的顯著性差異分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 殼寡糖對冷藏鰱魚片感官特性的影響

由表2可知，0.5 g/100 mL殼寡糖對鰱魚片的原始風(fēng)味、色澤及質(zhì)地均沒有顯著影響。對照組和實驗組鰱魚片的感官特性在貯藏過程中均呈下降趨勢。其中，殼寡糖組魚片的氣味、質(zhì)地和色澤分別從貯藏2、2、4 d開始顯著優(yōu)于對照組魚片。就總體接受程度而言，殼寡糖組魚片從貯藏4 d開始顯著優(yōu)于對照組魚片。隨著貯藏時間的延長，貯藏6 d時，對照組魚片出現(xiàn)腐敗氣味，感官不能接受，而殼寡糖組魚片此時感官特性均良好。對照組魚片貯藏8 d時徹底腐敗，同時殼寡糖組魚片也開始出現(xiàn)腐敗氣味，感官不能接受。

表2 殼寡糖對4 ℃貯藏鰱魚片感官評分的影響Table 2 Effects of COS on sensory score of silver carp fillets during storage at 4 ℃

2.2 殼寡糖對冷藏鰱魚片菌落總數(shù)的影響

由圖1可知，對照組和殼寡糖組魚片的初始菌落總數(shù)分別為4.15、4.08（lg（CFU/g））。隨著貯藏時間延長，2 組魚片菌落總數(shù)均呈上升趨勢。從貯藏2 d至貯藏末期，殼寡糖組魚片菌落總數(shù)均顯著低于對照組魚片（P＜0.05）。隨著貯藏時間的延長，貯藏4 d時，對照組魚片菌落總數(shù)達到7.22（lg（CFU/g）），而殼寡糖組魚片此時菌落總數(shù)僅為6.59（lg（CFU/g）），但貯藏6 d時，殼寡糖組魚片菌落總數(shù)達到7.45（lg（CFU/g））。國際微生物規(guī)格委員會將菌落總數(shù)≤7.0（lg（CFU/g））作為淡水魚微生物數(shù)量可接受范圍[16]。對照組和殼寡糖組魚片菌落總數(shù)分別于貯藏4、6 d超過7.0（lg（CFU/g））。這主要與殼寡糖的抗菌作用有關(guān)，同時，先前研究表明，殼寡糖對革蘭氏陽性菌及革蘭氏陰性菌均具有廣譜抑制活性[17]。

圖1 殼寡糖對鰱魚4 ℃貯藏過程中菌落總數(shù)的影響Fig.1 Effects of COS on total viable count of silver carp fillets during storage at 4 ℃

2.3 基于Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)的菌相分析

基于感官分析結(jié)果，選取對照組和殼寡糖組貯藏0、6 d的魚肉樣品進行菌相分析。對鰱魚貯藏過程中菌群相對豐度≥1%的21 個菌屬（屬水平）進行分析。由圖2可知，隨著貯藏時間的延長，對照組和殼寡糖組魚片菌群多樣性水平均降低，這與Huang Zhan等[18]對草魚冷藏的研究結(jié)果一致。貯藏第0天，對照組魚片的優(yōu)勢菌屬為氣單胞菌屬（Aeromonas）（20.5%）、假單胞菌屬（Pseudomonas）（20.0%）和不動桿菌屬（Acinetobacter）（8.1%）；殼寡糖組魚片的優(yōu)勢菌屬為氣單胞菌屬（41.1%）、假單胞菌屬（35.3%）和不動桿菌屬（8.3%）。隨著貯藏時間的延長，2 組魚肉菌群結(jié)構(gòu)均發(fā)生明顯變化，貯藏6 d時，對照組魚片的優(yōu)勢菌屬為假單胞菌屬（79.8%）和氣單胞菌屬（6.5%），而不動桿菌屬的相對豐度降至4.7%；殼寡糖組魚片的優(yōu)勢菌屬為不動桿菌屬（54.7%）、假單胞菌屬（34.4%），而氣單胞菌屬的相對豐度降至1.6%。值得注意的是，殼寡糖處理后的魚肉菌群中假單胞菌屬和氣單胞菌屬的相對豐度明顯減少，而不動桿菌屬成為優(yōu)勢菌屬。有研究發(fā)現(xiàn)，假單胞菌屬和氣單胞菌屬是淡水魚冷藏過程中的特定腐敗菌，而不動桿菌屬對淡水魚肉的致腐能力較弱[19]。Katikou等[20]研究發(fā)現(xiàn)，魚肉中與腐敗相關(guān)的生物胺類的產(chǎn)生與假單胞菌屬密切相關(guān)。Wang Guangxian等[21]研究發(fā)現(xiàn)，氣單胞菌屬能夠?qū)е掠醒醢b藍圓鰺的腐敗。因此，殼寡糖組魚片在貯藏過程中的品質(zhì)明顯優(yōu)于對照組，可能與殼寡糖對假單胞菌屬和氣單胞菌屬的抑制作用相關(guān)。

圖2 殼寡糖對鰱魚4 ℃貯藏過程中菌屬相對豐度的影響Fig.2 Effects of COS on relative abundance of bacteria (at the genus level) of silver carp fillets during storage at 4 ℃

為進一步可視化分析對照組和殼寡糖組魚片菌相變化，對殼寡糖組及對照組魚片菌群組成（豐度前50的菌屬）進行熱圖分析。熱圖是以顏色梯度來表征二維矩陣或表格中數(shù)據(jù)的大小，并呈現(xiàn)群落物種組成信息。通常根據(jù)物種或樣本間豐度的相似性進行聚類，并將結(jié)果呈現(xiàn)在菌落熱圖上，可使高豐度和低豐度的物種分塊聚集，通過顏色變化與相似程度來反映冷藏鰱魚片在屬水平上群落組成的相似性和差異性。

由圖3可知，假單胞菌屬、氣單胞菌屬和不動桿菌屬作為2 組魚片高豐度菌屬被歸為一類，剩余47 個菌屬歸為另一大類。對對照組和殼寡糖組樣本間豐度的相似性進行聚類分析，發(fā)現(xiàn)對照組和殼寡糖組貯藏0 d時的菌相相似，可以歸為一類，而隨著貯藏時間的延長，2 組魚片的菌相發(fā)生明顯變化且對照組和殼寡糖組貯藏6 d時的菌相相似，可以歸為一類。

圖3 殼寡糖對鰱魚4 ℃貯藏過程中菌相影響的熱圖分析Fig.3 Heat map showing the effects of COS on the microbiota composition of silver carp fillets during storage at 4 ℃

2.4 殼寡糖對冷藏鰱魚片ATP關(guān)聯(lián)物含量及K值的影響

IMP是魚肉中主要的呈鮮味物質(zhì)，其含量與魚肉的鮮度有很大的相關(guān)性。由圖4A可知，對照組和殼寡糖組魚肉中IMP的含量變化均呈先上升后下降的趨勢。魚肉貯藏過程中IMP含量的下降主要由魚肉自溶作用及微生物酶的作用引起。從貯藏4 d開始至貯藏末期，殼寡糖組魚片的IMP含量顯著高于對照組（P＜0.05），表明殼寡糖能夠延緩魚肉中IMP的降解，使魚片在貯藏過程中保留更多的鮮味成分。

圖4 殼寡糖對鰱魚4 ℃貯藏過程中IMP、HxR、Hx含量及K值的影響Fig.4 Effects of COS on IMP, HxR, Hx content, and K value of silver carp fillets during storage at 4 ℃

隨著貯藏時間的延長，IMP在魚肉自溶作用及微生物酶的作用下逐漸被分解為HxR和Hx[22]。HxR和Hx是核苷酸降解的主要產(chǎn)物，其中高含量的Hx與腐敗魚肉的苦味有關(guān)，Hx的積累會導(dǎo)致魚肉風(fēng)味品質(zhì)下降。由圖4B可知，對照組和殼寡糖組HxR的含量變化均呈先上升后下降的趨勢，從貯藏6 d開始至貯藏末期，殼寡糖組魚片的HxR含量顯著高于對照組（P＜0.05），表明殼寡糖能夠抑制HxR的降解，減少苦味成分Hx的生成。

由圖4C可知，隨著貯藏時間的延長，對照組和殼寡糖組魚片中Hx含量均呈逐漸上升趨勢，其初始值分別為0.03、0.06 μmol/g，從貯藏6 d開始至貯藏末期，殼寡糖組魚片的Hx含量顯著低于對照組（P＜0.05）。貯藏8 d時，對照組魚片的Hx含量為1.57 μmol/g，接近殼寡糖組魚片Hx含量（0.79 μmol/g）的2 倍。結(jié)果表明，從貯藏6 d開始至貯藏末期，殼寡糖組魚片含有更高的HxR含量及更低的Hx含量。Hernández-Cázares等[23]研究發(fā)現(xiàn)，Hx的生成與腐敗微生物產(chǎn)生的核苷磷酸化酶有關(guān)。因此，殼寡糖組魚片較對照組具有更好的品質(zhì)，這可能與殼寡糖抑制假單胞菌屬和氣單胞菌屬等微生物的生長進而抑制HxR分解為Hx有關(guān)。

K值經(jīng)常用于評價魚肉的新鮮度[13]，由圖4D可知，隨著貯藏時間的延長，對照組與殼寡糖組魚片的K值均呈上升趨勢。當(dāng)K值大于60%時，魚肉品質(zhì)達到不可接受范圍[13]。對照組魚片K值于貯藏8 d時超過該限值，而殼寡糖組魚片在貯藏8 d的K值為56.39%，顯著低于對照組。感官評價結(jié)果表明，對照組與殼寡糖組魚片分別于貯藏6、8 d時達到感官不可接受程度，這說明不能僅通過K值評價淡水魚魚片新鮮度，要通過綜合的感官及物理化學(xué)指標(biāo)對魚片的新鮮度作出綜合評價。

2.5 殼寡糖對冷藏鰱魚片TVB-N含量的影響

由圖5可知，對照組和殼寡糖組魚片初始TVB-N含量分別為11.37、10.73 mg/100 g。在貯藏2 d時2 組TVB-N含量略有下降，之后逐漸升高且從貯藏4 d開始至貯藏末期，殼寡糖組魚片TVB-N含量顯著低于對照組（P＜0.05）。TVB-N的產(chǎn)生主要由腐敗菌引起[24]，因此，殼寡糖對魚肉中TVB-N的抑制作用主要是通過抑制冷藏鰱魚優(yōu)勢菌屬假單胞菌屬和氣單胞菌屬的增長實現(xiàn)。

圖5 殼寡糖對鰱魚4 ℃貯藏過程中TVB-N含量的影響Fig.5 Effects of COS on TVB-N content of silver carp fillets during storage at 4 ℃

3 結(jié) 論

本研究主要通過Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)分析殼寡糖對鰱魚冷藏過程中魚肉菌相的影響。結(jié)果表明：0.5 g/100 mL殼寡糖能夠顯著抑制冷藏鰱魚的菌落總數(shù)并明顯改變冷藏鰱魚的菌相，主要表現(xiàn)為抑制鰱魚冷藏過程中假單胞菌屬和氣單胞菌屬等腐敗菌屬的增長，延緩魚肉貯藏過程中的品質(zhì)劣變，而不動桿菌屬能夠耐受殼寡糖處理，成為殼寡糖處理組魚肉的優(yōu)勢菌屬；同時，殼寡糖能夠顯著延緩魚肉中IMP及HxR的降解，抑制苦味物質(zhì)Hx及TVB-N的生成，進而提高鰱魚的品質(zhì)，這可能與殼寡糖抑制假單胞菌屬和氣單胞菌屬等腐敗菌屬的生長有關(guān)。綜上，作為一種新型的食品保鮮劑，殼寡糖通過改變鰱魚貯藏過程中的菌相，抑制鰱魚冷藏過程中假單胞菌屬和氣單胞菌屬等腐敗菌屬的增長，進而提高鰱魚的貯藏品質(zhì)。