• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    豬肉源大腸桿菌分離鑒定及其生物被膜形成

    2022-12-30 05:19:08季君珂宓曉雨張文棟袁楊洋
    肉類研究 2022年11期
    關(guān)鍵詞:成膜微孔屠宰

    季君珂,宓曉雨,程 宇,張文棟,張 晨,袁楊洋,江 蕓

    (南京師范大學(xué)食品與制藥工程學(xué)院,江蘇 南京 210023)

    肉品腐敗變質(zhì)給人類食品供應(yīng)帶來極大危害。生鮮肉營(yíng)養(yǎng)豐富、含水量高、極易腐敗。以往研究認(rèn)為肉類微生物的污染主要來自胴體污染,但近年研究發(fā)現(xiàn),最主要來源是接觸表面污染[1]。生豬屠宰、分割、運(yùn)輸?shù)入A段均可能通過直接接觸使畜禽胴體和分割肉污染大腸桿菌[2],而微生物在生產(chǎn)加工表面形成的生物被膜被認(rèn)為是主要的交叉污染源頭[3]。

    大腸桿菌在自然環(huán)境中廣泛存在,極易污染肉、魚、乳、蔬菜、水果等,引起食品腐敗[4]。致病性大腸桿菌還可引起人類腸道或腸道外感染,甚至?xí)?dǎo)致死亡[5]。在許多國(guó)家,大腸桿菌和大腸菌群通常被認(rèn)為是食品衛(wèi)生質(zhì)量的指示菌[6]。大腸桿菌可以在不銹鋼、玻璃、聚苯乙烯等食品加工接觸表面及食品表面黏附、定植、形成生物被膜[7]。生物被膜是細(xì)菌為了更好地適應(yīng)生存環(huán)境而黏附于接觸表面,通過菌體增殖生長(zhǎng)、分泌大量胞外聚合物(extracellular polymeric substances,EPS)而形成的具有一定空間結(jié)構(gòu)的細(xì)菌聚集體[8]。EPS是生物被膜中細(xì)胞周圍的厚基質(zhì),其多層性質(zhì)是保護(hù)生物被膜內(nèi)細(xì)菌細(xì)胞的主要機(jī)制[9]。EPS的主要成分是占比高達(dá)97%的水,此外還包括胞外多糖、聚合物、蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)、吸收的營(yíng)養(yǎng)素及代謝物[10-11]。EPS的存在可以提供細(xì)菌物理屏障,減緩抗菌劑向生物被膜內(nèi)細(xì)胞的擴(kuò)散,從而使酶有時(shí)間降解某些毒性分子,使得生物被膜的抗藥性增強(qiáng),難以消除,形成持續(xù)性污染[12-13]。

    大腸桿菌生物被膜形成的相關(guān)基因,如csgA、fimH和papC是附著和感染宿主的重要因子,并且與抗菌素耐藥性有關(guān)[14]。csgA基因與大腸桿菌在接觸面的初始黏附有關(guān),而fimH基因編碼F1菌毛的黏附亞基,促進(jìn)定植、侵入和形成生物被膜。在一些犬類和人體中,papC基因能夠使大腸桿菌在內(nèi)臟中黏附和存活[15]。

    為此,本研究首先從生豬屠宰線、豬胴體表面及生鮮豬肉中分離鑒定大腸桿菌,進(jìn)而采用微孔板結(jié)晶紫染色法評(píng)價(jià)豬肉源大腸桿菌分離株在屠宰加工常見溫度(15 ℃)下的生物被膜形成能力,進(jìn)一步選取代表性菌株探討生物被膜形成過程中被膜量、EPS組成及大腸桿菌成膜基因表達(dá)的變化。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    生鮮豬肉,購(gòu)于南京農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)某品牌專賣柜。

    食品級(jí)304不銹鋼片(75 mm×25 mm×1 mm,2B光潔面)、玻璃容器 南通順豐醫(yī)療器械有限公司;96 孔透明細(xì)胞培養(yǎng)板 美國(guó)Corning公司;大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC43895 美國(guó)菌種保藏中心;胰蛋白胨大豆瓊脂(tryptone soya agar,TSA)、胰蛋白胨大豆肉湯(tryptic soy broth,TSB)、酵母提取物(yeast extract,YE)、大腸桿菌和大腸菌群顯色培養(yǎng)基(E.coliand coliform chromogenic agar plates,ECCA)、麥康凱瓊脂(MacConkey agar,MAC) 北京陸橋技術(shù)有限公司;結(jié)晶紫、乙醇、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)、丙酮(均為分析純) 南京藤春生物科技有限公司;苯酚(分析純) 南京峰昌生物科技有限公司;濃硫酸(分析純) 南京化學(xué)試劑有限公司;BCA蛋白含量測(cè)定試劑盒 南京建成生物科技有限公司;總RNA提取試劑盒、PrimeSTAR?Max DNA聚合酶、熒光定量試劑盒日本TaKaRa公司;DNA Marker(DL 2000)、Gel Red核酸染料 上海生物工程有限公司;PremixTaq酶 蘇州近岸蛋白科技有限公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    M2多功能酶標(biāo)儀 美國(guó)Molecular Devices公司;Thermal Cycler普通聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)儀 美國(guó)Molecular Devices公司;Universal Hood II凝膠成像儀 美國(guó)Bio-Rad公司;2-16KL高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)Sigma公司;Nano-30微量紫外分光光度計(jì) 杭州奧盛儀器有限公司;DYCP-32B瓊脂糖水平電泳儀 北京六一生物科技有限公司;SW-CJ-2F超凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;HVE-50立式壓力蒸汽滅菌鍋日本Hirayama公司;HX-4拍打式無(wú)菌均質(zhì)器 上海瀘析實(shí)業(yè)有限公司;QL-200微型渦旋混合儀 海門其林貝爾儀器有限公司;ZQTY-70臺(tái)式振蕩培養(yǎng)箱 上海知楚儀器有限公司;DHP-9052電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司。

    1.3 方法

    1.3.1 肉源大腸桿菌的分離鑒定

    1.3.1.1 肉源大腸桿菌的分離純化

    生鮮豬肉樣品于超凈工作臺(tái)剪取25 g,放入加有80 mL無(wú)菌生理鹽水的無(wú)菌均質(zhì)袋中,均質(zhì)機(jī)充分拍打2 min(8 次/s)。某生豬屠宰企業(yè)的屠宰車間(傳送帶表面、操作臺(tái)表面以及車間工人刀具、手套表面)及豬酮體表面采用棉簽涂抹擦拭法取樣,取樣后用無(wú)菌剪刀將棉簽頭剪于裝有10 mL無(wú)菌生理鹽水的離心管中,用渦旋混勻器充分渦旋。

    取一定體積的上述樣液進(jìn)行梯度稀釋,選擇合適稀釋度涂布于ECCA平板,37 ℃培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后挑取藍(lán)綠色并呈現(xiàn)圓形凸起的可疑菌落至MAC平板上反復(fù)進(jìn)行平板劃線分離,分離純化3 次[16]。純化后的可疑菌株于含體積分?jǐn)?shù)25%甘油的TSB中-80 ℃凍存。

    1.3.1.2 大腸桿菌屬特異性PCR鑒定

    將上述凍存的可疑菌株在TSA-YE平板上劃線活化2 次,37 ℃倒置培養(yǎng)24 h,挑取單菌落于加入150 μL滅菌蒸餾水的1.5 mL離心管,渦旋,99 ℃水浴10 min,冰浴2 min,12 000×g離心2 min,吸取上清液至另一離心管中即為細(xì)菌基因組DNA,-20 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

    采用PCR擴(kuò)增大腸桿菌屬特異基因phoA,其擴(kuò)增序列引物:F:5’-CGATGCCTTACCGCTTAC-3’;R:5’-TTTCCCTGCCATTCACC-3’[17]。反應(yīng)體系(25 μL):模板DNA 1 μL,上、下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL,PremixTaq酶12.5 μL,ddH2O 10.5 μL。反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性5 min,95 ℃變性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s,共30 個(gè)循環(huán),72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增完成后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(120 V、25 min),凝膠成像儀成像觀察。

    1.3.2 肉源大腸桿菌生物被膜形成能力比較

    1.3.2.1 菌液制備

    將凍存的肉源大腸桿菌在TSA-YE平板上劃線活化2 次,37 ℃培養(yǎng)24 h。挑取單菌落分別接種于3 mL TSB中,37 ℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)18 h,連續(xù)活化2 次,取生長(zhǎng)達(dá)到穩(wěn)定期的菌液1 mL于4 ℃、8 000×g離心5 min,棄去上清,用PBS(pH 7.2)洗滌3 次,調(diào)整菌懸液濃度為108CFU/mL左右,備用。

    1.3.2.2 微孔板結(jié)晶紫染色法分析大腸桿菌生物被膜形成能力

    將上述菌懸液用TSB梯度稀釋至102CFU/mL,吸取180 μL至96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,封口膜封口。置于15 ℃培養(yǎng)72 h,以無(wú)菌TSB作為對(duì)照。培養(yǎng)結(jié)束后,棄去微孔板中培養(yǎng)液,用無(wú)菌蒸餾水漂洗3 次,室溫下干燥30 min后,每孔加入200 μL 0.25 g/100 mL結(jié)晶紫染色30 min,棄去染液后用無(wú)菌蒸餾水漂洗3 次,之后用200 μL體積分?jǐn)?shù)95%乙醇溶液洗脫(30 min)黏附于微孔表面的菌體,最后將微孔板置于酶標(biāo)儀中,在570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定光密度OD570nm,每個(gè)菌株重復(fù)測(cè)定6 次,結(jié)果取平均值。

    菌株根據(jù)所得OD570nm進(jìn)一步作如下分類[18]:無(wú)生物被膜形成能力:OD570nm≤ODc;較弱生物被膜形成能力:ODc<OD570nm≤2×ODc;中等生物被膜形成能力:2×ODc<OD570nm≤4×ODc;較強(qiáng)生物被膜形成能力:4×ODc<OD570nm。其中ODc為臨界值,按式(1)計(jì)算。

    1.3.3 大腸桿菌生物被膜形成曲線

    根據(jù)1.3.2.2節(jié)結(jié)果,選取1 株代表菌株按照上述方法進(jìn)行微孔板操作,分別在培養(yǎng)24、72、120、168 h取樣,以無(wú)菌TSB作為對(duì)照組。經(jīng)結(jié)晶紫染液染色、乙醇洗脫,測(cè)定OD570nm,去除對(duì)照組OD570nm后按照培養(yǎng)時(shí)間繪制生物被膜形成曲線。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)均重復(fù)測(cè)定6 次。

    1.3.4 大腸桿菌生物被膜形成時(shí)EPS含量分析

    1.3.4.1 大腸桿菌生物被膜制備與處理

    選用食品級(jí)304不銹鋼片作為生物被膜形成的接觸載體。為防止不銹鋼片表面附著的化學(xué)雜質(zhì)及油污影響生物被膜的形成,使用前對(duì)不銹鋼片進(jìn)行徹底清洗。具體方法如下:將洗凈的鋼片放入丙酮溶液中浸泡3 h,拭凈后用乙醇溶液浸泡12 h,最后用蒸餾水沖洗干凈并晾干[19]。實(shí)驗(yàn)前,經(jīng)121 ℃滅菌20 min備用。

    將1.3.2.1節(jié)制備的大腸桿菌菌懸液接種至含新鮮TSB和不銹鋼片的無(wú)菌玻璃容器中,菌液濃度約為106CFU/mL。無(wú)菌保鮮膜封口,15 ℃下靜置培養(yǎng)72 h和168 h。培養(yǎng)結(jié)束后取出不銹鋼片并用無(wú)菌生理鹽水漂洗3 次以去除表面未黏附菌體,采用棉簽擦拭法收集不銹鋼片表面的生物被膜。將拭子置于裝有10 mL無(wú)菌生理鹽水和一定量玻璃珠的離心管中,充分渦旋3 min使拭子上的菌體充分脫落,得到的菌懸液用于EPS含量測(cè)定。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

    1.3.4.2 EPS中蛋白質(zhì)和多糖含量測(cè)定

    參考Cao Bin等[20]的方法制備1.3.4.1節(jié)菌懸液中的松散型EPS(loose EPS,L-EPS)和緊密型EPS(bound EPS,B-EPS)。L-EPS和B-EPS的蛋白含量采用BCA蛋白含量檢測(cè)試劑盒測(cè)定。蛋白質(zhì)-吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.001 8x+0.151 4(R2=0.997 8),其中x為蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度/(μg/mL),y為吸光度,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算EPS中蛋白質(zhì)含量??偺呛坎捎帽椒恿蛩岱╗21]測(cè)定,多糖-吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.195 6x+0.081 8(R2=0.997 3),其中x為葡萄糖質(zhì)量濃度/(μg/mL),y為吸光度,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算EPS中多糖含量。

    1.3.5 生物被膜中相關(guān)成膜基因表達(dá)量測(cè)定

    1.3.5.1 生物被膜的收集

    以食品級(jí)304不銹鋼片作為接觸載體,15 ℃下靜置培養(yǎng)72 h和168 h后收集生物被膜,方法同1.3.4.1節(jié)。將菌懸液4 ℃、12 000×g離心15 min,沉淀用于核酸提取。

    1.3.5.2 總RNA提取及cDNA合成

    按照總RNA提取試劑盒說明書進(jìn)行,用核酸蛋白微量測(cè)定儀測(cè)定提取的總RNA濃度和純度,確定RNA濃度和純度合格(OD260nm/OD280nm為1.8~2.0),調(diào)整RNA濃度后,根據(jù)Prime ScriptTMRT Master Mix反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄體系(10 μL):2 μL 5×Prime Script RT Master Mix混合液、2 μL RNA、6 μL無(wú)RNA酶水;反應(yīng)程序:37 ℃、15 min,85 ℃反轉(zhuǎn)錄酶失活反應(yīng)5 s,保持4 ℃。將反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA于-20 ℃保存進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

    1.3.5.3 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒構(gòu)建及標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

    大腸桿菌csgA、papC、fimH基因及引物情況見表1,引物由上海生物工程有限公司合成。

    表1 實(shí)驗(yàn)所用PCR引物Table 1 PCR primers used in this study

    標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒由南京擎科公司構(gòu)建合成。取測(cè)序結(jié)果正確的質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒,采用微量分光光度計(jì)測(cè)定純度和質(zhì)量濃度,按式(2)計(jì)算質(zhì)粒DNA拷貝數(shù)。

    使用無(wú)RNA酶水梯度稀釋,使標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)質(zhì)粒的質(zhì)量濃度為100~10-6ng/μL,作為模板。PCR反應(yīng)體系(20 μL):SYBR Green Master(2×)(ROX)10 μL,PCR正、反向引物(10 μmol/L)各0.25 μL,DNA模板2 μL,雙蒸水7.5 μL。反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性30 s后,95 ℃5 s、60 ℃ 30 s反應(yīng)40 個(gè)循環(huán),95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min、95 ℃保持15 s。以拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值(lg(copies/μL))為橫坐標(biāo),循環(huán)閾(cycle threshold,Ct)值為縱坐標(biāo),構(gòu)建一元線性方程,即為標(biāo)準(zhǔn)曲線。

    1.3.5.4 相關(guān)成膜基因熒光定量PCR分析

    以1.3.5.2節(jié)制備的cDNA為模板進(jìn)行熒光定量PCR,用所得樣品的Ct值通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算目標(biāo)基因表達(dá)量(lg(copies/μL)),進(jìn)一步計(jì)算不銹鋼片生物被膜中成膜基因表達(dá)量(copies/cm2)。

    1.4 數(shù)據(jù)處理

    利用GraphPad Prism 8軟件(GraphPad Software公司)處理相應(yīng)數(shù)據(jù)及圖表分析,采用SPSS 17.0(IBM公司)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析和Duncan’s多重比較檢驗(yàn),2 組之間顯著性差異分析采用t檢驗(yàn)。結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,P<0.05時(shí)差異顯著。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 肉源大腸桿菌的分離與鑒定

    由圖1可知,ECCA大腸桿菌顯色平板中共分離得到藍(lán)綠色可疑菌落350 個(gè),可疑菌落進(jìn)一步采用MAC平板劃線分離純化,得到粉紅色可疑菌株90 株。采用大腸桿菌菌屬特異性PCR擴(kuò)增phoR基因,由圖2可知,擴(kuò)增出陽(yáng)性條帶(444 bp),共鑒定到陽(yáng)性菌株31 株,其中4 株來源于生豬胴體表面,11 株來源于生豬屠宰線,16 株來源于生鮮豬肉,菌株信息見表2。

    圖1 大腸桿菌在ECCA平板(A)和MAC平板(B)上的生長(zhǎng)情況Fig.1 Growth of E.coli on ECCA (A) and MAC plates (B)

    圖2 部分菌株的屬特異性PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.2 Electrophoresis profile of genus-specific PCR products of selected isolates

    表2 大腸桿菌鑒定結(jié)果Table 2 Results of identification of E.coli

    大腸桿菌是人和動(dòng)物腸道共生菌群的組成部分,部分致病性大腸桿菌能引起人體感染而致病[25]。受屠宰加工方式及運(yùn)輸條件等因素影響,豬肉從屠宰場(chǎng)到餐桌的過程中,會(huì)受到不同程度的微生物污染[26]。國(guó)內(nèi)有關(guān)學(xué)者對(duì)不同環(huán)境中大腸桿菌的污染情況進(jìn)行了許多調(diào)查。吳萱[27]、于慶華[28]等的研究均從豬肉流通的不同環(huán)節(jié)中分離到大腸桿菌,可能來源于畜禽腸道及體表、屠宰、貯存、運(yùn)輸、銷售環(huán)境,也有可能來源于屠宰或銷售人員。本研究從生豬屠宰線、豬胴體表面及生鮮豬肉表面分離到大腸桿菌,證實(shí)了大腸桿菌在豬肉生產(chǎn)環(huán)節(jié)中普遍存在,表明生產(chǎn)加工環(huán)境中加強(qiáng)衛(wèi)生監(jiān)控對(duì)控制豬肉微生物污染和降低食品安全隱患十分必要。

    2.2 大腸桿菌生物被膜形成能力分析

    采用微孔板結(jié)晶紫染色法評(píng)估31 株肉源大腸桿菌的生物被膜形成能力,大多菌株均可在微孔板底部見到一層淡紫色薄膜,加入乙醇溶解后,不同菌株孔板中顏色深淺不同。進(jìn)一步測(cè)定OD570nm,由圖3可知,不同菌株間生物被膜形成能力存在顯著差異。31 株肉源大腸桿菌中,27 株菌株表現(xiàn)出生物被膜形成能力。按照臨界值ODc的生物被膜形成能力進(jìn)行分類,強(qiáng)、中、弱、無(wú)4 種生物被膜表型的菌株數(shù)量分別為3、4、20、4 株,分別占菌株總數(shù)的9.68%、12.90%、64.52%和12.90%。

    圖3 31 株大腸桿菌微孔板表面生物被膜形成能力Fig.3 Biofilm formation ability of 31 isolates of E.coli on polystyrene microplate surfaces

    在實(shí)際生產(chǎn)中,生豬屠宰車間的溫度為13.28~16.70 ℃,平均(15.85±0.99) ℃[29]。因此本研究結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際,探討15 ℃條件下肉源大腸桿菌生物被膜形成情況。研究表明,大多數(shù)食源性腐敗菌,如假單胞菌[30]、希瓦氏菌[31]等均具有一定的生物被膜形成能力且存在明顯菌株差異。本研究亦發(fā)現(xiàn),肉源大腸桿菌的生物被膜形成能力存在明顯菌株差異,且大多數(shù)大腸桿菌生物被膜形成能力較弱。這與前人的一些報(bào)道類似,王嫻靜等[32]用微孔板結(jié)晶紫法評(píng)價(jià)14 株大腸桿菌O157:H7的生物被膜形成能力,發(fā)現(xiàn)所有菌株均具有一定的生物被膜形成能力,其中85.7%菌株成膜能力較弱且存在明顯的菌株差異性。即使大腸桿菌的成膜能力較弱,一旦形成生物被膜,對(duì)清潔劑、消毒劑等的抗性增強(qiáng),不易清除,則可能成為持續(xù)的污染源頭。因此探討肉類屠宰加工環(huán)境及肉中大腸桿菌的生物被膜形成對(duì)生鮮肉安全生產(chǎn)和污染控制具有科學(xué)指導(dǎo)意義。

    本研究中肉源大腸桿菌中60%以上菌株的生物被膜形成能力較弱,從這些菌株中隨機(jī)選取1 株大腸桿菌D4-18進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

    2.3 結(jié)晶紫染色法檢測(cè)大腸桿菌D4-18生物被膜的生長(zhǎng)過程

    采用結(jié)晶紫染色法研究大腸桿菌D4-18生物被膜的形成過程。由圖4可知,大腸桿菌D4-18生物被膜在24 h時(shí)形成量較少,隨著時(shí)間延長(zhǎng),OD570nm逐漸增大,即生物被膜形成量逐漸增多,168 h時(shí)生物被膜量達(dá)到最大值。研究表明,生物被膜形成過程是一個(gè)動(dòng)態(tài)的過程,分為起始黏附期、集聚增殖期、成熟期及脫落散播期4 個(gè)階段[33]。李安琪等[34]發(fā)現(xiàn),副溶血弧菌在微孔板中37 ℃培養(yǎng)48~72 h時(shí)達(dá)到生物被膜的成熟階段,72~144 h時(shí)達(dá)到生物被膜的解離階段。鄧小玲等[35]報(bào)道了大腸桿菌在微孔板中37 ℃條件下形成生物被膜的動(dòng)態(tài)過程,發(fā)現(xiàn)有部分大腸桿菌在72 h后進(jìn)入脫落期。王嫻靜等[32]研究大腸桿菌O157:H7在微孔板中25 ℃條件下生物被膜形成過程,發(fā)現(xiàn)成膜能力較強(qiáng)的菌株J29培養(yǎng)48 h后生物被膜量緩慢增多,成膜能力中等的菌株ATCC43895在60 h后生物被膜量增長(zhǎng)較快,168 h時(shí)達(dá)到最多,其他成膜能力弱的菌株在168 h內(nèi)生物被膜量都維持在較低的相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)。本研究中,大腸桿菌D4-18在微孔板中15 ℃條件下培養(yǎng)168 h生物被膜量持續(xù)增長(zhǎng)。上述研究表明,生物被膜形成過程與菌種、菌株的生物被膜形成能力、培養(yǎng)溫度等成膜條件有關(guān)。

    圖4 大腸桿菌D4-18生物被膜形成曲線Fig.4 Curve of biofilm formation of E.coli D4-18

    2.4 大腸桿菌D4-18生物被膜形成時(shí)EPS中蛋白質(zhì)和多糖含量變化

    由圖5可知,成膜72 h時(shí)大腸桿菌D4-18產(chǎn)生了一定量胞外蛋白質(zhì)和胞外多糖,隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng),EPS含量增加,其中L-EPS中蛋白質(zhì)及多糖的含量均極顯著增加(P<0.01),B-EPS中蛋白質(zhì)含量極顯著增加(P<0.01)。EPS基質(zhì)在生物被膜發(fā)育、發(fā)展和成熟階段發(fā)揮重要作用,與菌體的黏附、支架、機(jī)械穩(wěn)定性和保護(hù)作用密切相關(guān)[36]。EPS中蛋白質(zhì)與多糖的含量可以在一定程度上反映生物被膜發(fā)育程度。蛋白質(zhì)中含有的氨基酸及部分疏水性氨基酸增加了細(xì)菌細(xì)胞表面疏水性[37-38],而多糖中含有的羧基、羥基等親水官能團(tuán)增加了細(xì)胞的親水性。使得EPS同時(shí)具有疏水和親水的特性。多糖的黏性可以更好包裹細(xì)菌,使得菌體更加穩(wěn)定地黏附在非生物表面。蛋白的疏水性增強(qiáng)了菌體在疏水性的不銹鋼表面定植、聚集、形成生物被膜和獲取營(yíng)養(yǎng)的能力,從而增強(qiáng)了細(xì)菌對(duì)外界惡劣環(huán)境的抵抗力[39]。

    圖5 大腸桿菌D4-18生物被膜中L-EPS和B-EPS蛋白質(zhì)(A)及多糖(B)含量Fig.5 Content of protein (A) and polysaccharide (B) in L-EPS and B-EPS in the biofilm of E.coli D4-18

    2.5 生物被膜中相關(guān)成膜基因的表達(dá)變化

    大腸桿菌D4-18的3 種成膜基因papC、fimH、csgA標(biāo)準(zhǔn)曲線如表3所示,相關(guān)系數(shù)R2均大于0.99,Ct值滿足標(biāo)準(zhǔn)曲線要求。

    表3 papC、fimH、csgA基因標(biāo)準(zhǔn)曲線Table 3 Standard curves for detection of papC, fimH, and csgA genes

    由圖6可知,大腸桿菌在15 ℃條件下培養(yǎng)72 h時(shí),papC、fimH、csgA基因的表達(dá)量分別為0.095、0.933、0.435 copies/cm2,培養(yǎng)168 h時(shí)papC基因表達(dá)量顯著增多(P<0.05),fimH基因表達(dá)量極顯著增多(P<0.01),csgA基因表達(dá)量無(wú)顯著變化。關(guān)于大腸桿菌生物被膜形成時(shí)相關(guān)基因表達(dá)方面有較多報(bào)道,朱琳等[40]研究發(fā)現(xiàn),fimA基因和fliC基因編碼菌毛屬細(xì)菌的黏附結(jié)構(gòu),在生物被膜的初始黏附階段起重要作用,flu基因編碼的Ag43能促進(jìn)細(xì)菌的自聚集,有利于細(xì)菌生物被膜團(tuán)聚結(jié)構(gòu)的形成。Surgers等[41]研究發(fā)現(xiàn),papC基因的存在與生物被膜形成有很強(qiáng)的相關(guān)性。Ren等[42]采用DNA微陣列研究大腸桿菌生物被膜的基因表達(dá),發(fā)現(xiàn)fimH基因在生物被膜形成時(shí)表達(dá)上調(diào)。Bhardwaj等[43]采用熒光定量PCR相對(duì)定量發(fā)現(xiàn),csgA基因在大腸桿菌生物被膜形成時(shí)表達(dá)上調(diào)。本研究采用熒光定量PCR絕對(duì)定量同樣發(fā)現(xiàn),在不銹鋼接觸表面形成的生物被膜中,papC、fimH、csgA基因進(jìn)行了一定表達(dá),且在生物被膜不同成膜階段,接觸面上相關(guān)基因表達(dá)量發(fā)生變化,表明這些基因在大腸桿菌生物被膜形成過程中發(fā)揮了不同程度的調(diào)控作用。

    圖6 大腸桿菌生物被膜相關(guān)基因表達(dá)的變化Fig.6 Changes in the expression of biofilm related-genes of E.coli

    需要指出的是,在實(shí)際生產(chǎn)環(huán)境中,多種微生物共存、多菌種混合生物被膜是更常見的存在狀態(tài),混合生物被膜內(nèi)部不同菌種之間相互作用將導(dǎo)致基因表達(dá)水平發(fā)生變化,形成更加緊密、復(fù)雜的微系統(tǒng),生物被膜的結(jié)構(gòu)和特性更復(fù)雜,抗性可能更強(qiáng)[44-45]。因此混合生物被膜的形成和控制值得進(jìn)一步關(guān)注和重視。

    3 結(jié) 論

    從生豬屠宰線、豬胴體表面及生鮮豬肉表面均分離到大腸桿菌,證實(shí)了大腸桿菌在豬肉生產(chǎn)環(huán)節(jié)中普遍存在。大部分大腸桿菌可以形成生物被膜,雖然它們的被膜形成能力大多較弱,但生物被膜抗性強(qiáng),增加了食品安全隱患,所以在生豬屠宰、豬肉加工、銷售各環(huán)節(jié)應(yīng)加強(qiáng)衛(wèi)生管理,加大清潔消毒,減少細(xì)菌及其生物被膜造成的污染。本研究發(fā)現(xiàn),在大腸桿菌生物被膜形成過程中發(fā)生EPS的分泌,并受不同基因調(diào)控,這為大腸桿菌生物被膜的靶向控制提供了科學(xué)思路。本研究可為揭示肉類生產(chǎn)加工中大腸桿菌生物被膜的形成規(guī)律提供理論基礎(chǔ)。

    猜你喜歡
    成膜微孔屠宰
    凹凸棒土對(duì)種衣劑成膜性能的影響
    壓水堆二回路凝汽器母管內(nèi)壁的成膜胺保養(yǎng)工藝研究
    2020年巴西生豬屠宰量創(chuàng)歷史紀(jì)錄
    新型鉆井液用成膜封堵劑CMF的研制及應(yīng)用
    生豬屠宰價(jià)格信息
    強(qiáng)疏水性PDMS/PVDF微孔膜的制備及其性能研究
    膜蒸餾用PDMS/PVDF/PTFE三元共混微孔膜制備
    微孔發(fā)泡塑料中成核劑的研究
    四措并舉 五相結(jié)合——湖北省推進(jìn)畜禽屠宰管理的實(shí)踐與探索
    不同副溶血性弧菌菌株成膜能力及成膜影響因子的研究
    国产午夜精品久久久久久一区二区三区 | 欧美日本视频| 精品人妻偷拍中文字幕| 黄色女人牲交| 老鸭窝网址在线观看| 国产精品伦人一区二区| 18+在线观看网站| 国产极品精品免费视频能看的| 国产不卡一卡二| 最近视频中文字幕2019在线8| 久9热在线精品视频| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片 | 国产国拍精品亚洲av在线观看| 在线观看午夜福利视频| 日韩欧美在线二视频| 在线十欧美十亚洲十日本专区| av天堂在线播放| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 欧美最新免费一区二区三区 | 在线看三级毛片| 99热精品在线国产| 日本免费一区二区三区高清不卡| 欧美极品一区二区三区四区| 窝窝影院91人妻| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 久久久久性生活片| 国产成+人综合+亚洲专区| 午夜福利在线在线| 性色av乱码一区二区三区2| 国内精品久久久久久久电影| 91九色精品人成在线观看| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 亚洲自偷自拍三级| 成人性生交大片免费视频hd| 真人做人爱边吃奶动态| 亚洲真实伦在线观看| 九九热线精品视视频播放| 可以在线观看的亚洲视频| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 国产一级毛片七仙女欲春2| 丰满人妻一区二区三区视频av| 在线观看午夜福利视频| 亚洲在线观看片| 成年女人看的毛片在线观看| 久久人人爽人人爽人人片va | 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 3wmmmm亚洲av在线观看| 一区二区三区免费毛片| 高潮久久久久久久久久久不卡| 全区人妻精品视频| 国产视频一区二区在线看| 久久亚洲精品不卡| 日本一二三区视频观看| 看免费av毛片| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 最近视频中文字幕2019在线8| aaaaa片日本免费| 在线国产一区二区在线| 此物有八面人人有两片| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 欧美色欧美亚洲另类二区| 9191精品国产免费久久| av国产免费在线观看| 性色av乱码一区二区三区2| 免费看日本二区| 日韩国内少妇激情av| 精品人妻视频免费看| 国产野战对白在线观看| 最近中文字幕高清免费大全6 | 欧美最黄视频在线播放免费| 日本五十路高清| 欧美性感艳星| 麻豆av噜噜一区二区三区| 亚洲无线观看免费| 亚洲片人在线观看| 免费观看的影片在线观看| 亚洲天堂国产精品一区在线| 又紧又爽又黄一区二区| 国产精品免费一区二区三区在线| 简卡轻食公司| 国产精品亚洲美女久久久| 欧美日本亚洲视频在线播放| 岛国在线免费视频观看| 国产在视频线在精品| 欧美xxxx性猛交bbbb| 美女被艹到高潮喷水动态| 老熟妇仑乱视频hdxx| 国产精品日韩av在线免费观看| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 在线播放无遮挡| 欧美日本亚洲视频在线播放| 欧美成人a在线观看| 国产av一区在线观看免费| 一区二区三区激情视频| 久久久久久大精品| 亚洲av电影不卡..在线观看| 成人国产综合亚洲| 99热只有精品国产| 老司机午夜十八禁免费视频| 日韩国内少妇激情av| 男人舔女人下体高潮全视频| 99riav亚洲国产免费| 久久久久久久亚洲中文字幕 | 中出人妻视频一区二区| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 婷婷六月久久综合丁香| 精品一区二区三区视频在线| 久久久久久久久久成人| 91麻豆精品激情在线观看国产| 精品人妻视频免费看| 亚洲国产欧美人成| 91麻豆av在线| 成年女人看的毛片在线观看| 国产精品精品国产色婷婷| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| h日本视频在线播放| 国产精品,欧美在线| 麻豆国产av国片精品| 成人一区二区视频在线观看| 亚洲成人精品中文字幕电影| 国产精品久久视频播放| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 欧美一级a爱片免费观看看| 一进一出抽搐gif免费好疼| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 中文字幕免费在线视频6| 小说图片视频综合网站| 国产高清视频在线观看网站| 性欧美人与动物交配| 伦理电影大哥的女人| 黄片小视频在线播放| 偷拍熟女少妇极品色| 国产美女午夜福利| 免费无遮挡裸体视频| 久久精品国产清高在天天线| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 一本综合久久免费| 在线免费观看的www视频| 欧美日韩福利视频一区二区| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 欧美午夜高清在线| 国产日本99.免费观看| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 他把我摸到了高潮在线观看| 久久久国产成人免费| 在线观看舔阴道视频| 亚洲片人在线观看| 午夜激情福利司机影院| 国产精品亚洲一级av第二区| 嫩草影院精品99| 特大巨黑吊av在线直播| 麻豆久久精品国产亚洲av| 淫秽高清视频在线观看| 国产av一区在线观看免费| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 久久久久久久精品吃奶| 窝窝影院91人妻| 美女免费视频网站| 久久久国产成人免费| 一本综合久久免费| 久久精品国产清高在天天线| 成人鲁丝片一二三区免费| av天堂中文字幕网| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 久久久国产成人精品二区| 成人永久免费在线观看视频| 久久99热这里只有精品18| 97热精品久久久久久| 高潮久久久久久久久久久不卡| 人人妻人人澡欧美一区二区| 午夜免费激情av| 国产精品人妻久久久久久| 欧美bdsm另类| 给我免费播放毛片高清在线观看| 亚洲成av人片在线播放无| 国产一区二区在线观看日韩| 欧美乱妇无乱码| 欧美国产日韩亚洲一区| 永久网站在线| 美女xxoo啪啪120秒动态图 | 精品久久久久久久久亚洲 | 午夜精品一区二区三区免费看| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 一个人观看的视频www高清免费观看| 国产成人a区在线观看| 国产av在哪里看| 18美女黄网站色大片免费观看| 成人欧美大片| www.色视频.com| 可以在线观看的亚洲视频| 国产毛片a区久久久久| 精品午夜福利在线看| 桃色一区二区三区在线观看| 欧美日韩黄片免| 一级毛片久久久久久久久女| 日韩大尺度精品在线看网址| 国内揄拍国产精品人妻在线| 久久久久性生活片| 亚洲成人久久性| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 日日夜夜操网爽| 国产一区二区在线观看日韩| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 亚洲av二区三区四区| 国产三级黄色录像| 观看免费一级毛片| 色在线成人网| 精品熟女少妇八av免费久了| 午夜两性在线视频| 亚洲黑人精品在线| 久久久久久久久中文| 亚洲美女视频黄频| 桃色一区二区三区在线观看| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 嫩草影院新地址| 淫妇啪啪啪对白视频| 精品人妻视频免费看| 好男人在线观看高清免费视频| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 国产成年人精品一区二区| 国产单亲对白刺激| 波多野结衣高清无吗| 精品久久久久久久末码| 99久久99久久久精品蜜桃| 色吧在线观看| 成人亚洲精品av一区二区| 91久久精品电影网| 最后的刺客免费高清国语| 91九色精品人成在线观看| 97超视频在线观看视频| 国产成人啪精品午夜网站| 欧美+亚洲+日韩+国产| 一区二区三区免费毛片| 国内精品一区二区在线观看| 听说在线观看完整版免费高清| 久久国产精品人妻蜜桃| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 可以在线观看的亚洲视频| av天堂中文字幕网| 丝袜美腿在线中文| 国产精品亚洲美女久久久| 国产成年人精品一区二区| 欧美成人免费av一区二区三区| 我的老师免费观看完整版| 两个人视频免费观看高清| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 国产免费av片在线观看野外av| xxxwww97欧美| 久久精品人妻少妇| 成人av在线播放网站| 99久久九九国产精品国产免费| 久久精品综合一区二区三区| 99热这里只有是精品50| 亚洲激情在线av| 又爽又黄无遮挡网站| 国产高潮美女av| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 免费观看精品视频网站| eeuss影院久久| 国产成人aa在线观看| 国产老妇女一区| 舔av片在线| 国产在视频线在精品| 亚洲精品一区av在线观看| 国产亚洲av嫩草精品影院| 欧美不卡视频在线免费观看| 制服丝袜大香蕉在线| 国产欧美日韩精品一区二区| 国产精品久久久久久精品电影| 国产成人aa在线观看| 熟女电影av网| 精品久久久久久久末码| 伦理电影大哥的女人| 听说在线观看完整版免费高清| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 最新中文字幕久久久久| bbb黄色大片| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 高潮久久久久久久久久久不卡| 精品国产三级普通话版| 好男人在线观看高清免费视频| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 国产精品精品国产色婷婷| 免费人成在线观看视频色| 国产精品久久久久久精品电影| 免费看日本二区| 此物有八面人人有两片| 欧美xxxx性猛交bbbb| 亚洲第一区二区三区不卡| 欧美黑人巨大hd| 欧美日韩国产亚洲二区| 特级一级黄色大片| avwww免费| 欧美3d第一页| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区 | 中文字幕av成人在线电影| 性插视频无遮挡在线免费观看| av专区在线播放| avwww免费| 日本一二三区视频观看| 中文亚洲av片在线观看爽| 日韩av在线大香蕉| 亚洲av五月六月丁香网| 久久6这里有精品| 国产激情偷乱视频一区二区| 高清日韩中文字幕在线| 嫩草影院入口| av国产免费在线观看| 精品久久久久久久末码| 国产精品一区二区免费欧美| 少妇人妻一区二区三区视频| 桃红色精品国产亚洲av| 成人永久免费在线观看视频| 国产精品av视频在线免费观看| 亚洲欧美激情综合另类| 婷婷精品国产亚洲av| 天堂动漫精品| 校园春色视频在线观看| 日韩人妻高清精品专区| 天天躁日日操中文字幕| 国产精品野战在线观看| 国产真实伦视频高清在线观看 | 国产精品一区二区三区四区久久| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 欧美日韩黄片免| а√天堂www在线а√下载| 别揉我奶头 嗯啊视频| 免费在线观看影片大全网站| 一个人免费在线观看电影| 久久久久精品国产欧美久久久| 久久精品人妻少妇| 亚洲精品影视一区二区三区av| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 香蕉av资源在线| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 在线播放无遮挡| 国产精品影院久久| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 在线免费观看不下载黄p国产 | 婷婷精品国产亚洲av| 亚洲av成人av| 如何舔出高潮| 国产精品久久久久久久电影| 国产91精品成人一区二区三区| 日韩亚洲欧美综合| 99热精品在线国产| 国产真实伦视频高清在线观看 | xxxwww97欧美| 在线天堂最新版资源| 日韩欧美免费精品| 特级一级黄色大片| 美女xxoo啪啪120秒动态图 | 最后的刺客免费高清国语| 99久久九九国产精品国产免费| 欧美成人性av电影在线观看| 欧美不卡视频在线免费观看| 精品久久久久久久末码| 全区人妻精品视频| 1024手机看黄色片| 国产午夜福利久久久久久| 日本一二三区视频观看| 国产一区二区三区视频了| 国产亚洲精品久久久com| 一个人看视频在线观看www免费| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片 | 性欧美人与动物交配| 午夜福利18| 性欧美人与动物交配| 少妇人妻一区二区三区视频| 亚洲avbb在线观看| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 别揉我奶头 嗯啊视频| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 精品午夜福利视频在线观看一区| 一a级毛片在线观看| 欧美极品一区二区三区四区| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 午夜久久久久精精品| 亚洲综合色惰| 亚洲天堂国产精品一区在线| 欧美精品国产亚洲| 免费观看精品视频网站| 亚洲无线在线观看| 亚洲,欧美,日韩| 亚洲av一区综合| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片 | 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 神马国产精品三级电影在线观看| 亚洲欧美激情综合另类| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 欧美色欧美亚洲另类二区| 两个人的视频大全免费| 精品熟女少妇八av免费久了| 此物有八面人人有两片| 一级av片app| 精品久久久久久久久亚洲 | 天堂影院成人在线观看| 亚洲精品色激情综合| 天堂网av新在线| 天堂√8在线中文| 99久久精品一区二区三区| 国产黄a三级三级三级人| 亚洲三级黄色毛片| 乱人视频在线观看| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 色播亚洲综合网| 国语自产精品视频在线第100页| 97热精品久久久久久| 日本黄色视频三级网站网址| 简卡轻食公司| 欧美日本亚洲视频在线播放| 中文字幕免费在线视频6| 精品一区二区免费观看| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 国产三级黄色录像| 国产精品99久久久久久久久| 欧美在线一区亚洲| 一个人看视频在线观看www免费| 欧美激情在线99| 日韩精品中文字幕看吧| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 99久久精品一区二区三区| 乱人视频在线观看| 欧美不卡视频在线免费观看| 美女cb高潮喷水在线观看| 国产午夜福利久久久久久| 国产亚洲av嫩草精品影院| 永久网站在线| 午夜激情欧美在线| 深夜a级毛片| 亚洲人成网站在线播| 日本与韩国留学比较| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 久久国产乱子伦精品免费另类| 中出人妻视频一区二区| 国产精品久久久久久精品电影| 老女人水多毛片| 亚洲av免费在线观看| 国产探花在线观看一区二区| 听说在线观看完整版免费高清| 一个人看视频在线观看www免费| 欧美在线一区亚洲| 日本黄色视频三级网站网址| 一进一出抽搐动态| 日韩欧美精品v在线| 成年免费大片在线观看| www日本黄色视频网| 色尼玛亚洲综合影院| 欧美bdsm另类| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 国产精品一及| 99久久精品一区二区三区| av在线天堂中文字幕| 天天一区二区日本电影三级| 18美女黄网站色大片免费观看| 国产一级毛片七仙女欲春2| 国产欧美日韩一区二区精品| 免费看a级黄色片| 色av中文字幕| 久久中文看片网| 男女床上黄色一级片免费看| 国产欧美日韩精品一区二区| 欧美黑人欧美精品刺激| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 一级毛片久久久久久久久女| 女同久久另类99精品国产91| 国产成人aa在线观看| 亚洲国产精品sss在线观看| 在线播放国产精品三级| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 国产成+人综合+亚洲专区| 免费搜索国产男女视频| 我的老师免费观看完整版| 可以在线观看的亚洲视频| 精品一区二区三区人妻视频| 首页视频小说图片口味搜索| 黄色女人牲交| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 91在线精品国自产拍蜜月| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 丁香欧美五月| 成人美女网站在线观看视频| 亚洲av一区综合| 女同久久另类99精品国产91| 在线免费观看不下载黄p国产 | 91久久精品国产一区二区成人| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 成年免费大片在线观看| 国产私拍福利视频在线观看| 亚洲成av人片在线播放无| 毛片一级片免费看久久久久 | 亚洲成人免费电影在线观看| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 极品教师在线视频| 国产伦精品一区二区三区视频9| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 中文字幕熟女人妻在线| 在线观看66精品国产| 一级作爱视频免费观看| 国产一区二区在线观看日韩| 精品一区二区三区av网在线观看| 国产精品女同一区二区软件 | 亚洲激情在线av| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 一区二区三区四区激情视频 | 国产v大片淫在线免费观看| 欧美黄色片欧美黄色片| 在线观看舔阴道视频| 嫩草影院入口| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 亚洲男人的天堂狠狠| 国产av不卡久久| 欧美精品啪啪一区二区三区| 久久九九热精品免费| 亚洲自拍偷在线| 亚洲天堂国产精品一区在线| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 一个人看的www免费观看视频| 真人一进一出gif抽搐免费| 日韩欧美国产一区二区入口| 亚洲美女搞黄在线观看 | 亚洲激情在线av| 99久久精品一区二区三区| 99国产精品一区二区蜜桃av| 久久久久久九九精品二区国产| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 免费电影在线观看免费观看| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| www.www免费av| 精品人妻1区二区| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 舔av片在线| 全区人妻精品视频| 女人被狂操c到高潮| 亚洲激情在线av| 搡老熟女国产l中国老女人| 午夜免费激情av| 久久国产乱子伦精品免费另类| 男女那种视频在线观看| 亚洲av一区综合| 欧美日韩黄片免| 91麻豆av在线| 色哟哟·www| 国产精品98久久久久久宅男小说| 亚洲人成伊人成综合网2020| 国产精品免费一区二区三区在线| 国产伦一二天堂av在线观看| 给我免费播放毛片高清在线观看| 精华霜和精华液先用哪个| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 久久6这里有精品| 精品人妻偷拍中文字幕| www.熟女人妻精品国产| 亚洲性夜色夜夜综合| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 国产精品久久久久久久久免 | 日韩欧美国产在线观看| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 精品久久久久久久末码| 亚洲精品一区av在线观看| 国产高清三级在线| 国产高清有码在线观看视频| 国产乱人视频| 乱码一卡2卡4卡精品| 一个人免费在线观看电影| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 亚洲不卡免费看| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 精品午夜福利视频在线观看一区| 国产三级黄色录像| 99视频精品全部免费 在线| 色视频www国产| 国产欧美日韩精品亚洲av| 伦理电影大哥的女人| 国内精品久久久久久久电影| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 又黄又爽又免费观看的视频| 国产麻豆成人av免费视频| 黄色女人牲交| 亚洲,欧美,日韩| 成人性生交大片免费视频hd| 国产精品久久久久久精品电影| 成人永久免费在线观看视频| 国产真实乱freesex| 国产高清激情床上av| netflix在线观看网站| 男人和女人高潮做爰伦理| 久久亚洲精品不卡| 在线国产一区二区在线| 亚洲av免费高清在线观看| 午夜a级毛片| 色5月婷婷丁香| 成人av在线播放网站| 欧美午夜高清在线| 亚洲欧美日韩东京热| 午夜激情福利司机影院| 欧美黑人欧美精品刺激| 看十八女毛片水多多多| 99热这里只有是精品在线观看 | 日韩国内少妇激情av| 亚洲人与动物交配视频| 国产私拍福利视频在线观看| 亚洲国产精品合色在线| 精品无人区乱码1区二区| 日本精品一区二区三区蜜桃|