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    豬肉源大腸桿菌分離鑒定及其生物被膜形成

    2022-12-30 05:19:08季君珂宓曉雨張文棟袁楊洋
    肉類研究 2022年11期
    關(guān)鍵詞:成膜微孔屠宰

    季君珂,宓曉雨,程 宇,張文棟,張 晨,袁楊洋,江 蕓

    (南京師范大學(xué)食品與制藥工程學(xué)院,江蘇 南京 210023)

    肉品腐敗變質(zhì)給人類食品供應(yīng)帶來極大危害。生鮮肉營(yíng)養(yǎng)豐富、含水量高、極易腐敗。以往研究認(rèn)為肉類微生物的污染主要來自胴體污染,但近年研究發(fā)現(xiàn),最主要來源是接觸表面污染[1]。生豬屠宰、分割、運(yùn)輸?shù)入A段均可能通過直接接觸使畜禽胴體和分割肉污染大腸桿菌[2],而微生物在生產(chǎn)加工表面形成的生物被膜被認(rèn)為是主要的交叉污染源頭[3]。

    大腸桿菌在自然環(huán)境中廣泛存在,極易污染肉、魚、乳、蔬菜、水果等,引起食品腐敗[4]。致病性大腸桿菌還可引起人類腸道或腸道外感染,甚至?xí)?dǎo)致死亡[5]。在許多國(guó)家,大腸桿菌和大腸菌群通常被認(rèn)為是食品衛(wèi)生質(zhì)量的指示菌[6]。大腸桿菌可以在不銹鋼、玻璃、聚苯乙烯等食品加工接觸表面及食品表面黏附、定植、形成生物被膜[7]。生物被膜是細(xì)菌為了更好地適應(yīng)生存環(huán)境而黏附于接觸表面,通過菌體增殖生長(zhǎng)、分泌大量胞外聚合物(extracellular polymeric substances,EPS)而形成的具有一定空間結(jié)構(gòu)的細(xì)菌聚集體[8]。EPS是生物被膜中細(xì)胞周圍的厚基質(zhì),其多層性質(zhì)是保護(hù)生物被膜內(nèi)細(xì)菌細(xì)胞的主要機(jī)制[9]。EPS的主要成分是占比高達(dá)97%的水,此外還包括胞外多糖、聚合物、蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)、吸收的營(yíng)養(yǎng)素及代謝物[10-11]。EPS的存在可以提供細(xì)菌物理屏障,減緩抗菌劑向生物被膜內(nèi)細(xì)胞的擴(kuò)散,從而使酶有時(shí)間降解某些毒性分子,使得生物被膜的抗藥性增強(qiáng),難以消除,形成持續(xù)性污染[12-13]。

    大腸桿菌生物被膜形成的相關(guān)基因,如csgA、fimH和papC是附著和感染宿主的重要因子,并且與抗菌素耐藥性有關(guān)[14]。csgA基因與大腸桿菌在接觸面的初始黏附有關(guān),而fimH基因編碼F1菌毛的黏附亞基,促進(jìn)定植、侵入和形成生物被膜。在一些犬類和人體中,papC基因能夠使大腸桿菌在內(nèi)臟中黏附和存活[15]。

    為此,本研究首先從生豬屠宰線、豬胴體表面及生鮮豬肉中分離鑒定大腸桿菌,進(jìn)而采用微孔板結(jié)晶紫染色法評(píng)價(jià)豬肉源大腸桿菌分離株在屠宰加工常見溫度(15 ℃)下的生物被膜形成能力,進(jìn)一步選取代表性菌株探討生物被膜形成過程中被膜量、EPS組成及大腸桿菌成膜基因表達(dá)的變化。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    生鮮豬肉,購(gòu)于南京農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)某品牌專賣柜。

    食品級(jí)304不銹鋼片(75 mm×25 mm×1 mm,2B光潔面)、玻璃容器 南通順豐醫(yī)療器械有限公司;96 孔透明細(xì)胞培養(yǎng)板 美國(guó)Corning公司;大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC43895 美國(guó)菌種保藏中心;胰蛋白胨大豆瓊脂(tryptone soya agar,TSA)、胰蛋白胨大豆肉湯(tryptic soy broth,TSB)、酵母提取物(yeast extract,YE)、大腸桿菌和大腸菌群顯色培養(yǎng)基(E.coliand coliform chromogenic agar plates,ECCA)、麥康凱瓊脂(MacConkey agar,MAC) 北京陸橋技術(shù)有限公司;結(jié)晶紫、乙醇、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)、丙酮(均為分析純) 南京藤春生物科技有限公司;苯酚(分析純) 南京峰昌生物科技有限公司;濃硫酸(分析純) 南京化學(xué)試劑有限公司;BCA蛋白含量測(cè)定試劑盒 南京建成生物科技有限公司;總RNA提取試劑盒、PrimeSTAR?Max DNA聚合酶、熒光定量試劑盒日本TaKaRa公司;DNA Marker(DL 2000)、Gel Red核酸染料 上海生物工程有限公司;PremixTaq酶 蘇州近岸蛋白科技有限公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    M2多功能酶標(biāo)儀 美國(guó)Molecular Devices公司;Thermal Cycler普通聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)儀 美國(guó)Molecular Devices公司;Universal Hood II凝膠成像儀 美國(guó)Bio-Rad公司;2-16KL高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)Sigma公司;Nano-30微量紫外分光光度計(jì) 杭州奧盛儀器有限公司;DYCP-32B瓊脂糖水平電泳儀 北京六一生物科技有限公司;SW-CJ-2F超凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;HVE-50立式壓力蒸汽滅菌鍋日本Hirayama公司;HX-4拍打式無(wú)菌均質(zhì)器 上海瀘析實(shí)業(yè)有限公司;QL-200微型渦旋混合儀 海門其林貝爾儀器有限公司;ZQTY-70臺(tái)式振蕩培養(yǎng)箱 上海知楚儀器有限公司;DHP-9052電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司。

    1.3 方法

    1.3.1 肉源大腸桿菌的分離鑒定

    1.3.1.1 肉源大腸桿菌的分離純化

    生鮮豬肉樣品于超凈工作臺(tái)剪取25 g,放入加有80 mL無(wú)菌生理鹽水的無(wú)菌均質(zhì)袋中,均質(zhì)機(jī)充分拍打2 min(8 次/s)。某生豬屠宰企業(yè)的屠宰車間(傳送帶表面、操作臺(tái)表面以及車間工人刀具、手套表面)及豬酮體表面采用棉簽涂抹擦拭法取樣,取樣后用無(wú)菌剪刀將棉簽頭剪于裝有10 mL無(wú)菌生理鹽水的離心管中,用渦旋混勻器充分渦旋。

    取一定體積的上述樣液進(jìn)行梯度稀釋,選擇合適稀釋度涂布于ECCA平板,37 ℃培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后挑取藍(lán)綠色并呈現(xiàn)圓形凸起的可疑菌落至MAC平板上反復(fù)進(jìn)行平板劃線分離,分離純化3 次[16]。純化后的可疑菌株于含體積分?jǐn)?shù)25%甘油的TSB中-80 ℃凍存。

    1.3.1.2 大腸桿菌屬特異性PCR鑒定

    將上述凍存的可疑菌株在TSA-YE平板上劃線活化2 次,37 ℃倒置培養(yǎng)24 h,挑取單菌落于加入150 μL滅菌蒸餾水的1.5 mL離心管,渦旋,99 ℃水浴10 min,冰浴2 min,12 000×g離心2 min,吸取上清液至另一離心管中即為細(xì)菌基因組DNA,-20 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

    采用PCR擴(kuò)增大腸桿菌屬特異基因phoA,其擴(kuò)增序列引物:F:5’-CGATGCCTTACCGCTTAC-3’;R:5’-TTTCCCTGCCATTCACC-3’[17]。反應(yīng)體系(25 μL):模板DNA 1 μL,上、下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL,PremixTaq酶12.5 μL,ddH2O 10.5 μL。反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性5 min,95 ℃變性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s,共30 個(gè)循環(huán),72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增完成后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(120 V、25 min),凝膠成像儀成像觀察。

    1.3.2 肉源大腸桿菌生物被膜形成能力比較

    1.3.2.1 菌液制備

    將凍存的肉源大腸桿菌在TSA-YE平板上劃線活化2 次,37 ℃培養(yǎng)24 h。挑取單菌落分別接種于3 mL TSB中,37 ℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)18 h,連續(xù)活化2 次,取生長(zhǎng)達(dá)到穩(wěn)定期的菌液1 mL于4 ℃、8 000×g離心5 min,棄去上清,用PBS(pH 7.2)洗滌3 次,調(diào)整菌懸液濃度為108CFU/mL左右,備用。

    1.3.2.2 微孔板結(jié)晶紫染色法分析大腸桿菌生物被膜形成能力

    將上述菌懸液用TSB梯度稀釋至102CFU/mL,吸取180 μL至96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,封口膜封口。置于15 ℃培養(yǎng)72 h,以無(wú)菌TSB作為對(duì)照。培養(yǎng)結(jié)束后,棄去微孔板中培養(yǎng)液,用無(wú)菌蒸餾水漂洗3 次,室溫下干燥30 min后,每孔加入200 μL 0.25 g/100 mL結(jié)晶紫染色30 min,棄去染液后用無(wú)菌蒸餾水漂洗3 次,之后用200 μL體積分?jǐn)?shù)95%乙醇溶液洗脫(30 min)黏附于微孔表面的菌體,最后將微孔板置于酶標(biāo)儀中,在570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定光密度OD570nm,每個(gè)菌株重復(fù)測(cè)定6 次,結(jié)果取平均值。

    菌株根據(jù)所得OD570nm進(jìn)一步作如下分類[18]:無(wú)生物被膜形成能力:OD570nm≤ODc;較弱生物被膜形成能力:ODc<OD570nm≤2×ODc;中等生物被膜形成能力:2×ODc<OD570nm≤4×ODc;較強(qiáng)生物被膜形成能力:4×ODc<OD570nm。其中ODc為臨界值,按式(1)計(jì)算。

    1.3.3 大腸桿菌生物被膜形成曲線

    根據(jù)1.3.2.2節(jié)結(jié)果,選取1 株代表菌株按照上述方法進(jìn)行微孔板操作,分別在培養(yǎng)24、72、120、168 h取樣,以無(wú)菌TSB作為對(duì)照組。經(jīng)結(jié)晶紫染液染色、乙醇洗脫,測(cè)定OD570nm,去除對(duì)照組OD570nm后按照培養(yǎng)時(shí)間繪制生物被膜形成曲線。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)均重復(fù)測(cè)定6 次。

    1.3.4 大腸桿菌生物被膜形成時(shí)EPS含量分析

    1.3.4.1 大腸桿菌生物被膜制備與處理

    選用食品級(jí)304不銹鋼片作為生物被膜形成的接觸載體。為防止不銹鋼片表面附著的化學(xué)雜質(zhì)及油污影響生物被膜的形成,使用前對(duì)不銹鋼片進(jìn)行徹底清洗。具體方法如下:將洗凈的鋼片放入丙酮溶液中浸泡3 h,拭凈后用乙醇溶液浸泡12 h,最后用蒸餾水沖洗干凈并晾干[19]。實(shí)驗(yàn)前,經(jīng)121 ℃滅菌20 min備用。

    將1.3.2.1節(jié)制備的大腸桿菌菌懸液接種至含新鮮TSB和不銹鋼片的無(wú)菌玻璃容器中,菌液濃度約為106CFU/mL。無(wú)菌保鮮膜封口,15 ℃下靜置培養(yǎng)72 h和168 h。培養(yǎng)結(jié)束后取出不銹鋼片并用無(wú)菌生理鹽水漂洗3 次以去除表面未黏附菌體,采用棉簽擦拭法收集不銹鋼片表面的生物被膜。將拭子置于裝有10 mL無(wú)菌生理鹽水和一定量玻璃珠的離心管中,充分渦旋3 min使拭子上的菌體充分脫落,得到的菌懸液用于EPS含量測(cè)定。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

    1.3.4.2 EPS中蛋白質(zhì)和多糖含量測(cè)定

    參考Cao Bin等[20]的方法制備1.3.4.1節(jié)菌懸液中的松散型EPS(loose EPS,L-EPS)和緊密型EPS(bound EPS,B-EPS)。L-EPS和B-EPS的蛋白含量采用BCA蛋白含量檢測(cè)試劑盒測(cè)定。蛋白質(zhì)-吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.001 8x+0.151 4(R2=0.997 8),其中x為蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度/(μg/mL),y為吸光度,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算EPS中蛋白質(zhì)含量??偺呛坎捎帽椒恿蛩岱╗21]測(cè)定,多糖-吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.195 6x+0.081 8(R2=0.997 3),其中x為葡萄糖質(zhì)量濃度/(μg/mL),y為吸光度,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算EPS中多糖含量。

    1.3.5 生物被膜中相關(guān)成膜基因表達(dá)量測(cè)定

    1.3.5.1 生物被膜的收集

    以食品級(jí)304不銹鋼片作為接觸載體,15 ℃下靜置培養(yǎng)72 h和168 h后收集生物被膜,方法同1.3.4.1節(jié)。將菌懸液4 ℃、12 000×g離心15 min,沉淀用于核酸提取。

    1.3.5.2 總RNA提取及cDNA合成

    按照總RNA提取試劑盒說明書進(jìn)行,用核酸蛋白微量測(cè)定儀測(cè)定提取的總RNA濃度和純度,確定RNA濃度和純度合格(OD260nm/OD280nm為1.8~2.0),調(diào)整RNA濃度后,根據(jù)Prime ScriptTMRT Master Mix反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄體系(10 μL):2 μL 5×Prime Script RT Master Mix混合液、2 μL RNA、6 μL無(wú)RNA酶水;反應(yīng)程序:37 ℃、15 min,85 ℃反轉(zhuǎn)錄酶失活反應(yīng)5 s,保持4 ℃。將反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA于-20 ℃保存進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

    1.3.5.3 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒構(gòu)建及標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

    大腸桿菌csgA、papC、fimH基因及引物情況見表1,引物由上海生物工程有限公司合成。

    表1 實(shí)驗(yàn)所用PCR引物Table 1 PCR primers used in this study

    標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒由南京擎科公司構(gòu)建合成。取測(cè)序結(jié)果正確的質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒,采用微量分光光度計(jì)測(cè)定純度和質(zhì)量濃度,按式(2)計(jì)算質(zhì)粒DNA拷貝數(shù)。

    使用無(wú)RNA酶水梯度稀釋,使標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)質(zhì)粒的質(zhì)量濃度為100~10-6ng/μL,作為模板。PCR反應(yīng)體系(20 μL):SYBR Green Master(2×)(ROX)10 μL,PCR正、反向引物(10 μmol/L)各0.25 μL,DNA模板2 μL,雙蒸水7.5 μL。反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性30 s后,95 ℃5 s、60 ℃ 30 s反應(yīng)40 個(gè)循環(huán),95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min、95 ℃保持15 s。以拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值(lg(copies/μL))為橫坐標(biāo),循環(huán)閾(cycle threshold,Ct)值為縱坐標(biāo),構(gòu)建一元線性方程,即為標(biāo)準(zhǔn)曲線。

    1.3.5.4 相關(guān)成膜基因熒光定量PCR分析

    以1.3.5.2節(jié)制備的cDNA為模板進(jìn)行熒光定量PCR,用所得樣品的Ct值通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算目標(biāo)基因表達(dá)量(lg(copies/μL)),進(jìn)一步計(jì)算不銹鋼片生物被膜中成膜基因表達(dá)量(copies/cm2)。

    1.4 數(shù)據(jù)處理

    利用GraphPad Prism 8軟件(GraphPad Software公司)處理相應(yīng)數(shù)據(jù)及圖表分析,采用SPSS 17.0(IBM公司)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析和Duncan’s多重比較檢驗(yàn),2 組之間顯著性差異分析采用t檢驗(yàn)。結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,P<0.05時(shí)差異顯著。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 肉源大腸桿菌的分離與鑒定

    由圖1可知,ECCA大腸桿菌顯色平板中共分離得到藍(lán)綠色可疑菌落350 個(gè),可疑菌落進(jìn)一步采用MAC平板劃線分離純化,得到粉紅色可疑菌株90 株。采用大腸桿菌菌屬特異性PCR擴(kuò)增phoR基因,由圖2可知,擴(kuò)增出陽(yáng)性條帶(444 bp),共鑒定到陽(yáng)性菌株31 株,其中4 株來源于生豬胴體表面,11 株來源于生豬屠宰線,16 株來源于生鮮豬肉,菌株信息見表2。

    圖1 大腸桿菌在ECCA平板(A)和MAC平板(B)上的生長(zhǎng)情況Fig.1 Growth of E.coli on ECCA (A) and MAC plates (B)

    圖2 部分菌株的屬特異性PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.2 Electrophoresis profile of genus-specific PCR products of selected isolates

    表2 大腸桿菌鑒定結(jié)果Table 2 Results of identification of E.coli

    大腸桿菌是人和動(dòng)物腸道共生菌群的組成部分,部分致病性大腸桿菌能引起人體感染而致病[25]。受屠宰加工方式及運(yùn)輸條件等因素影響,豬肉從屠宰場(chǎng)到餐桌的過程中,會(huì)受到不同程度的微生物污染[26]。國(guó)內(nèi)有關(guān)學(xué)者對(duì)不同環(huán)境中大腸桿菌的污染情況進(jìn)行了許多調(diào)查。吳萱[27]、于慶華[28]等的研究均從豬肉流通的不同環(huán)節(jié)中分離到大腸桿菌,可能來源于畜禽腸道及體表、屠宰、貯存、運(yùn)輸、銷售環(huán)境,也有可能來源于屠宰或銷售人員。本研究從生豬屠宰線、豬胴體表面及生鮮豬肉表面分離到大腸桿菌,證實(shí)了大腸桿菌在豬肉生產(chǎn)環(huán)節(jié)中普遍存在,表明生產(chǎn)加工環(huán)境中加強(qiáng)衛(wèi)生監(jiān)控對(duì)控制豬肉微生物污染和降低食品安全隱患十分必要。

    2.2 大腸桿菌生物被膜形成能力分析

    采用微孔板結(jié)晶紫染色法評(píng)估31 株肉源大腸桿菌的生物被膜形成能力,大多菌株均可在微孔板底部見到一層淡紫色薄膜,加入乙醇溶解后,不同菌株孔板中顏色深淺不同。進(jìn)一步測(cè)定OD570nm,由圖3可知,不同菌株間生物被膜形成能力存在顯著差異。31 株肉源大腸桿菌中,27 株菌株表現(xiàn)出生物被膜形成能力。按照臨界值ODc的生物被膜形成能力進(jìn)行分類,強(qiáng)、中、弱、無(wú)4 種生物被膜表型的菌株數(shù)量分別為3、4、20、4 株,分別占菌株總數(shù)的9.68%、12.90%、64.52%和12.90%。

    圖3 31 株大腸桿菌微孔板表面生物被膜形成能力Fig.3 Biofilm formation ability of 31 isolates of E.coli on polystyrene microplate surfaces

    在實(shí)際生產(chǎn)中,生豬屠宰車間的溫度為13.28~16.70 ℃,平均(15.85±0.99) ℃[29]。因此本研究結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際,探討15 ℃條件下肉源大腸桿菌生物被膜形成情況。研究表明,大多數(shù)食源性腐敗菌,如假單胞菌[30]、希瓦氏菌[31]等均具有一定的生物被膜形成能力且存在明顯菌株差異。本研究亦發(fā)現(xiàn),肉源大腸桿菌的生物被膜形成能力存在明顯菌株差異,且大多數(shù)大腸桿菌生物被膜形成能力較弱。這與前人的一些報(bào)道類似,王嫻靜等[32]用微孔板結(jié)晶紫法評(píng)價(jià)14 株大腸桿菌O157:H7的生物被膜形成能力,發(fā)現(xiàn)所有菌株均具有一定的生物被膜形成能力,其中85.7%菌株成膜能力較弱且存在明顯的菌株差異性。即使大腸桿菌的成膜能力較弱,一旦形成生物被膜,對(duì)清潔劑、消毒劑等的抗性增強(qiáng),不易清除,則可能成為持續(xù)的污染源頭。因此探討肉類屠宰加工環(huán)境及肉中大腸桿菌的生物被膜形成對(duì)生鮮肉安全生產(chǎn)和污染控制具有科學(xué)指導(dǎo)意義。

    本研究中肉源大腸桿菌中60%以上菌株的生物被膜形成能力較弱,從這些菌株中隨機(jī)選取1 株大腸桿菌D4-18進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

    2.3 結(jié)晶紫染色法檢測(cè)大腸桿菌D4-18生物被膜的生長(zhǎng)過程

    采用結(jié)晶紫染色法研究大腸桿菌D4-18生物被膜的形成過程。由圖4可知,大腸桿菌D4-18生物被膜在24 h時(shí)形成量較少,隨著時(shí)間延長(zhǎng),OD570nm逐漸增大,即生物被膜形成量逐漸增多,168 h時(shí)生物被膜量達(dá)到最大值。研究表明,生物被膜形成過程是一個(gè)動(dòng)態(tài)的過程,分為起始黏附期、集聚增殖期、成熟期及脫落散播期4 個(gè)階段[33]。李安琪等[34]發(fā)現(xiàn),副溶血弧菌在微孔板中37 ℃培養(yǎng)48~72 h時(shí)達(dá)到生物被膜的成熟階段,72~144 h時(shí)達(dá)到生物被膜的解離階段。鄧小玲等[35]報(bào)道了大腸桿菌在微孔板中37 ℃條件下形成生物被膜的動(dòng)態(tài)過程,發(fā)現(xiàn)有部分大腸桿菌在72 h后進(jìn)入脫落期。王嫻靜等[32]研究大腸桿菌O157:H7在微孔板中25 ℃條件下生物被膜形成過程,發(fā)現(xiàn)成膜能力較強(qiáng)的菌株J29培養(yǎng)48 h后生物被膜量緩慢增多,成膜能力中等的菌株ATCC43895在60 h后生物被膜量增長(zhǎng)較快,168 h時(shí)達(dá)到最多,其他成膜能力弱的菌株在168 h內(nèi)生物被膜量都維持在較低的相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)。本研究中,大腸桿菌D4-18在微孔板中15 ℃條件下培養(yǎng)168 h生物被膜量持續(xù)增長(zhǎng)。上述研究表明,生物被膜形成過程與菌種、菌株的生物被膜形成能力、培養(yǎng)溫度等成膜條件有關(guān)。

    圖4 大腸桿菌D4-18生物被膜形成曲線Fig.4 Curve of biofilm formation of E.coli D4-18

    2.4 大腸桿菌D4-18生物被膜形成時(shí)EPS中蛋白質(zhì)和多糖含量變化

    由圖5可知,成膜72 h時(shí)大腸桿菌D4-18產(chǎn)生了一定量胞外蛋白質(zhì)和胞外多糖,隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng),EPS含量增加,其中L-EPS中蛋白質(zhì)及多糖的含量均極顯著增加(P<0.01),B-EPS中蛋白質(zhì)含量極顯著增加(P<0.01)。EPS基質(zhì)在生物被膜發(fā)育、發(fā)展和成熟階段發(fā)揮重要作用,與菌體的黏附、支架、機(jī)械穩(wěn)定性和保護(hù)作用密切相關(guān)[36]。EPS中蛋白質(zhì)與多糖的含量可以在一定程度上反映生物被膜發(fā)育程度。蛋白質(zhì)中含有的氨基酸及部分疏水性氨基酸增加了細(xì)菌細(xì)胞表面疏水性[37-38],而多糖中含有的羧基、羥基等親水官能團(tuán)增加了細(xì)胞的親水性。使得EPS同時(shí)具有疏水和親水的特性。多糖的黏性可以更好包裹細(xì)菌,使得菌體更加穩(wěn)定地黏附在非生物表面。蛋白的疏水性增強(qiáng)了菌體在疏水性的不銹鋼表面定植、聚集、形成生物被膜和獲取營(yíng)養(yǎng)的能力,從而增強(qiáng)了細(xì)菌對(duì)外界惡劣環(huán)境的抵抗力[39]。

    圖5 大腸桿菌D4-18生物被膜中L-EPS和B-EPS蛋白質(zhì)(A)及多糖(B)含量Fig.5 Content of protein (A) and polysaccharide (B) in L-EPS and B-EPS in the biofilm of E.coli D4-18

    2.5 生物被膜中相關(guān)成膜基因的表達(dá)變化

    大腸桿菌D4-18的3 種成膜基因papC、fimH、csgA標(biāo)準(zhǔn)曲線如表3所示,相關(guān)系數(shù)R2均大于0.99,Ct值滿足標(biāo)準(zhǔn)曲線要求。

    表3 papC、fimH、csgA基因標(biāo)準(zhǔn)曲線Table 3 Standard curves for detection of papC, fimH, and csgA genes

    由圖6可知,大腸桿菌在15 ℃條件下培養(yǎng)72 h時(shí),papC、fimH、csgA基因的表達(dá)量分別為0.095、0.933、0.435 copies/cm2,培養(yǎng)168 h時(shí)papC基因表達(dá)量顯著增多(P<0.05),fimH基因表達(dá)量極顯著增多(P<0.01),csgA基因表達(dá)量無(wú)顯著變化。關(guān)于大腸桿菌生物被膜形成時(shí)相關(guān)基因表達(dá)方面有較多報(bào)道,朱琳等[40]研究發(fā)現(xiàn),fimA基因和fliC基因編碼菌毛屬細(xì)菌的黏附結(jié)構(gòu),在生物被膜的初始黏附階段起重要作用,flu基因編碼的Ag43能促進(jìn)細(xì)菌的自聚集,有利于細(xì)菌生物被膜團(tuán)聚結(jié)構(gòu)的形成。Surgers等[41]研究發(fā)現(xiàn),papC基因的存在與生物被膜形成有很強(qiáng)的相關(guān)性。Ren等[42]采用DNA微陣列研究大腸桿菌生物被膜的基因表達(dá),發(fā)現(xiàn)fimH基因在生物被膜形成時(shí)表達(dá)上調(diào)。Bhardwaj等[43]采用熒光定量PCR相對(duì)定量發(fā)現(xiàn),csgA基因在大腸桿菌生物被膜形成時(shí)表達(dá)上調(diào)。本研究采用熒光定量PCR絕對(duì)定量同樣發(fā)現(xiàn),在不銹鋼接觸表面形成的生物被膜中,papC、fimH、csgA基因進(jìn)行了一定表達(dá),且在生物被膜不同成膜階段,接觸面上相關(guān)基因表達(dá)量發(fā)生變化,表明這些基因在大腸桿菌生物被膜形成過程中發(fā)揮了不同程度的調(diào)控作用。

    圖6 大腸桿菌生物被膜相關(guān)基因表達(dá)的變化Fig.6 Changes in the expression of biofilm related-genes of E.coli

    需要指出的是,在實(shí)際生產(chǎn)環(huán)境中,多種微生物共存、多菌種混合生物被膜是更常見的存在狀態(tài),混合生物被膜內(nèi)部不同菌種之間相互作用將導(dǎo)致基因表達(dá)水平發(fā)生變化,形成更加緊密、復(fù)雜的微系統(tǒng),生物被膜的結(jié)構(gòu)和特性更復(fù)雜,抗性可能更強(qiáng)[44-45]。因此混合生物被膜的形成和控制值得進(jìn)一步關(guān)注和重視。

    3 結(jié) 論

    從生豬屠宰線、豬胴體表面及生鮮豬肉表面均分離到大腸桿菌,證實(shí)了大腸桿菌在豬肉生產(chǎn)環(huán)節(jié)中普遍存在。大部分大腸桿菌可以形成生物被膜,雖然它們的被膜形成能力大多較弱,但生物被膜抗性強(qiáng),增加了食品安全隱患,所以在生豬屠宰、豬肉加工、銷售各環(huán)節(jié)應(yīng)加強(qiáng)衛(wèi)生管理,加大清潔消毒,減少細(xì)菌及其生物被膜造成的污染。本研究發(fā)現(xiàn),在大腸桿菌生物被膜形成過程中發(fā)生EPS的分泌,并受不同基因調(diào)控,這為大腸桿菌生物被膜的靶向控制提供了科學(xué)思路。本研究可為揭示肉類生產(chǎn)加工中大腸桿菌生物被膜的形成規(guī)律提供理論基礎(chǔ)。

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