冷凍掃描電子顯微鏡冷凍斷裂法在生物樣品觀察中的應用

黃克讓，王 珍，陳 蕾，崔鳳展，彭潔瑩，張 敏

（西北農林科技大學 實驗室安全與條件保障處 食品科學與工程學院，陜西 楊凌 712100）

冷凍掃描電子顯微鏡（Cryo-scanning electron microscope，Cryo-SEM）是在常規(guī)掃描電子顯微鏡上加裝冷凍樣品臺、傳輸及超低溫冷凍制樣系統(tǒng)的低溫樣品微觀形貌表征高端平臺[1]，該平臺無需對樣品進行干燥處理，可以直接觀察動植物[2-6]、乳液[7]、泡沫[8]等含水樣品. Cryo-SEM能夠規(guī)避空氣自然干燥法導致的嚴重皺縮和變形，同時可彌補常規(guī)處理方法的一些缺點，如臨界點干燥或冷凍干燥法中存在一定程度的皺縮失真、易溶成分丟失、制備過程慢、不能制作液體和半液體以及對電子束敏感的樣品等問題. 同時，采用先進的Cryo-SEM方法，樣品無需經過臨界點干燥等處理過程，直接冷凍觀察，是一個快速高效地解決方法，是國內外較為重視的一種電子顯微鏡技術發(fā)展方向[9]. 但由于儀器的價格昂貴，其應用還不廣泛. 且Cryo-SEM的制樣和操作過程對技術人員的試驗技術要求較高，需要其熟悉各類樣品的升華溫度、升華時間、冷態(tài)溫度、觀察電壓等試驗條件，能根據研究目的快速高效地選擇合適的操作條件，以捕捉快速變化的樣品表面信息. 目前尚未見到Cryo-SEM相關的制樣方法手冊和圖集，僅能從文獻中獲得少量信息[10]，Cryo-SEM冷凍斷裂法觀察生物樣品的相關試驗方法和圖集更少. 結合近5年Cryo-SEM試驗經驗，本文以液體[以乳清蛋白纖維（WPIF）為例]和植物（以沙漠梭梭成熟分支中上部同化枝為例）為試驗材料，對樣品進行冷凍斷裂，并通過掃描電子顯微鏡觀察，希望可以為相關研究者提供試驗技術參考.

1 Cryo-SEM及其冷凍斷裂法的基本原理

Cryo-SEM的關鍵是超低溫冷凍制樣和冷凍傳輸技術. 超低溫快速冷凍制樣技術包括超低溫樣品固定和低溫樣品處理，超低溫樣品固定是物理固定.水除了氣態(tài)、液態(tài)和固態(tài)外，還有玻璃態(tài)，水大約在166 K可以轉變成玻璃態(tài). 玻璃態(tài)是一種過冷的液態(tài)，即液態(tài)水在零下攝氏度不結冰保持液態(tài). 玻璃態(tài)的水和冰不一樣，它無固定形狀，不存在晶體結構. 與固態(tài)相比，它更像種極端粘滯、呈現(xiàn)固態(tài)的液體. 水的玻璃態(tài)密度與液態(tài)密度相同[11]. 超低溫快速冷凍制樣可使水呈玻璃態(tài)，避免冰晶的產生對樣品本身結構產生破壞，利用超低溫快速冷凍完成樣品的固態(tài)化，保持生物樣品在生物體原來狀態(tài)，相對于化學固定具有固定速度快、效果好、無需使用戊二醛及鋨酸等有毒化學試劑等優(yōu)點. 樣品處理在低溫樣品處理艙室進行冷凍斷裂、升華（刻蝕）、鍍膜處理. 冷凍傳輸系統(tǒng)是在真空狀態(tài)下將處理好的樣品轉移到電子顯微鏡樣品艙中的冷臺以供觀察.

冷凍斷裂法是低溫冷凍制樣關鍵技術，在處理艙室，采用冷刀切斷. 低溫斷裂是一種脆性斷裂，斷裂過程中基本上不發(fā)生塑彈性變形. 通過冷凍斷裂可以觀察樣品斷口和樣品內部結構信息，廣泛的應用于生物樣品和含水軟組織樣品，斷裂角度和部位是保證試驗是否成功的關鍵.

2 試驗部分

2. 1 儀器與試劑

Nano SEM-450掃描電子顯微鏡[美國賽默飛（FEI）公司]配PP3010T型號冷凍傳輸（英國Quorum 公司）；梭梭種子采于新疆古爾班通古特沙漠邊緣；冷凍保護劑生產廠家為Scigen Scientific Gardena；石墨烯生產廠家為Agar Scientific；乳清蛋白生產廠家為Southwest Cheese Company；中鏈甘油三酯MCT生產廠家為北京易秀博谷生物科技有限公司.

2. 2 Cryo-SEM的操作流程

Cryo-SEM的操作流程如圖1所示：（1）樣品采用冷凍保護劑和石墨烯按1∶1混合裝載于樣品托上. （2）將裝有樣品的樣品臺裝載到傳輸裝置上.（3）對固定樣品的預冷室抽真空，使液氮變過冷液氮（?210 ℃雪泥狀）. 將樣品插入?210 ℃的過冷液氮雪泥中快速冷凍固定，水轉化為玻璃態(tài)，避免形成冰晶. （4）繼續(xù)抽真空至再次出現(xiàn)雪泥，將樣品提至轉移倉，真空下轉移. （5）將樣品轉移安裝在掃描電子顯微鏡樣品艙端口上的制樣艙中的冷臺上，與制備腔室氣鎖對接. （6）根據需要進行冷凍斷裂、冷凍升華刻蝕和濺射鍍膜等處理. （7）在真空條件下，將樣品轉移至掃描電子顯微鏡樣品艙中的冷臺上.（8）進行超微結構觀察和拍照.

圖1 冷凍掃描電鏡工作流程Fig. 1 Workflow of Cryo-SEM

3 Cryo-SEM冷凍斷裂在生命科學研究中的應用

3. 1 Cryo-SEM觀察WPIF

3. 1. 1 乳清分離蛋白的制備

稱取4.0 g乳清分離蛋白（WPI）溶解于200 mL的超純水中，配制成質量濃度為20.0 mg/mL的蛋白分散液，磁力攪拌2 h使其充分溶解，在4 ℃、8 000 r/min下離心15 min去除不溶性物質. 上清液采用4.0 mol/L HCl調節(jié)pH為2.0，4 ℃下磁力攪拌水合過夜. 水合后的分散液置于85 ℃的水浴條件下孵育22 h（300 r/min的磁力攪拌）. 加熱結束后的樣品立即在冰水浴中冷卻至室溫，制備得到WPIF分散液，測定加熱后WPIF的初始pH值，4 ℃條件下儲存?zhèn)溆?

3. 1. 2 乳清分離蛋白纖維穩(wěn)定乳液的制備

將20.0 mg/mL的WPIF分散液（初始pH值為2.5）作為乳化劑相，中鏈甘油三酯（MCT）作為油相，添加體積分數為20%，使用高速剪切機于14 000 r/min下剪切3 min，制備得到乳液.

3. 1. 3 樣品處理及試驗條件

將冷凍后樣品進行冷凍斷裂和未冷凍斷裂對比，具體采用的試驗條件如表1所列.

表1 乳清蛋白纖維樣品冷凍斷裂和未冷凍斷裂的試驗條件Table 1 Experimental conditions of frozen and unfrozen fracture of whey protein fiber samples

3. 1. 4 試驗結果

由圖2可見，冷凍斷裂后能看到乳液內部截面結構，包括連續(xù)相和液滴的表面. 未斷裂只能看到冷凍樣品的平整外表面，無法觀察內部結構. 如圖2（a）所示，只能看到油相被包裹在內部，纖維堆積無法觀察到. 圖2（b）中乳液液滴內部的油相（中鏈甘油三酯）表面形貌清楚可見，可以觀測到乳液液滴內部的油相（中鏈甘油三酯）排列結構，油滴形貌及大小. 圖2（c）是連續(xù)相中的乳清分離蛋白纖維堆積而成的片層結構，可以觀察到乳清分離蛋白纖維的堆積方式和堆積形狀. 通過觀察乳清分離蛋白纖維內部的超微結構，可以為科研工作者提供改變其內部結構的依據，進而改變其性質，并將其作為乳化劑應用于食品膠體[12]領域.

圖2 冷凍斷裂前后乳清分離蛋白乳液內部結構（a）未進行冷凍斷裂（13 000×，Bar=10 μm），（b）冷凍斷裂處理（2 000×，Bar=50 μm），（c）冷凍斷裂（12 000×，Bar=10 μm）Fig. 2 Internal structure of whey protein isolate emulsion before and after freezing fracture(a) before freezing fracture (13 000×, Bar=10 μm), (b) performing freeze fracture (2 000×, Bar=50 μm),(c) after freezing fracture (12 000×，Bar=10 μm)

3. 2 Cryo-SEM觀察植物樣品

3. 2. 1 材料制備

選取飽滿、大小均勻的梭梭種子播種于花盆中，以清水沖洗后的干凈河沙為培養(yǎng)基質，于科研溫室培養(yǎng)（14 h自然光照/10 h黑暗，晝夜溫度為28 ℃/20 ℃，相對濕度為45%）. 待子葉出土后，每兩天澆灌1/2 Hoagland營養(yǎng)液（pH為6.6~6.8），子葉伸長生長一周后采集樣本. 初生真葉采于剛發(fā)生兩片子葉之間的同化枝（0.5 cm左右，10~15 d），整株成熟期采集生長3個月大的梭梭幼苗，取成熟分支中上部同化枝為待分析樣本.

3. 2. 2 樣品處理及試驗條件

將冷凍后樣品進行冷凍斷裂和未冷凍斷裂對比，具體采用的試驗條件如表2所列.

表2 梭梭成熟分支中上部同化枝樣品冷凍斷裂和未冷凍斷裂的試驗條件Table 2 Experimental conditions of frozen and unfrozen fracture of middle and upper assimilation branches of mature branches of Haloxylon Ammodendron

3. 2. 3 試驗結果

圖3（a）是鋒利刀片割斷后冷凍放大200倍的圖像，可以看出使用鋒利的刀片割斷存在機械損傷，斷裂處細胞皺縮，細胞破損細胞液流失. 圖3（b）為冷凍斷裂后放大500倍觀察到的Cryo-SEM圖像，可以看出冷凍斷裂屬于冷凍脆斷，斷裂后組織和細胞飽滿，除冷刀接觸的部位有小部分機械損傷外，其它部分不會受損. 圖3（c）為冷凍斷裂后13 000倍放大下植物細胞內部亞細胞器圖像，可以清晰觀察到細胞內部的葉綠體及葉綠體內的內囊體等超微結構，之前都是通過透射電子顯微鏡才能觀察. 圖3（d）為冷凍斷裂后15 000倍放大下的植物細胞外形態(tài)，可以觀察到細胞間的細毛組織栩栩如生. 因此冷凍斷裂法可以為科研工作者在觀察及研究植物組織細胞間及細胞內超微結構方面提供幫助.

圖3 冷凍斷裂前后梭梭成熟分支中上部同化枝圖像（a）鋒利刀片割斷后梭梭真葉（200×，Bar=500 μm），（b）冷凍斷裂后梭梭真葉（500×，Bar=300 μm），（c）冷凍斷裂后梭梭真葉內部亞細胞器（13 000×，Bar=10 μm），（d）冷凍斷裂后冷梭梭子葉（15 000×，Bar=10 μm）Fig. 3 Images of middle and upper assimilation branches of mature branches of Haloxylon Ammodendron before and after freezing fracture(a) euphylla of Haloxylon Ammodendron after cutting by sharp blade (200×, Bar=500 μm), (b) euphylla of Haloxylon Ammodendron after freezing fracture (500×, Bar=300 μm), (c) internal subcellular organelles of euphylla of Haloxylon Ammodendron after freezing fracture (13 000×，Bar=10 μm), (d) cotyledon of Haloxylon Ammodendron after freezing fracture (15 000×，Bar=10 μm)

4 結論

Cryo-SEM可以直接觀察含水或其它液體成分樣品，是研究高度含水生物和材料樣品的強有力工具. 能否高效獲得高質量的Cryo-SEM圖像，取決于合理的樣品制樣方式和制樣條件[13-15]. 冷凍斷裂法主要應用于斷口和樣品內部結構觀察. 相比未斷裂樣品，液體樣品斷裂時，升華（刻蝕）溫度較低，升華時間較短，一般升華溫度為?80~ ?100 ℃，升華時間在1~20 min之間. 若樣品含水量較高，溫度應適當升高，時間也應適當增加. 植物樣品斷裂時，升華溫度均為?100 ℃，升華時間為10 min.

Cryo-SEM的樣品制備快速簡單且可以直接觀察含水樣品，是研究高度含水生物材料的強有力工具. 能夠直接觀察液體和半液體以及對電子束敏感的樣品，彌補生物樣品在空氣中因自然干燥法導致的嚴重皺縮和變形的缺點. 常規(guī)處理方法（如臨界點干燥或冷凍干燥法）仍存在一定程度的皺縮失真、易溶成分丟失、制備過程慢等缺點. 圖4（a）（c）是臨界點干燥處理的植物葉片和菌絲，觀察發(fā)現(xiàn)樣品有嚴重的皺縮失真. 圖4（b）（d）是Cryo-SEM 觀察的植物葉片和菌絲, 觀察發(fā)現(xiàn)與圖4（a）（c）相比，其形態(tài)飽滿、無塌陷皺縮，表面自然狀態(tài)形貌清晰可見.

圖4 生物樣品不同制樣方法的SEM圖像（a）葉片臨界點干燥（800×，Bar=200 μm），（b）葉片Cryo-SEM（500×，Bar=300 μm），（c）菌絲臨界點干燥（6 000×，Bar=20 μm），（d）菌絲Cryo-SEM（6 000×，Bar=20 μm）Fig. 4 SEM images of biological samples using different preparation methods(a) critical point dried leaves (800×, Bar=200 μm), (b) Cryo-SEM of leaves (500×, Bar=300 μm), (c) critical point dried mycelia (6 000×，Bar=20 μm), (d) Cryo-SEM of mycelia (6 000×, Bar=20 μm)

Cryo-SEM 作為觀察微觀世界的“科學之眼”，是生命科學研究重要儀器設備之一. 冷凍掃描實驗技術是生命科學研究的關鍵技術，結合 Cryo-SEM冷凍斷裂法進行生物類樣品表面形貌觀察，既能觀察到表面結構信息，又可觀察樣品內部結構信息.例如，冷凍斷裂可觀察樣品內部超微結構及動植物組織的亞細胞結構，具有能在高真空狀態(tài)下觀察含水樣品、分辨率高、制樣簡單快速、可對樣品進行斷裂刻蝕等優(yōu)點，是生命科學研究中的有力工具.本文通過對乳清蛋白纖維（WPIF）液體樣品、植物樣品觀察以及臨界干燥和冷凍樣品處理比較，為科研工作者在冷凍掃描電子顯微鏡研究中提供技術參考.