乳酸菌發(fā)酵對脫溶菌酶蛋清凝膠性質(zhì)與風(fēng)味物質(zhì)的影響

陳杰，常翠華，李俊華，蘇宇杰，顧璐萍，楊嚴俊*

1(食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室(江南大學(xué))，江蘇 無錫，214122)2(國家功能食品工程技術(shù)研究中心(江南大學(xué))，江蘇 無錫，214122)3(江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫，214122)

蛋清(egg white, EW)營養(yǎng)價值豐富，富含多種人體必需氨基酸，蛋清中蛋白質(zhì)占比約11%(質(zhì)量分數(shù))，主要蛋白成分有卵白蛋白(ovalbumin, OVA, 54%)、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白(ovotransferrin, OVT, 12%～13%)、卵類黏蛋白(ovomucoid, OVM, 11%)和溶菌酶(lysozyme, LYS, 3.4%～3.5%)(質(zhì)量分數(shù))[1-2]。LYS是一種堿性球蛋白，其等電點pI=10.7，可以通過催化N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡糖胺之間的β-1,4-糖甘鍵水解，進而破壞革蘭氏陽性菌細胞壁肽聚糖結(jié)構(gòu)[3]。工業(yè)化分離提取溶菌酶已經(jīng)在國內(nèi)蛋品企業(yè)實現(xiàn)，然而針對脫溶菌酶蛋清(lysozyme-free egg white, LFEW)的高附加值應(yīng)用卻鮮有研究。

雞蛋干是以全蛋液或蛋白液為原料，利用蛋白質(zhì)的熱凝固性，經(jīng)過加熱成型的一種新型蛋制品，其外觀與豆腐干類似，口感細膩，發(fā)展前景廣闊[4-5]。在高溫滅菌過程中，蛋清中的葡萄糖會與蛋白質(zhì)發(fā)生美拉德反應(yīng)導(dǎo)致雞蛋干的褐變并且蛋腥味較重。為了掩蓋腥味并豐富口味，傳統(tǒng)雞蛋干多經(jīng)鹵制而成深褐色，但這破壞了雞蛋蛋白原有的潔白外觀和特有的蛋香味。如何實現(xiàn)對LFEW脫糖脫腥成為本研究的重點。有研究表明，酵母發(fā)酵蛋液脫腥的效果較好[6-7]，但實際上酵母發(fā)酵后會產(chǎn)生更加不受歡迎的酵母味，完全喪失了雞蛋原有的香氣，而針對乳酸菌發(fā)酵對蛋清脫腥的研究卻是少有?？紤]到脫去溶菌酶可以減少對乳酸菌的生長抑制，本研究利用乳酸菌發(fā)酵實現(xiàn)LFEW的脫糖和脫腥，并擬開發(fā)一款具有良好保水性和質(zhì)構(gòu)特性、潔白Q彈、又具有獨特蛋香風(fēng)味的蛋白干產(chǎn)品。這項研究也可為工業(yè)化LFEW的開發(fā)利用提供一種新方向，拓寬了蛋制品深加工產(chǎn)業(yè)鏈。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原料：新鮮雞蛋，當?shù)爻胁少彙?/p>

試劑：Xanterra離子交換樹脂，Xanterra科技有限公司；A051-1-1溶菌酶測定試劑盒，南京建成賽浩科技有限公司；植物乳桿菌LP90、保加利亞乳桿菌LB42、嗜熱鏈球菌ST81，微康益生菌(蘇州)股份有限公司；安琪高活性干酵母，安琪酵母股份有限公司；過氧化物酶、葡萄糖氧化酶，Sigma-Aldrich公司；無水葡萄糖、硫酸銅、硫酸鋅、氫氧化鈉、亞鐵氰化鉀等，國藥集團。

1.2 儀器與設(shè)備

Heracles Ⅱ快速氣相色譜電子鼻，法國Alpha MOS S.A有限公司；SCIONSQ-456-GC氣質(zhì)聯(lián)用儀，美國布魯克公司；TA.XTPlus物性分析儀，英國SMS公司；UltraScan Pro1166高精度分光測色儀，美國Hunterlab公司；UH5300分光光度計，日本日立公司；DZ-260C真空包裝機，安徽逸飛智能包裝機械有限公司；ZQZY-78AN振蕩培養(yǎng)箱，上海知楚儀器有限公司；GZX-9146MBE電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海博訊實業(yè)有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 蛋白干樣品的制備工藝

研究思路如圖1所示[5,8]。

圖1 工藝流程圖Fig.1 Process flow diagram

1.3.1.1 脫溶菌酶蛋清的制備

取新鮮雞蛋，分離出蛋清，采用T25D S25高速均質(zhì)機在7 000 r/min下處理2 min，使用50 g/L食品級檸檬酸溶液調(diào)節(jié)pH至7.0，通過200目篩網(wǎng)除去泡沫與雜質(zhì)，加入25%(質(zhì)量分數(shù))濕樹脂，攪拌吸附90 min(pH 7.0，32 ℃，210 r/min)，再通過200目篩網(wǎng)除去樹脂及其他雜質(zhì)，收集LFEW備用，測得總固形物含量為12.98%(EW為14.08%)，蛋白質(zhì)量濃度為113.5 mg/mL(EW為124.74 mg/mL)及溶菌酶脫除率為96.62%。

1.3.1.2 乳酸菌發(fā)酵脫溶菌酶蛋清

將脫去溶菌酶后的蛋清液分別添加0.1%(質(zhì)量分數(shù))安琪酵母(yeast, YE)，3×108、6×108、9×108CFU/mL的植物乳桿菌LP90(Lactiplantibacillusplantarum, LP)、嗜熱鏈球菌ST81(Streptococcusthermophilus, ST)、保加利亞乳桿菌LB42(Lactobacillusbulgaricus, LB)，放入振蕩培養(yǎng)箱發(fā)酵6 h(設(shè)置參數(shù)37 ℃，120 r/min)，得到LFEW發(fā)酵液LFEW-YE、LFEW-LP、LFEW-ST、LFEW-LB。分別于2、4、6 h取樣測定pH，并參考GB/T 16285—2008《食品中葡萄糖的測定 酶-比色法和酶-電極法》測定樣品中葡萄糖含量，計算脫糖率。以EW為對照。

1.3.1.3 蒸煮制膠、烘干

使用食品級檸檬酸和碳酸鈉將發(fā)酵蛋清液調(diào)節(jié)pH至9.0(與EW保持一致)，各取30 mL裝入50 mL平底離心管內(nèi)，于90 ℃水浴鍋內(nèi)加熱蒸煮20 min，蒸煮結(jié)束立刻使用冰水冷卻降溫，并放入4 ℃冰箱內(nèi)冷藏過夜。次日取出，脫模，切塊為10 mm高圓柱形，放入60 ℃烘箱內(nèi)20 min烘干表面水分，用于測定凝膠質(zhì)構(gòu)。并以EW與LFEW作為對照。

1.3.1.4 真空包裝、滅菌

將烘干后的蛋白干使用真空包裝機進行抽真空包裝，并使用高壓滅菌鍋滅菌處理。真空包裝參數(shù)：抽真空20 s，封口時間1.5 s，冷卻時間3.5 s。滅菌參數(shù)：121 ℃，15 min。滅菌后的蛋白凝膠用于測定色差。

1.3.2 凝膠質(zhì)構(gòu)測定

使用TA.XTPlus物性分析儀測定凝膠質(zhì)構(gòu)。凝膠樣品是高度為10 mm，直徑為25 mm的圓柱體，采用P/36R平底型探頭。使用Texture Expert軟件版本1.22由力-時間變形曲線計算硬度、彈性、膠黏性、咀嚼性和回復(fù)力。測定參數(shù)：質(zhì)地剖面分析(texture profile analysis, TPA)模式，測試前速5 mm/s；測試速度1 mm/s；測試后速5 mm/s；壓縮模式：樣品形變量50%，觸發(fā)點負載5 g[9]。每個樣品做平行4組。

1.3.3 保水性(water holding capacity, WHC)測定

根據(jù)LI等[10]描述的方法測定樣品的凝膠保水性，并稍加修改。將制成凝膠樣品切塊，稱取10 g左右樣品，擦干表面水分，于8 000 r/min離心20 min，倒出離心管內(nèi)上清液水分，擦干樣品再次稱重，WHC的計算如公式(1)所示：

(1)

式中：WHC，樣品保水性，%；m0，樣品離心前質(zhì)量，g；m1，樣品離心后質(zhì)量，g。

1.3.4 色差測定

將真空包裝滅菌后的蛋白干樣品用透明蒸煮袋分裝，以透明蒸煮袋為空白對照，使用高精度分光測色儀測定樣品的色度。記錄L*(亮度)，a*(紅/綠)和b*(黃/藍)值。并計算凝膠的白度指數(shù)(whiteness index, WI)，WI的計算[11]如公式(2)所示：

(2)

1.3.5 腥味值感官評定

經(jīng)脫腥處理后的蛋白干，由10名受過訓(xùn)練的感官評定員進行品評，分別給樣品的腥味打分，計分原則：滿分5分，以去蒸餾水作為參照(分值為0分)，分值越大，則表示腥味越重或異味更重。最后，取平均值作為每個樣品的腥味值。感觀評分標準如表1所示。

表1 蛋白干腥味值感官評分標準Table 1 The Sensory scoring standard of egg white gels smell value

1.3.6 快速氣相色譜電子鼻

稱取3.00 g蛋白干樣品，加入2 mL去離子水搗碎，裝入15 mL頂空瓶中，采用Heracles Ⅱ 型快速氣相色譜電子鼻進行測定，每個樣品做平行4組。參考陳正[12]的方法，稍作修改。儀器參數(shù)：進樣量5 000 μL，采用色譜柱：DB-5、DB-1701，2個FID檢測器溫度均設(shè)為260 ℃。頂空萃取溫度60 ℃；注射器溫度200 ℃；捕獲溫度50 ℃。柱溫50 ℃，先以1 ℃/s升至80 ℃，再以2 ℃/s升至250 ℃，保持60 s，數(shù)據(jù)采集時間177 s。采用快速氣相電子鼻自帶的AlphaSoft V14.2軟件，將篩選出的區(qū)分能力強(>0.90)的色譜峰作為傳感器進行主成分分析(principal component analysis, PCA)、識別因子分析(discriminate factorial analysis, DFA)。

1.3.7 氣質(zhì)聯(lián)用(gas chromatograohy-mass spectrometry, GC-MS)條件

將蛋清凝膠與飽和鹽水按照1∶1的質(zhì)量比混合，使用高速剪切機10 000 r/min剪切2 min，準確稱取4.5 g裝入15 mL頂空氣相瓶內(nèi)。

GC條件[12-13]：使用TR-FFAP(30.0 m×0.25 mm×0.25 μm)色譜柱；進樣口：柱箱溫度50.0 ℃，進樣口溫度250 ℃；進樣方式：不分流；流量控制模式：線速度；壓力33.4 kPa，載氣(He)，流速0.8 mL/min；升溫程序：從40 ℃開始，以5 ℃/min升溫至140 ℃，保持3 min，再以10 ℃/min升溫至230 ℃，保持6 min。MS條件：電子轟擊離子源(electron impact source, EI)，EI電子能量70 eV，發(fā)射電流1 mA，離子源溫度210 ℃，傳輸線溫度250 ℃，無溶劑延遲，質(zhì)量掃描范圍33～450m/z。

1.3.8 數(shù)據(jù)分析

實驗數(shù)據(jù)采用平均值±標準差來表示，每組數(shù)據(jù)測定至少采用3個平行，所有數(shù)據(jù)使用Excel 2021進行數(shù)據(jù)處理，使用Origin 2018進行作圖分析，使用IBM SPSS Statistics 19進行統(tǒng)計學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同乳酸菌對發(fā)酵脫糖率的影響

由圖2-A可知，在相同乳酸菌添加量下，LFEW發(fā)酵效果比起未脫溶菌酶的EW脫糖率有顯著提高，反應(yīng)后pH值相較更低。這是由于蛋清溶菌酶作為一種糖苷水解酶，可以破壞肽聚糖中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡萄糖胺之間的β-1,4-糖苷鍵[3,14-15]，進而抑制作為革蘭氏陽性菌的乳酸菌的生長繁殖，而通過樹脂吸附脫去溶菌酶的蛋清液則可以不受溶菌酶的抑制作用，大大提高了發(fā)酵效率。圖2-B通過對添加量，發(fā)酵時間的篩選，為保證脫糖率>90%，最終優(yōu)化發(fā)酵條件為采用LFEW為原料，LP、ST、LB的添加量為6×108CFU/mL，37 ℃，發(fā)酵6 h，發(fā)酵的脫糖率均達到90%以上。

A-EW與LFEW；B-不同乳酸菌和不同發(fā)酵時間圖2 不同發(fā)酵條件對蛋清脫糖率及pH的影響Fig.2 Effects of different fermentation conditions on glucose removal rate and pH of egg white

2.2 不同乳酸菌發(fā)酵對脫溶菌酶蛋清凝膠性質(zhì)影響

2.2.1 凝膠質(zhì)構(gòu)與保水性分析

由表2可知，在pH 9.0，將經(jīng)過樹脂吸附與不同乳酸菌發(fā)酵的蛋清制成蛋白干，具有良好的彈性(>0.90)和保水性(>90%)，這是由于蛋清蛋白質(zhì)多為酸性蛋白，在堿性條件下，蛋白質(zhì)溶解性較好，且蛋白質(zhì)之間靜電斥力增加，蛋白質(zhì)與水之間的相互作用增加。經(jīng)過樹脂吸附處理后的LFEW凝膠硬度有顯著降低，而彈性與恢復(fù)力都有顯著提高，分析其原因可能是樹脂吸附處理降低了蛋清液的總蛋白濃度，也有研究說蛋清中LYS及LYS-OVA的凝膠硬度最高[1,16]，所以脫去蛋清中溶菌酶導(dǎo)致凝膠硬度的降低，但由于溶菌酶為蛋清中少有的堿性蛋白，會與蛋清中其他酸性蛋白結(jié)合，脫去溶菌酶減少了LYS-OVA與LYS-OVT聚合物的生成，提高了蛋清液的穩(wěn)定性[17]，蛋白質(zhì)與水之間的作用力增強，促進蛋清蛋白質(zhì)與水之間形成致密的三維凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，進而提高了凝膠的彈性和恢復(fù)力。經(jīng)過發(fā)酵處理后，凝膠的硬度、膠黏性、咀嚼性與恢復(fù)力都有顯著降低，但彈性增加。這可能是因為在發(fā)酵過程中產(chǎn)生一系列蛋白水解酶可以水解蛋白質(zhì)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)展開，疏水基團暴露，蛋白疏水性增加，導(dǎo)致蛋白凝膠性質(zhì)降低[18-19]。也有研究證明發(fā)酵脫糖后的蛋清體系變得稀薄且親水物質(zhì)減少，顯著降低了凝膠強度[20]。

表2 蛋白干質(zhì)構(gòu)數(shù)據(jù)表Table 2 Texture data of egg white gels

2.2.2 外觀色差分析

凝膠產(chǎn)品的外觀和顏色是一個重要的感官屬性，可能會影響消費者的接受度[21]。觀察高壓蒸汽滅菌后蛋白干外觀，由圖3可知，經(jīng)樹脂吸附脫溶菌酶與發(fā)酵脫糖處理的蛋清凝膠外觀更加潔白，這是因為乳酸菌發(fā)酵消耗了蛋清中的葡萄糖，避免了葡萄糖與蛋白質(zhì)之間發(fā)生美拉德反應(yīng)，進而解決了凝膠褐變問題。通過表3色差結(jié)果可知，經(jīng)過發(fā)酵處理后制得的蛋白干的L*值顯著提高，a*值與b*值顯著降低，WI顯著提高，表明發(fā)酵脫糖會使凝膠亮度增加、色澤變得更加潔白。不同發(fā)酵劑(YE、LP、ST、LB)比較，LP發(fā)酵后蛋白凝膠外觀最為潔白。

表3 不同加工方式對蛋清凝膠色差影響Table 3 Effect of different processing methods on the color of egg white gels

2.3 不同乳酸菌發(fā)酵對脫溶菌酶蛋白干風(fēng)味的影響

2.3.1 感官評定與電子鼻結(jié)果分析

由表4蛋白干腥味值感官評定結(jié)果可知，LFEW-YE制得蛋白干有嚴重酵母味，風(fēng)味上最差；LFEW-ST蛋白干產(chǎn)生不受歡迎異味，樹脂吸附(LFEW)對蛋白干風(fēng)味無顯著差異，LFEW-LB和LFEW-LP制得蛋白干感官最佳，其中LFEW-LB蛋白干具有類似玉米糊風(fēng)味，只有LP發(fā)酵脫腥效果好又不產(chǎn)生其他突出氣味。由PCA圖(圖4-A)可知，第一主成分和第二主成分的貢獻率分別為97.499%和1.518%，累積貢獻率為99.017%(遠大于90%)，2個主成分可以用來代表樣品的整體信息。判別指數(shù)主要用于評定不同組樣品數(shù)據(jù)點間的區(qū)分程度，最大值為100，其值越大表明區(qū)分效果越好[22]。PCA圖中判別指數(shù)達到63，樣品整體氣味輪廓均無重疊，表明經(jīng)不同發(fā)酵條件處理后區(qū)分度較好，其中LP發(fā)酵后蛋白干相較EW距離最遠，區(qū)分最為明顯。DFA是一種用于構(gòu)建模型并識別未知樣品所屬類別的方法，可以減少組間差異[23]。圖4-B中DF1和DF2的貢獻率分別為54.924%和38.483%，累計貢獻率達到93.507%(>90%)，經(jīng)過不同乳酸菌發(fā)酵處理后的蛋白干區(qū)分度十分顯著，這說明乳酸菌發(fā)酵可以顯著改變蛋白干風(fēng)味物質(zhì)。

2.3.2 GC-MS結(jié)果分析

為了進一步分析發(fā)酵對蛋白干風(fēng)味物質(zhì)的變化，通過GC-MS更加準確地分析了揮發(fā)性物質(zhì)的含量變化。由圖5中GC圖譜可知，經(jīng)過樹脂吸附與發(fā)酵處理后的蛋白干揮發(fā)性物質(zhì)發(fā)生明顯的變化。通過MS鑒定出230多種揮發(fā)性風(fēng)味化合物，選取相對面積占比>0.5%，相似度>800的物質(zhì)匯總分析，結(jié)果保留65種主要揮發(fā)性物質(zhì)(附表1，https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1802.TS.20220419.1141.012.html)，其中以烴類、醇類、醛類、酮類、芳香族物質(zhì)較多。原蛋清蛋白干檢測出揮發(fā)性物質(zhì)以四甲基苯、壬醛、萘、(+)-檸檬烯、月桂醇為主。四甲基苯具有膩甜與腐臭氣味，萘具有柏油氣味，它們可能是造成蛋白干腥味的主要物質(zhì)；壬醛具有柑橘、玫瑰的清新香氣，檸檬烯具有薄荷與三葉草香氣，月桂醇具有肥皂、紫羅蘭花香。經(jīng)酵母菌發(fā)酵后主要揮發(fā)物質(zhì)變?yōu)楸揭掖迹鄬空急雀哌_67.85%，苯乙醇雖被報道具有玫瑰花氣味[12]，但因為苯乙醇氣味閾值較低，當含量較高時會導(dǎo)致酵母發(fā)酵后產(chǎn)生明顯的刺鼻酵母味；經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后蛋白干的揮發(fā)性物質(zhì)中醇類、酮類與醛類物質(zhì)普遍增加，芳香族化合物顯著減少。

表4 發(fā)酵蛋白干感官評價結(jié)果Table 4 Sensory evaluation of egg white gels

由表5的GC-MS結(jié)果可知，不同乳酸菌發(fā)酵所得蛋白干的揮發(fā)性物質(zhì)也有較大差異。其中LP發(fā)酵蛋白干揮發(fā)性主物質(zhì)變?yōu)楸郊兹?、壬醛和辛烷?相對含量>5%)，ST發(fā)酵后蛋白干揮發(fā)性主物質(zhì)為3-羥基-2-丁酮、α-氟-(對甲基)查爾酮、(-)-O-乙酰-L-蘋果酸酐、(+)-檸檬烯和苯甲醛，LB發(fā)酵后蛋白干揮發(fā)性主物質(zhì)為α-氟-(對甲基)查爾酮、苯甲醛、(+)-檸檬烯、2-庚酮和3-羥基-2-丁酮。乳酸菌發(fā)酵生成了更多的良好的揮發(fā)性物質(zhì)，明顯降低了四甲基苯與萘這類芳香族物質(zhì)含量。結(jié)合感官評定與電子鼻結(jié)果，可知植物乳桿菌發(fā)酵脫腥效果最好，這可能是由于LP發(fā)酵后蛋白干的芳香族(四甲基苯、萘)顯著減少，而醇類與醛類物質(zhì)顯著增加，其中芳香族物質(zhì)總含量下降了24.37%，醇類物質(zhì)總含量增加了10.29%，醛類物質(zhì)增加了10.89%，明顯增加的揮發(fā)性物質(zhì)中，辛烷醛和苯甲醛分別具有檸檬與焦糖氣味。這些醛類物質(zhì)很可能是由蛋清蛋白的水解以及氨基酸的Strecker降解所產(chǎn)生[12]。

A-PCA圖；B-DFA圖圖4 不同發(fā)酵條件蛋白干電子鼻主成分分析圖Fig.4 Principal component analysis of electronic nose of egg white gels at different fermentation conditions

表5 蛋白干GC-MS檢測結(jié)果(主要揮發(fā)性物質(zhì))Table 5 Results of GC-MS test of egg white gels (major volatile components)

A-EW;B-LFEW;C-YE;D-LP;E-ST;F-LB圖5 不同發(fā)酵條件蛋白干GC-MS圖Fig.5 GC-MS Finger pattern of egg white gels at different fermentation conditions

3 結(jié)論

本研究以脫溶菌酶蛋清為原料進行乳酸菌發(fā)酵脫糖，脫糖率可達90%以上。對比不同發(fā)酵劑發(fā)酵處理制備的蛋白凝膠的質(zhì)構(gòu)、外觀和風(fēng)味特征，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過樹脂吸附與發(fā)酵處理會使凝膠硬度、膠黏性、咀嚼性顯著下降，而凝膠的彈性與恢復(fù)力顯著增加。LFEW經(jīng)LP發(fā)酵(LP90添加量6×108CFU/mL，pH 7.0，37 ℃，120 r/min，6 h)后制得的蛋白干外觀最為潔白，凝膠硬度、彈性、保水性都較佳，經(jīng)感官評定和電子鼻分析，發(fā)現(xiàn)其脫腥效果也最佳。經(jīng)過GC-MS鑒定，發(fā)現(xiàn)LP發(fā)酵后蛋白干的芳香族物質(zhì)減少24.37%，而醇類與醛類物質(zhì)分別增加10.29%和10.89%，其主要揮發(fā)性物質(zhì)為苯甲醛、壬醛和辛烷醛(相對含量>5%)，它們可能為雞蛋白提供了獨特香氣風(fēng)味。綜上，利用植物乳桿菌發(fā)酵處理的脫溶菌酶蛋清液，可用于開發(fā)一種低糖無腥、潔白Q彈的美味蛋白干產(chǎn)品。