釀酒酵母過表達(dá)Ehrlich途徑基因高效合成色醇

孫井震，何玙冰，楊衛(wèi)華，楊艷坤，劉秀霞，劉春立，詹錦鈴，李業(yè)*，白仲虎*

1(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫，214122)2(江南大學(xué),糧食發(fā)酵與食品生物制造國家工程研究中心，江蘇 無錫，214122) 3(長(zhǎng)興制藥股份有限公司，浙江 長(zhǎng)興，313100)

色氨酸(tryptophan ，Trp)是人體的必需氨基酸之一,參與機(jī)體蛋白質(zhì)的合成和代謝調(diào)節(jié),它是煙酸、5-羥色胺、褪黑激素等生物活性物質(zhì)的前體物,影響蛋白質(zhì)、糖類和脂肪等營養(yǎng)物質(zhì)的代謝。色醇(indole-3-ethanol，IET)和色醇類似物是合成幾個(gè)重要的藥用活性分子的常見中間體，包括以色胺為基礎(chǔ)的藥物，例如曲普坦家族的抗偏頭痛藥物的某些成員(舒馬曲坦、利扎曲坦和佐米曲坦)，2α-1選擇性腎上腺素受體拮抗劑吲哚，或基于吡喃吲哚結(jié)構(gòu)的化合物，如依托度酸。依托度酸是以IET為主要中間體合成的一種有效的抗炎鎮(zhèn)痛化合物[1]。同時(shí)，IET也是合成抗腎上腺素能藥物吲哚胺的關(guān)鍵中間體[2]。

目前，工業(yè)上IET的生產(chǎn)全部是化學(xué)合成，方法是連續(xù)流合成工藝[3]。以鹽酸苯肼(phenyl hydrazine hydrochloride, PHH)和2,3-二氫呋喃(2,3-dihydrofuran, DHF)為原料，采用Fischer吲哚合成路線，在管式反應(yīng)器中實(shí)現(xiàn)了不同溫度、不同流速下IET的連續(xù)流合成。通過其他方式進(jìn)行過改進(jìn)，比如，通過微波進(jìn)行反應(yīng)過程的控制，但是反應(yīng)副產(chǎn)物辛諾啉衍生物和多吲哚等仍然無法解決，這無疑會(huì)使成本增加。IET被發(fā)現(xiàn)是因?yàn)樗轻劸粕a(chǎn)的副產(chǎn)物[4]，因此，IET的生物發(fā)生途徑就存在于釀酒酵母中，這便給了IET生物合成的可能。而且酵母中的IET來自Ehrlich途徑[5]。幾種氨基酸(支鏈氨基酸和芳香族氨基酸以及蛋氨酸)可以通過Ehrlich途徑被同化并轉(zhuǎn)化為高級(jí)雜醇。該路徑包括3個(gè)反應(yīng)：(1)氨基酸的轉(zhuǎn)氨作用，Aro8p和Aro9p最初分別被表征為芳香族氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶I和Ⅱ，它們?cè)贓hrlich途徑中充當(dāng)廣泛底物特異性的氨基酸轉(zhuǎn)氨酶，負(fù)責(zé)幾乎所有相關(guān)氨基酸涉及的轉(zhuǎn)氨基作用，并形成對(duì)應(yīng)的α-酮酸；(2)在前一個(gè)反應(yīng)中形成的α-酮酸的脫羧作用，這個(gè)不可逆的步驟歸因于酵母體內(nèi)的丙酮酸脫羧酶，這一步驟之后使對(duì)應(yīng)的α-酮酸轉(zhuǎn)變?yōu)閷?duì)應(yīng)的雜醛；(3)Ehrlich途徑的最后一步會(huì)產(chǎn)生分支，使產(chǎn)生的雜醛還原成酸或者氧化為醇[6]。

IET的價(jià)格高達(dá)22 000美元/kg，而且是一種具有廣泛應(yīng)用前景的化合物，作為重要的醫(yī)藥和化工合成的中間體，它的需求量只增不減，擁有廣闊的市場(chǎng)前景。但是目前的合成方法存在2個(gè)明顯的缺點(diǎn)，一是化學(xué)合成并不綠色環(huán)保，可能對(duì)環(huán)境和生物造成不可逆的損害；另一個(gè)是化學(xué)合成過程中的副產(chǎn)物過多，這樣會(huì)使后期分離得到的產(chǎn)物純度并不高，而且純化過程將提高成本。使用釀酒酵母細(xì)胞工廠來生產(chǎn)IET不僅綠色環(huán)保，而且由于釀酒酵母易于培養(yǎng)、生長(zhǎng)迅速等特點(diǎn)[7]，可以使生產(chǎn)的成本大大降低，還得益于釀酒酵母基因的可改造性，可以使用其生產(chǎn)的IET直接在細(xì)胞內(nèi)合成更多更有價(jià)值的化合物。Trp合成途徑本來就存在于釀酒酵母中，可以通過探索相關(guān)的基因來增強(qiáng)Trp到IET的生物轉(zhuǎn)化。

本研究對(duì)涉及Trp代謝到IET的代謝途徑中相關(guān)的13個(gè)基因(圖1)進(jìn)行了分步驟的過表達(dá)，選定Trp到IET的相關(guān)基因進(jìn)行組合探索出了最適合的利于IET生物生產(chǎn)的基因組合。

1 材料與方法

1.1 菌株構(gòu)建和試劑

本研究所使用的所有質(zhì)粒的構(gòu)建和保存均使用大腸桿菌EscherichiacoliJM109。Ex Taq?和 PrimeSTAR?Max DNA 聚合酶購買于TaKaRa。用于質(zhì)粒同源重組的試劑盒MultiF Seamless Assembly Mix購買于武漢愛博泰克生物科技有限公司。限制性核酸內(nèi)切酶Esp3I (BsmBI)和Eco31I (BsaI)購買于Thermo。T7 DNA連接酶和T4 DNA 連接酶Buffer購買于安諾倫(北京)生物科技有限公司。所有引物(表1)均在蘇州金唯智生物科技有限公司合成。除非特殊說明所用化學(xué)品，包括各種標(biāo)準(zhǔn)品，均購買于上海阿達(dá)瑪斯試劑有限公司。

1.2 菌種培養(yǎng)

用于釀酒酵母Saccharomycescerevisiae菌株BY4741制備感受態(tài)細(xì)胞的培養(yǎng)基(YPD)包括10 g/L酵母提取物、20 g/L蛋白胨和20 g/L 葡萄糖。為了更好的研究代謝改造的作用，所有使用的人工全合成培養(yǎng)基(SC)均不含有Trp。在缺少URA和Trp的人工全培養(yǎng)基上篩選出含有URA3原養(yǎng)型標(biāo)記質(zhì)粒和基因組整合的釀酒酵母菌株；在缺少URA、Trp和His的人工全培養(yǎng)基上篩選出含有URA3和HIS3原養(yǎng)型標(biāo)記質(zhì)粒和基因組整合的釀酒酵母菌株，培養(yǎng)基包括6.7 g/L酵母無氨基酸氮源(YNB)、20 g/L葡萄糖、0.72 g/L酵母氨基酸缺失混合物和20 g/L瓊脂。帶有抗性基因的質(zhì)粒通過向培養(yǎng)基中添加300 mg/L的潮霉素或者200 mg/L的G418來進(jìn)行篩選。

生產(chǎn)IET的預(yù)培養(yǎng)通過挑取平板菌落在24孔板中進(jìn)行，每孔添加2 mL SC培養(yǎng)基，30 ℃，220 r/min下過夜發(fā)酵。預(yù)培養(yǎng)的菌液接種于2 mL的24孔板SC培養(yǎng)基中，30 ℃，220 r/min下發(fā)酵36 h。

大腸桿菌JM109被用于質(zhì)粒的貯存，并在需要時(shí)在添加了25 mg/L氯霉素、100 mg/L氨芐西林或者50 mg/L卡那霉素的肉湯培養(yǎng)基(LB)中生長(zhǎng)，培養(yǎng)基包括5 g/L酵母抽提物、10 g/L蛋白胨和10 g/L氯化鈉。通過在培養(yǎng)基中加入20 g/L的瓊脂得到固體培養(yǎng)基。

1.3 質(zhì)粒構(gòu)建

本研究所使用的構(gòu)建和貯存質(zhì)粒的大腸桿菌均為JM109，按照文獻(xiàn)[8]提供的方法制作大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞并進(jìn)行轉(zhuǎn)化。本研究所使用的所有引物和質(zhì)粒列在表1和表2中。質(zhì)粒構(gòu)建的方法主要使用Yeast Tool Kit[9]，運(yùn)用Golden Gate原理的模塊化的組裝方法。對(duì)于需要用到的單或多堿基突變使用引物融合聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)或者使用PCR介導(dǎo)的定點(diǎn)突變[10]。

表1 本研究所用的引物Table 1 Primers in this study

續(xù)表1

部件質(zhì)粒pBL617通過引物GGA-ARO8_F和GGA-ARO8_R從釀酒酵母基因組中對(duì)應(yīng)產(chǎn)物，然后通過產(chǎn)物帶有的BsmB I酶切位點(diǎn)將其連接至YTK001獲得部件質(zhì)粒。運(yùn)用相同的方法和原理從釀酒酵母基因組中得到ARO9，ARO10，THI3，PDC1，PDC5，PDC6，ADH1，ADH2，ADH3，ADH4，ADH5，SFA1基因，得到部件質(zhì)粒pBL618，pBL621，pBL622，pBL623，pBL624，pBL625，pBL626，pBL627，pBL628，pBL629，pBL630，pBL631。

運(yùn)用Yeast Tool Kit構(gòu)建了通用的預(yù)組裝質(zhì)粒，構(gòu)建了包含GFP dropout的帶有URA3原養(yǎng)型標(biāo)記整合型的質(zhì)粒pBL505，帶有HIS3原養(yǎng)型標(biāo)記整合型的質(zhì)粒pBL602，帶有HygRomycin抗性標(biāo)記的整合型質(zhì)粒pBL638。

本研究所使用的程序均按照Yeast Tool Kit文獻(xiàn)說明進(jìn)行，構(gòu)建了對(duì)應(yīng)的可以用于整合的最終質(zhì)粒，見表2。

表2 本研究使用的質(zhì)粒Table 2 Plasmids used in this study

1.4 菌株構(gòu)建

本研究所涉及的菌株均列于表3中。釀酒酵母感受態(tài)的制作：挑取單菌落過夜培養(yǎng)，次日以O(shè)D600=0.2接種于50 mL在250 mL錐形瓶新鮮的YPD培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至OD600=1.2～1.5，離心棄上清液，用無菌冰水清洗 2次，0.1 mol/L醋酸鋰清洗1次，將菌體重懸在400 μL 0.1 mol/L的醋酸鋰中，然后50 μL分裝；對(duì)分裝體系高速離心30 s棄去上清液，向菌體中依次加入240 μL EG 3 350，36 μL 1 mol/L LiAc，1 μg質(zhì)?；蛘咂危?0 μL 2.0 mg/mL的Single-stranded carrier DNA，用水補(bǔ)足360 μL體系，充分混勻后在30 ℃水浴30 min，42 ℃水浴25 min，最后離心后用1 mL無菌水重懸，取50～100 μL涂布到對(duì)應(yīng)的缺陷型或者含有抗性的平板上。

表3 本研究使用的菌株Table 3 Strains used in this study

1.5 菌株的表征

生長(zhǎng)速度是從獨(dú)立的生物副本中生長(zhǎng)的好氧間歇培養(yǎng)獲得的。用同一培養(yǎng)基和溫度的指數(shù)生長(zhǎng)細(xì)胞接種含有2 mL YPD或者SC帶檔板的24孔板中。

在生產(chǎn)性研究中，所有菌株均以O(shè)D600=0.2開始接種發(fā)酵。根據(jù)耗盡所有葡萄糖所需的時(shí)間，細(xì)胞統(tǒng)一生長(zhǎng)36 h。培養(yǎng)液在13 500×g下離心5 min，上清液在-20 ℃下冷凍。

400 μL的培養(yǎng)上清液與等量的無水乙醇混合，充分混勻，在13 500×g下離心5 min。將上清液用于芳香族化合物的分析。使用高效液相色譜對(duì)上清液進(jìn)行檢測(cè)，使用島津Shim-pack GIST C18柱，柱溫箱溫度30 ℃，流速1 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，使用紫外檢測(cè)器在215 nm和276 nm進(jìn)行檢測(cè)，洗脫程序采用梯度法，以20 mmol/L磷酸二氫鉀(pH=3.0)含1%(體積分?jǐn)?shù))乙腈(A)和乙腈(B)為溶劑，程序從0%增加到10%(體積分?jǐn)?shù))溶劑B (0～6.0 min)，然后將其體積分?jǐn)?shù)從10%線性增加到60% (6.0～25 min)，然后將體積分?jǐn)?shù)從60%降低到0% (25～26 min)，Trp在11 min出峰，對(duì)羥基苯乙醇 (p-hydroxy-phenylethanol，pPET) 在13.5 min出峰，苯乙醇(phenylethanol,PET)在19 min出峰，IET在19.75 min出峰。

光密度測(cè)量使用紫外可見分光光度計(jì)759s(600 nm)。

2 結(jié)果與分析

2.1 IET在釀酒酵母中合成途徑

IET的合成途徑(圖1)與Ehrlich途徑的過程保持高度一致，首先是帶有轉(zhuǎn)氨基作用的雙功能2-氨基己二酸轉(zhuǎn)氨酶ARO8(Gene ID:852672)和芳香族氨基酸2-酮戊二酸轉(zhuǎn)氨酶ARO9(Gene ID：856539)[12-14]將Trp轉(zhuǎn)化為吲哚丙酮酸(indole-3-pyruvate ，IPY)；之后在脫羧酶的作用下轉(zhuǎn)化為吲哚乙醛(indole-3-acetaldehyde，IAC)，能在這個(gè)過程中發(fā)揮作用的基因有編碼吲哚丙酮酸脫羧酶1的PDC1(Gene ID:850733)，編碼吲哚丙酮酸脫羧酶5的PDC5(Gene ID:850825)，編碼吲哚丙酮酸脫羧酶6的PDC6(Gene ID:852978)[15]，還有苯丙酮酸脫羧酶的ARO10(Gene ID:851987)和支鏈-2-含氧酸脫羧酶的THI3(Gene ID:851479)[6,16]；可催化最后一步IAC到IET的有乙醇脫氫酶1ADH1(Gene ID:854068)、乙醇脫氫酶2ADH2(Gene ID:855349)、乙醇脫氫酶3ADH3(Gene ID:855107)、乙醇脫氫酶4ADH4(Gene ID:852636)、乙醇脫氫酶5ADH5(Gene ID:852442)和編碼雙功能醇脫氫酶的基因SFA1(Gene ID:851386)[17]。其中大多數(shù)酶是泛底物酶，在釀酒酵母體內(nèi)催化多個(gè)同一類型的反應(yīng)，因此有必要探索更合適IET生產(chǎn)的酶。

2.2 釀酒酵母發(fā)酵生產(chǎn)IET過程的基本表征

選取釀酒酵母菌株BY4741進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，對(duì)Trp進(jìn)入代謝的關(guān)鍵酶基因ARO8和ARO9進(jìn)行了過表達(dá)，獲得菌株yBL804、yBL805，進(jìn)行了不同菌株在YPD富營養(yǎng)培養(yǎng)基中生產(chǎn)IET的實(shí)驗(yàn)，并且為了獲得更好的檢測(cè)效果，進(jìn)行了不同時(shí)間的取樣。結(jié)果如圖2-a所示，ARO8和ARO9的過表達(dá)有助于菌株的生長(zhǎng)，可見菌株的生長(zhǎng)在36 h達(dá)到頂峰，野生型菌株和實(shí)驗(yàn)組菌株生長(zhǎng)OD600值分別到達(dá)10和25左右，實(shí)驗(yàn)組菌株的OD600值比野生型增加約1.5倍。同時(shí)檢測(cè)了IET的產(chǎn)量，如圖2-b所示，實(shí)驗(yàn)組菌株IET的生產(chǎn)在24 h便趨于穩(wěn)定，達(dá)到0.07 mmol/L，是對(duì)照組的2倍。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，選定36 h作為之后所有實(shí)驗(yàn)的取樣時(shí)間。過表達(dá)菌株的IET產(chǎn)量有明顯的提高，但是相對(duì)應(yīng)的菌株生長(zhǎng)狀況在YPD培養(yǎng)基中得到了加強(qiáng)，但是YPD培養(yǎng)基的成分過于復(fù)雜，并不適合檢測(cè)代謝過程中的其他物質(zhì)，而且需要后續(xù)Trp添加實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步確認(rèn)過表達(dá)的效果。

圖1 從Trp到IET的代謝途徑及相關(guān)基因Fig.1 Metabolic pathway and related genes from tryptophan to tryptophan

a-菌株不同時(shí)間的生長(zhǎng)密度；b-對(duì)應(yīng)于不同取樣時(shí)間的IET產(chǎn)量圖2 BY4741過表達(dá)ARO8或ARO9的簡(jiǎn)單表征Fig.2 Simple characterization of BY4741 overexpressing ARO8 or ARO9

2.3 添加Trp生產(chǎn)IET

通過向發(fā)酵液中添加定量(5 mmol/L)的Trp，檢測(cè)yBL804、yBL805菌株的IET產(chǎn)量，菌株生長(zhǎng)狀況如圖3-a所示，出于2.2中檢測(cè)的需要，改用了SC培養(yǎng)基，各菌株的生長(zhǎng)不再表現(xiàn)出較大差異，OD600值穩(wěn)定在10左右。相對(duì)應(yīng)的IET產(chǎn)量如圖3-b所示，yBL805 IET產(chǎn)量達(dá)到0.58 mmol/L，相比于原始菌株提升47%，作為后續(xù)改造的出發(fā)菌株。

因?yàn)樵卺劸平湍阜种嵬緩街写嬖诒奖彼岷屠野彼岬母?jìng)爭(zhēng)途徑，我們同時(shí)檢測(cè)了其中苯丙氨酸和酪氨酸的代謝產(chǎn)物PET和pPET含量，如圖3-c所示，PET含量在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組都維持在0.08 mmol/L，而pPET含量實(shí)驗(yàn)組比對(duì)照組下降了36%，綜合來看，流向苯丙氨酸和酪氨酸途徑的碳流也有一定的減少，說明IET產(chǎn)量的提升也與流向Trp途徑的碳流量增加有一定關(guān)系。如圖3-d所示，對(duì)發(fā)酵過后Trp的剩余量進(jìn)行測(cè)定，yBL804和yBL805相較于BY4741多消耗Trp 0.23 mmol/L和0.35 mmol/L，這與IET的產(chǎn)量增加呈正相關(guān)，說明改造起到了效果。綜上，改造通過消耗Trp使更多的碳流量流向Trp分支，并且產(chǎn)量的提升比Trp的消耗要多，表明IET的產(chǎn)生是本身產(chǎn)生的Trp和外源添加Trp的共同作用。

a-36 h菌株的生長(zhǎng)密度；b-對(duì)應(yīng)菌株的IET產(chǎn)量；c-菌株副產(chǎn)物PET和pPET的量；d-發(fā)酵結(jié)束后Trp的剩余量圖3 BY4741過表達(dá)ARO8或ARO9Fig.3 BY4741 overexpressing ARO8 or ARO9

2.4 從IPY到IAC相關(guān)基因的過表達(dá)

向yBL805菌株轉(zhuǎn)入IPY到IAC的5個(gè)相關(guān)基因，如圖4-a所示，每一個(gè)基因都未對(duì)菌株生長(zhǎng)造成明顯的影響。各菌株在IET的生產(chǎn)中表現(xiàn)出了較為顯著的差異，如圖4-b所示，所有菌株均在IET生產(chǎn)上表現(xiàn)出提升，其中過表達(dá)ARO10的菌株yBL806的IET產(chǎn)量相比于yBL805提升51%。如圖4-c所示，pPET含量相比于yBL805進(jìn)一步下降，進(jìn)一步證實(shí)之前的結(jié)論。同時(shí)如圖4-d所示，Trp的消耗與IET的生成也有很好的正相關(guān)的關(guān)系。yBL806將被用來進(jìn)行下一步基因操作。

2.5 從IAC到IET相關(guān)基因的過表達(dá)

向yBL806菌株轉(zhuǎn)入IAC到IET的6個(gè)相關(guān)基因，如圖5-a所示，菌株生長(zhǎng)狀況基本一致。各菌株在IET的生產(chǎn)中大部分菌株并未表現(xiàn)出較為顯著的差異，如圖5-b所示，其中產(chǎn)量提升最多的過表達(dá)SFA1的菌株yBL816產(chǎn)量提升也只有3%。如圖5-c所示，pPET含量出現(xiàn)了進(jìn)一步下降，但是幅度很小。同時(shí)如圖5-d所示，Trp的消耗與IET的生成也有很好的對(duì)應(yīng)關(guān)系。yBL816檢測(cè)出最高產(chǎn)量為1.09 mmol/L，但是綜合來看生長(zhǎng)狀況和各相關(guān)化合物的量都沒有產(chǎn)生明顯的變化，說明了此步驟并非整個(gè)過程的限速步驟。

a-36 h菌株的生長(zhǎng)密度；b-對(duì)應(yīng)菌株的IET產(chǎn)量；c-菌株副產(chǎn)物PET和pPET的量；d-發(fā)酵結(jié)束后Trp的剩余量圖4 從IPY到IAC相關(guān)基因的過表達(dá)Fig.4 Overexpression of genes related to IAC from IPY

a-36 h菌株的生長(zhǎng)密度；b-對(duì)應(yīng)菌株的IET產(chǎn)量；c-菌株副產(chǎn)物PET和pPET的量；d-發(fā)酵結(jié)束后Trp的剩余量圖5 從IAC到IET相關(guān)基因的過表達(dá)Fig.5 Overexpression of genes related to IET from IAC

3 結(jié)論與討論

經(jīng)過對(duì)整個(gè)Trp到IET相關(guān)的13個(gè)基因的分步探究之后，發(fā)現(xiàn)從Trp到IPY的2個(gè)相關(guān)基因中，ARO9基因有更好的效果；從IPY到IAC相關(guān)的5個(gè)基因中，ARO10的效果最好；從IAC到IET相關(guān)的6個(gè)基因中，SFA1的效果最好。那么在Trp到IET的生物過程中，ARO9、ARO10和SFA1是最好的生產(chǎn)組合。其中限制Trp到IET的關(guān)鍵步驟為Trp到IAC的2個(gè)步驟，從IAC到IET的基因并沒有較大作用?？梢缘贸鲈谡麄€(gè)IET的生產(chǎn)過程中，限速步驟便是3個(gè)步驟的前2個(gè)步驟。本研究開創(chuàng)性的使用IET、PET和pPET來反應(yīng)碳流在3個(gè)芳香族氨基酸分支的流量大小，這是之前的研究未曾涉及的方面。由于色氨酸分支涉及的酶的種類過多，對(duì)于釀酒酵母中色氨酸分支的研究很少，關(guān)于IET生產(chǎn)的文章更是難以尋見，本研究使生物生產(chǎn)的轉(zhuǎn)化率達(dá)到21.8%，可以參考酪氨酸和苯丙氨酸的改造方法進(jìn)一步提高得率。

在進(jìn)行最開始的實(shí)驗(yàn)表征時(shí)，轉(zhuǎn)化菌株表現(xiàn)出過高的生長(zhǎng)密度，這是因?yàn)榕囵B(yǎng)基為富營養(yǎng)型，而ARO8和ARO9又是很多轉(zhuǎn)氨作用的關(guān)鍵酶[18]，所以會(huì)表現(xiàn)出更好的生長(zhǎng)情況。之后為了排除培養(yǎng)基對(duì)檢測(cè)其他物質(zhì)的影響，使用了SC培養(yǎng)基，菌株的長(zhǎng)勢(shì)便趨于一致。

不同基因的組合可能有更好的效果，而且對(duì)于不同基因使用不同啟動(dòng)子來控制酶的表達(dá)[19]也有可能獲得更高的IET產(chǎn)量，另外添加更多Trp也可能造成更高的脅迫以提高IET的產(chǎn)率[20]，以上皆可繼續(xù)進(jìn)行研究。

最后，相比于添加Trp生產(chǎn)IET，通過代謝工程來增加Trp的產(chǎn)量從而實(shí)現(xiàn)碳源到IET的從頭生產(chǎn)是更為綠色和環(huán)保的方式[21]，但是所涉及的途徑與基因過多，基本上涉及色氨酸分支的改造都不涉及上游Trp通量的改造[22]，這可能成為之后的一個(gè)研究方向。