基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探究王琦院士治療精液不液化核心組方的作用機(jī)制及實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

劉柘君 劉振權(quán) 鄭燕飛 沈真如 佟科錦 唐 田 于淑俊 王帥強(qiáng) 湯軼波

(1 北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，北京，100029；2 北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京，100029)

精液不液化是指男性禁欲3～5 d后排出體外的精液，置于室溫60 min內(nèi)不能產(chǎn)生液化的現(xiàn)象[1]。正常情況下，精液以液體的形式存在于男性的生殖道內(nèi)，射精時即為一種均勻黏稠的淡黃色或灰白色液體，射精后立即變?yōu)槟z凍狀，5～20 min后再次液化[2]。精液最開始的液體狀態(tài)利于男性的射精，而后的膠凍狀利于精液在女性陰道的停留，精液第2次的液化則利于精子在女性宮頸內(nèi)的游動，使女性受孕。而一旦精液無法液化，則影響精子的釋放，導(dǎo)致精子的有效運(yùn)動下降，干擾精卵結(jié)合，最終導(dǎo)致不孕不育[3]。

本研究根據(jù)“中醫(yī)傳承輔助平臺系統(tǒng)(V2.5)”中的“組方規(guī)律”功能對王琦院士門診期間收治精液不液化患者病歷處方進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘，基于關(guān)聯(lián)規(guī)則分析得出王琦院士治療精液不液化的核心組方，該方由黃芪、當(dāng)歸、巴戟天、菟絲子和枸杞子5味藥組成[4]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)能使復(fù)雜的組方成分降維，通過多靶點(diǎn)、多通路的方法多層次進(jìn)行研究，而分子對接技術(shù)可使活性成分與靶點(diǎn)之間的結(jié)合狀態(tài)具體化和可視化，因此本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)，探究王琦院士治療精液不液化核心組方的作用機(jī)制，同時針對所得出的作用靶點(diǎn)及信號通路開展動物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，以便為核心組方的臨床應(yīng)用提供更多的理論數(shù)據(jù)支撐。

1 資料與方法

1.1 核心組方組成藥物靶點(diǎn)收集 進(jìn)入中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology，TCMSP)(https://tcmsp-e.com/)中，檢索核心組方中當(dāng)歸、黃芪、巴戟天、菟絲子、枸杞子5味中藥的化學(xué)成分。根據(jù)TCMSP數(shù)據(jù)庫提供的藥代動力學(xué)(吸收、分布、代謝、排泄)相關(guān)數(shù)據(jù)，篩選口服生物利用度(Oral Bioavailability，OB)≥30%和類藥性(Drug Likeness，DL)≥0.18的化學(xué)成分。通過Uniprot數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)將篩選得出的化學(xué)成分所對應(yīng)靶蛋白轉(zhuǎn)化為基因名稱進(jìn)行信息統(tǒng)一規(guī)范。

1.2 構(gòu)建核心組方成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖 將“1.1”篩選得到的活性成分轉(zhuǎn)化得到基因名稱形成網(wǎng)絡(luò)文件和屬性文件后，輸入Cytoscape 3.7.2軟件中，構(gòu)建核心組方“活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，點(diǎn)擊“Network Analyzer”功能對網(wǎng)絡(luò)分析，計(jì)算自由度(Degree)值，該值越大則該節(jié)點(diǎn)越重要，并以不同形狀和顏色的節(jié)點(diǎn)表示核心組方活性成分和作用靶點(diǎn)。

1.3 精液不液化疾病靶點(diǎn)收集并構(gòu)建韋恩圖 精液不液化相關(guān)疾病靶點(diǎn)以“nonliquefaction of semen”“sperm liquefaction retardation”及“abnormal sperma liquefaction”與精液不液化相關(guān)的疾病作為關(guān)鍵詞，檢索GeneCard數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)及在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM)(https://omim.org/)后剔除重復(fù)靶點(diǎn)，以獲取精液不液化相關(guān)疾病靶點(diǎn)。并利用在線軟件作圖工具平臺(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)對藥物靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)進(jìn)行映射，獲得交集靶點(diǎn)并繪制韋恩圖。

1.4 構(gòu)建“藥物靶點(diǎn)-疾病靶點(diǎn)”蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò) 將核心組方藥物靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)的交集靶點(diǎn)即組方治療疾病的作用靶點(diǎn)通過String Version平臺(https://string-db.org/)構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(Protein-protein Interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)，選擇研究物種為“Homo sapiens”，并將下載的interactions.tsv文件導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件可視化PPI網(wǎng)絡(luò)，點(diǎn)擊“Network Analyzer”功能對網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，節(jié)點(diǎn)越大顏色越深，說明度值越高則該靶點(diǎn)越重要。

1.5 對交際靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體富集分析和京都基因和基因組百科全書富集分析 通過R語言平臺運(yùn)用Cluster Profiler程序包進(jìn)行基因本體(Gene Ontology，GO)和京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)信號通路富集分析，設(shè)定閾值P<0.05對結(jié)果進(jìn)行處理和可視化分析。

1.6 構(gòu)建核心組方成分-核心靶點(diǎn)-疾病通路網(wǎng)絡(luò) 將富集的KEGG信號通路根據(jù)count值排序，并將排序前15條通路作為主要疾病通路。將核心組方成分、作用靶點(diǎn)及疾病通路分別進(jìn)行一一對應(yīng)后導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件，采用Merge功能合并網(wǎng)絡(luò)，構(gòu)建成分-靶點(diǎn)-疾病通路網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化分析。

1.7 分子對接驗(yàn)證 將1.6中的核心組方成分-核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中篩選度值最高的5個成分作為核心組方的關(guān)鍵成分，在PPI網(wǎng)絡(luò)中篩選度值最高的5個靶點(diǎn)作為核心靶點(diǎn)。在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(Protein Data Bank，PDB)(https://www.rcsb.org/)和Uniprot網(wǎng)站分別下載5個關(guān)鍵成分的3D結(jié)構(gòu)圖以及5個關(guān)鍵靶點(diǎn)的蛋白結(jié)構(gòu)圖，使用AutoDockTool軟件對關(guān)鍵成分及核心靶點(diǎn)進(jìn)行對接，并使用Pymol軟件對對接的結(jié)果進(jìn)行繪圖和分析。

1.8 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

1.8.1 材料

1.8.1.1 動物 本實(shí)驗(yàn)所涉及的44只雄性7周齡，體質(zhì)量(180±200)gSprague Dawley大鼠購自北京斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司，許可證編號：SCXK(京)20190010，動物購買后適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，飼養(yǎng)過程中大鼠均自由進(jìn)食飲水，飼養(yǎng)室恒溫恒濕，溫度維持在20～25 ℃，濕度維持在55%。經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)動物倫理委員會批準(zhǔn)，該動物實(shí)驗(yàn)符合動物實(shí)驗(yàn)倫理學(xué)要求(倫理審批號：BUCM-4-2022071306-3020)。

1.8.1.2 藥物 核心組方藥物組成及劑量分別為當(dāng)歸20 g、黃芪20 g、巴戟天20 g、菟絲子20 g、枸杞子20 g，以上藥物均采用單味顆粒劑進(jìn)行配伍，所有中藥顆粒劑由北京康仁堂藥業(yè)有限公司統(tǒng)一生產(chǎn)并提供，生產(chǎn)批號分別為：當(dāng)歸，21018391；黃芪，21025221；巴戟天，21015111；菟絲子，21019621；枸杞子，21008741。

1.8.1.3 試劑與儀器 白細(xì)胞介素(Interleukin，IL)-1β試劑盒(江蘇晶美，貨號：JM-01454R1)，IL-6試劑盒(江蘇晶美，貨號：JM-01597R1)，腫瘤壞死因子(Tumor Necrosis Factor，TNF)-α試劑盒(江蘇晶美，貨號：JM-01587R1)，纖溶酶原激活物抑制物-1(Plasminogen Avtivator Inhibitor-1，PAI-1)/絲氨酸蛋白酶抑制物E支成員1(Serine Protease Inhibitor Clade E Member 1，SERPINE1)試劑盒(江蘇晶美，貨號：JM-11054R1)，二喹啉甲酸(Bicinchoninic Acid，BCA)試劑盒(普利萊，貨號：P1511-3)，完全弗氏佐劑(Sigma-Aldrich；美國；貨號：F5881-10X10ML)，總RNA抽提試劑(Total RNA Extraction Reagent，Trizol)(Ambion，美國，貨號：15596018)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(康維世紀(jì)，貨號：CW2582M)；多功能酶標(biāo)儀(Labsystems Multiskan MS，芬蘭，型號：352)，微量高速離心機(jī)(長沙湘智，型號：TG16W)，超聲波細(xì)胞破碎機(jī)(寧波新芝，型號：JY92-IIN)，渦旋振蕩儀(海門市其林貝爾儀器制造有限公司，型號：QL-902)，生物分光光度計(jì)(Eppendorf，德國，型號：BioPhotometer)，熒光定量PCR儀(BIO-RAD，美國，型號：CFX connectTM)。

1.8.2 方法

1.8.2.1 分組與模型制備 采用隨機(jī)數(shù)字表法將24只大鼠分為空白組、模型組和核心組方組，每組8只。剩余20只大鼠處死后提取前列腺蛋白用于模型組及核心組方組大鼠造模，造模方法參照文獻(xiàn)[5]方法，即通過慢性前列腺炎誘導(dǎo)精液不液化的方法進(jìn)行造模。

1.8.2.2 給藥方法 結(jié)合王琦院士臨床治療精液不液化患者常用藥物劑量，進(jìn)行人與大鼠劑量換算后，得出核心組方組灌胃核心組方的劑量為10 g/kg，模型組和空白組灌胃蒸餾水，灌胃給藥4周，1次/d。

1.8.2.3 檢測指標(biāo)與方法 大鼠末次給藥后隔天處死，取前列腺分為2部分于液氮中保存用于后續(xù)檢測。取各組大鼠前列腺稱定質(zhì)量后稀釋5倍進(jìn)行勻漿并靜置，3 000 r/min，離心半徑4.55 cm，離心15 min，取上清液使用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA)檢測IL-1β、IL-6、TNF-α、SERPINE1的水平。另一部分前列腺裝入無菌EP管，Trizol試劑盒提取前列腺組織中的總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction，PCR)擴(kuò)增IL-17。PCR條件為：95 ℃預(yù)變性15 min，95 ℃ 30 s、56 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，共40個循環(huán)，在72 ℃ 30 s處收集熒光信號，72 ℃延伸5 min。以空白組大鼠前列腺組織為1倍目的基因表達(dá)量的對照樣本，根據(jù)2-△△ct計(jì)算其他各組大鼠前列腺組織中目的基因IL-17 mRNA的相對表達(dá)。引物序列見表1。

表1 IL-17基因引物序列

2 結(jié)果

2.1 核心組方活性成分及其作用靶點(diǎn) 得到核心組方活性成分29種以及作用靶點(diǎn)194個。核心組方活性成分基本信息見表2。

表2 核心組方活性成分、基本信息及其度值

2.2 “核心組方成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析 “核心組方成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)包括223個點(diǎn)，324條邊。藍(lán)色正方形代表核心組方29種活性成分，黃色圓形代表所對應(yīng)的194個靶點(diǎn)，核心組方成分度值大則該節(jié)點(diǎn)較大，則說明核心組方中該成分較重要。見圖1。

圖1 “核心組方成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)

2.3 精液不液化疾病靶點(diǎn)及韋恩圖的構(gòu)建 經(jīng)檢索合并去重后，共獲得精液不液化相關(guān)基因共1 113個，核心組方作用靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)進(jìn)行韋恩分析后得到核心組方治療精液不液化的24個交集靶點(diǎn)。見圖2。

圖2 精液不液化與核心組方交集靶點(diǎn)韋恩圖

2.4 “藥物靶點(diǎn)-疾病靶點(diǎn)”PPI網(wǎng)絡(luò) 通過24個交集靶點(diǎn)初步構(gòu)建的PPI網(wǎng)絡(luò)包括24個點(diǎn)，137條邊。見圖3。進(jìn)一步可視化處理后網(wǎng)絡(luò)包括22個點(diǎn)，274條邊。顏色越深節(jié)點(diǎn)越大，則表明該節(jié)點(diǎn)degree值越高。見圖4。

圖3 基于String的PPI網(wǎng)絡(luò)

圖4 核心組方治療精液不液化的PPI網(wǎng)絡(luò)

2.5 GO富集分析及KEGG富集分析結(jié)果 獲得GO基因功能注釋共21條，KEGG通路富集分析30條，顏色表示通路富集到的數(shù)目，數(shù)目越大則越偏向紅色見。見圖5～6。

圖5 GO基因功能注釋富集分析

圖6 KEGG通路富集分析

2.6 “核心組方成分-靶點(diǎn)-疾病通路”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 “核心組方成分-靶點(diǎn)-疾病通路”網(wǎng)絡(luò)包括238個點(diǎn)，444條邊。黃色三角形代表194個靶點(diǎn)，粉色正方形代表15條疾病通路，藍(lán)色六邊形代表核心組方的29個成分。見圖7。

圖7 “核心組方成分-靶點(diǎn)-疾病通路”網(wǎng)絡(luò)

2.7 核心組方關(guān)鍵成分和核心靶點(diǎn)的分子對接驗(yàn)證 將5個關(guān)鍵成分和5個核心靶點(diǎn)進(jìn)行分子對接并按照結(jié)合能進(jìn)行排序，結(jié)果表明關(guān)鍵成分中的槲皮素、β-谷甾醇和異鼠李素與5個核心靶點(diǎn)之間結(jié)合性較好。見表3。圖8可知，將結(jié)果進(jìn)行可視化后顯示槲皮素、β-谷甾醇和異鼠李素與5個核心靶點(diǎn)蛋白殘基通過氫鍵形成穩(wěn)定構(gòu)象。

表3 分子對接最佳構(gòu)象組合(1 cal=4.184 J)

圖8 分子對接構(gòu)象圖

2.8 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.8.1 核心組方對于模型組大鼠IL-1β、IL-6、TNF-α、SERPINE1的影響 與空白組比較，模型組大鼠前列腺組織中的IL-1β、IL-6、TNF-α、SERPINE1水平顯著增加(均P<0.05)；與模型組比較，核心組方組大鼠前列腺組織中的IL-1β、IL-6、TNF-α、SERPINE1水平則顯著下降(均P<0.05)。見表4。

表4 各組大鼠前列腺組織中IL-1β、IL-6、TNF-α、SERPINE1水平

2.8.2 核心組方對于模型組大鼠IL-17 mRNA表達(dá)量的影響 與空白組比較，模型組大鼠前列腺組織中IL-17 mRNA表達(dá)量顯著增加(P<0.05)；與模型組比較，核心組方組大鼠前列腺組織中的IL-17 mRNA表達(dá)量顯著下降(P<0.05)。見表5，圖9。

表5 各組大鼠前列腺組織中IL-17 mRNA表達(dá)量

圖9 各組大鼠前列腺組織中IL-17 mRNA表達(dá)量

3 討論

中醫(yī)文獻(xiàn)中雖無精液不液化癥名，但精液不液化屬于“精滯、精寒、精熱”等疾病的范疇，精液亦屬于津液，津液的液化通過陽氣的氣化作用來推動，氣化作用又和機(jī)體的陰陽協(xié)調(diào)密切相關(guān)，同理，精為腎之所屬，精液的液化又有賴于腎的氣化功能，因此王琦院士治療精液不液化時著眼于腎陰陽失調(diào)，氣化失常的病機(jī)[4]，核心組方中的當(dāng)歸、黃芪氣血雙補(bǔ)調(diào)和陰陽，滋養(yǎng)后天氣血以養(yǎng)先天腎精，巴戟天補(bǔ)腎填精益筋骨，加之菟絲子、枸杞子滋腎陰益腎陽使氣機(jī)暢通，符合王院士對于精液不液化“扶正祛邪、恢復(fù)氣化功能”的治療原則。而西醫(yī)治療精液不液化常從慢性前列腺炎、精索靜脈曲張等引起精液不液化的病因入手，用藥上常選擇喹諾酮類抗生素和維生素，通過抗炎和抗氧化進(jìn)行治療，但長時間服用抗生素易引發(fā)不良反應(yīng)，影響男性生精功能和精子質(zhì)量；技術(shù)層面常采用人工授精技術(shù)，但花費(fèi)較高、成功率低[6]。中草藥成分復(fù)雜，具有多環(huán)節(jié)多靶點(diǎn)多通路的特點(diǎn)，因此在治療精液不液化上更加具有優(yōu)勢。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可將組方有效成分、對應(yīng)靶點(diǎn)、疾病通路進(jìn)行系統(tǒng)整合，進(jìn)一步揭示藥物的系統(tǒng)性藥理機(jī)制[7-8]，為中醫(yī)藥治療疾病的機(jī)制探究提供了新的思路和啟發(fā)。

本研究前期將王院士門診收治的精液不液化患者病歷導(dǎo)入“中醫(yī)傳承輔助平臺系統(tǒng)(V2.5)”后通過關(guān)聯(lián)規(guī)則分析的方法進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘，得出由當(dāng)歸、黃芪、巴戟天、菟絲子和枸杞子組成的核心組方。結(jié)果顯示該方關(guān)鍵活性成分主要是槲皮素、山柰酚、異鼠李素、黃豆黃素等黃酮類化合物以及β-谷甾醇的甾體類化合物。有研究表明槲皮素具有抗氧化和抗炎作用，能減輕大鼠睪丸和附睪的氧化應(yīng)激程度，減少氧化產(chǎn)物的產(chǎn)生，經(jīng)槲皮素治療后炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生和表達(dá)均有明顯的下降[9-10]。山柰酚能抑制晚期糖基化終末產(chǎn)物(Advanced Glycation End Product，AGE)的形成，具有較強(qiáng)的抗氧化作用，能減少細(xì)胞內(nèi)脂類和DNA的氧化損傷，抑制前列腺增生和前列腺癌的發(fā)展，有利于雄性生殖功能損傷的恢復(fù)[11-12]。異鼠李素能緩解由TNF、IL-6、IL-1β等炎癥介質(zhì)引起的炎癥反應(yīng)過表達(dá)，并誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞凋亡[13]。黃豆黃素能通過對雄激素受體信號通路的介導(dǎo)，阻斷雄性激素依賴性基因的表達(dá)，起到預(yù)防和治療前列腺癌的作用[14]。β-谷甾醇對雄性白化大鼠進(jìn)行治療后可使精子水平和睪丸體質(zhì)量增加，能夠減輕生殖系統(tǒng)的損傷，促進(jìn)生殖功能的恢復(fù)[15]。

通過對核心組方藥物成分、靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)的總體綜合分析，共得出24個交集靶點(diǎn)，將交集靶點(diǎn)輸入String網(wǎng)站后將網(wǎng)站生成文件導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2，根據(jù)靶點(diǎn)degree值進(jìn)行排序得出TNF、SERPINE1、IL-6、IL-1β是關(guān)鍵靶點(diǎn)。關(guān)鍵靶點(diǎn)中的炎癥介質(zhì)TNF、IL-6和IL-1β與前列腺炎的發(fā)生發(fā)展密不可分[16]，前列腺炎會引起白細(xì)胞數(shù)量增加，導(dǎo)致前列腺上皮細(xì)胞功能異常，減少以前列腺特異性抗原(Prostate Specific Antigen，PSA)和前列腺酸性磷酸酶為主的蛋白分解酶生成及分泌，最終造成精液不液化[17]。根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查研究表明，90%的精液不液化患者有前列腺炎，慢性前列腺炎患者中約有23.16%的患者會產(chǎn)生精液不液化[18]。SERPINE1是一種調(diào)節(jié)纖維蛋白溶解的遺傳糖蛋白，是纖維蛋白溶解酶原激活因子類特異性抑制物[19]。纖維連接蛋白(Fibronectin，F(xiàn)N)、精膠蛋白(Semenogelin，Sg)等是精囊腺分泌的主要蛋白，是引起精液凝固的原因，精液液化時FN也會隨之降解為多肽片段，當(dāng)PSA作為水解底物時，F(xiàn)N水平與精液液化程度和精子活動率密切相關(guān)[20-21]，因此FN等蛋白的及時降解有利于精液的及時液化。有研究認(rèn)為當(dāng)精液中的SERPINE1/PAI-1水平增高時，會使精液中的纖溶酶等蛋白水解酶活性受到抑制，導(dǎo)致精液中的纖維蛋白無法及時降解為多肽片段，造成精液液化時間的延長[22]。分子對接結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了核心組方關(guān)鍵活性成分與核心靶點(diǎn)TNF、SERPINE1、IL-6、IL-1β和血管內(nèi)皮生長因子(Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF)A具有良好的親和力，當(dāng)結(jié)合能小于-5.0 kcal/mol(1 cal=4.184 J)時說明具有較好的結(jié)合活性，小于-7.0 kcal/mol時則提示配體與受體之間具有強(qiáng)烈的結(jié)合活性[23]。因此分子對接結(jié)果可表明，核心組方關(guān)鍵活性成分與核心靶點(diǎn)之間具有較好的結(jié)合性，能形成較為穩(wěn)定的構(gòu)象，在抗炎和調(diào)節(jié)纖維蛋白方面具有較好的作用效果。課題組前期臨床研究和實(shí)驗(yàn)研究表明，核心組方能有效改善精液不液化，因此，在此基礎(chǔ)上開展藥理驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)，對核心靶點(diǎn)及信號通路進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明經(jīng)該方干預(yù)后，模型組大鼠前列腺組織中的TNF-α、SERPINE1、IL-6、IL-1β水平顯著性降低(均P<0.01)，說明核心組方中主要成分的作用靶點(diǎn)與精液不液化的疾病基因關(guān)聯(lián)度較高，即本研究方法具有一定的可信度。

核心組方治療精液不液化的過程涉及多個信號通路，包括糖尿病并發(fā)癥晚期糖基化終末產(chǎn)物-晚期糖基化終產(chǎn)物受體(AGE-receptor for Advanced Glycation End Products，AGE-RAGE)信號通路及炎癥通路IL-17信號通路等通路。研究表明AGE暴露后與RAGE相互作用通過磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B通路誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞的生長和增殖[24]。IL-17由輔助性T細(xì)胞17(T Helper Cell，Th17)分泌，在炎癥性腫瘤中，IL-17與受體結(jié)合后經(jīng)信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)誘導(dǎo)靶細(xì)胞合成釋放炎癥介質(zhì)如TNF-α、IL-1等，并促進(jìn)VEGFA的表達(dá)以生成新的血管[25]。此外有研究表明，IL-17及其受體在前列腺癌組織中表達(dá)顯著增加，與前列腺癌關(guān)系密切[26]，實(shí)時熒光定量-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明經(jīng)核心組方治療后模型組大鼠前列腺組織中IL-17 mRNA表達(dá)量顯著下調(diào)，說明由網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)所得出的IL-17信號通路是核心組方治療精液不液化的主要作用通路之一，再一次驗(yàn)證了本研究的可行性。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對王琦院士治療精液不液化核心組方成分、靶點(diǎn)、通路和機(jī)制進(jìn)行探索，根據(jù)分子對接技術(shù)對關(guān)鍵成分和核心靶點(diǎn)之間的結(jié)合程度進(jìn)行分析和驗(yàn)證。預(yù)測發(fā)揮治療作用的關(guān)鍵成分有槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、異鼠李素和黃豆黃素，作用的核心靶點(diǎn)可能是TNF、SERPINE1、IL-6、IL-1β等，關(guān)鍵通路是糖尿病并發(fā)癥AGE-RAGE信號通路及IL-17信號通路等，且通過動物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)經(jīng)核心組方給藥后大鼠前列腺組織中的TNF、SERPINE1、IL-6、IL-1β水平及IL-17 mRNA表達(dá)量均顯著下降，與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究結(jié)果存在一致性，說明核心組方成分通過對應(yīng)靶點(diǎn)可直接或間接作用于疾病信號通路，圍繞抗炎、抗氧化以及調(diào)節(jié)纖維蛋白等生物學(xué)進(jìn)程多層次、多環(huán)節(jié)地治療精液不液化。

綜上所述，本研究為臨床治療精液不液化提供新的理論數(shù)據(jù)和科學(xué)根據(jù)，也進(jìn)一步傳承王琦院士的學(xué)術(shù)經(jīng)驗(yàn)。