太赫茲波譜在柴胡檢測中的應用

黃玉青 李 茜 李曉輝 曾志堅 賴小平

（1．太赫茲科技應用（廣東）有限公司，廣東 廣州 510000；2．江門市藥品檢驗所，廣東 江門 529000；3．廣州中醫(yī)藥大學，廣東 廣州 510000）

0 引言

柴胡為傘形科植物柴胡（Bupleurum chinense DC.）或狹葉柴胡（Bupleurum scorzonerifolium Willd）的干燥根。按性狀不同，分別習稱“北柴胡”和“南柴胡”[1]。柴胡始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有解表退熱、疏肝解郁之功效，臨床上常用于感冒發(fā)熱、寒熱往來和胸脅脹痛等，制劑有柴胡注射液、小柴胡顆粒等，通常以北柴胡為主。由于北柴胡需求量大，不能滿足市場需求，導致多種柴胡偽品進入市場[2]，例如以藏柴胡代替北柴胡進行銷售，甚至以混偽品的柴胡制成制劑，因此對柴胡的真、偽鑒別具有重要研究意義。

太赫茲波（THz）是指頻率在0.1 THz～10 THz的電磁波，在電磁波譜上位于微波和紅外線之間，是人類目前尚未完全開發(fā)的電磁波譜“空白”區(qū)。太赫茲時域光譜技術已成為檢測中藥的新方法，太赫茲頻段作用機制是有機分子間氫鍵作用、生物大分子骨架振動和分子晶體低頻振動等。該研究利用太赫茲時域光譜技術測定錐葉柴胡、北柴胡、南柴胡和藏柴胡，結(jié)合主成分分析（PCA）把相關性的變量降維并轉(zhuǎn)化成幾個主成分指標，反映事物內(nèi)部變量之間的規(guī)律[3]，建立不同品種柴胡的鑒別模型。

1 試驗與方法

1.1 試驗儀器

該研究采用透射光譜模塊，光路系統(tǒng)示意圖如圖1所示。系統(tǒng)采用780 nm的光纖飛秒激光器作為激發(fā)光源，其發(fā)射源和探測器均采用太赫茲光電導天線產(chǎn)生和接收太赫茲信號。壓片機（HY-12型，天津天光新光學儀器有限公司），多功能粉碎機（BJ-200型，德清拜杰電器有限公司），電熱鼓風干燥箱（DHG-9070A型，上海一恒科學儀器有限公司），壓片模具（HF-2A型，天津天光新光學儀器有限公司）。

圖1 太赫茲時域光譜系統(tǒng)原理圖

1.2 樣品制備及光譜數(shù)據(jù)采集

錐葉柴胡、北柴胡、南柴胡和藏柴胡由江門市藥品檢驗所鑒定、提供。柴胡樣品經(jīng)粉碎過200目篩，可減少散射對太赫茲波的干擾，置60 ℃干燥2 h，以減少樣品的水分對太赫茲波的干擾。放冷后精密稱定0.2 g，在壓強為24 MPa下壓制成直徑13 mm，厚度為1.0 mm～1.4 mm的圓形薄片。每種柴胡樣品各制備10片，共40個樣品片。太赫茲脈沖經(jīng)過樣品，測定氮氣參考譜線及樣品的時域譜。

2 結(jié)果處理

用Dorney和Duvillaret等人提出的方法處理該文試驗獲得的數(shù)據(jù)，得到氮氣參考THz時域和樣品THz時域信號，通過傅里葉轉(zhuǎn)換，得到相應參考頻域信號和樣品頻域信號，再對樣品的吸收系數(shù)譜進行分析和研究。經(jīng)數(shù)據(jù)處理得到的樣品的折射率n(ω)和吸收系數(shù)α(ω)分別如公式（1）和公式（2）所示。

式中：ω為頻率；φ(ω)為樣品與參考信號的相位差；c為光速；d為樣品的厚度；A(ω)為頻域信號下，樣品與參考的振幅比。

大多數(shù)中藥材主成分的振動和旋轉(zhuǎn)能級處于太赫茲波段內(nèi)，利用太赫茲技術鑒定中藥的代謝產(chǎn)物，如糖類、蛋白質(zhì)、生物堿和黃酮化合物等，有很好的鑒別效果。太赫茲時域光譜結(jié)合化學計量學方法已鑒別出冬蟲夏草、紅花、牛黃、冰片和西洋參[4-6]等中藥材。陳艷江等人[7]用支持向量機對南柴胡和北柴胡的太赫茲光譜進行識別，但未對柴胡其他品種進行鑒別。

因為原始吸收譜數(shù)據(jù)會受系統(tǒng)噪聲、樣品不均勻及光散射等因素影響，所以需要截取有效的頻譜范圍進行分析。4種柴胡的吸收系數(shù)譜圖如圖2所示。從圖2可以看出，0.3 THz～2.0 THz沒有受到噪聲的影響，該有效頻譜可以反映出不同品類柴胡間的總體差異，所以選取0.3 THz～2.0 THz作為有效頻譜范圍進行分析。

圖2 4種柴胡的吸收系數(shù)譜圖

3 數(shù)據(jù)結(jié)果

3.1 利用主成分分析對4種柴胡進行區(qū)分

該試驗將截取的吸收系數(shù)譜進行主成分分析（PCA），因為4種柴胡都沒有明顯的吸收峰，且每種柴胡的吸收系數(shù)譜線均非常相似，所以用SIMCA14.1軟件對吸收系數(shù)譜原始數(shù)據(jù)進行主成分分析（PCA）。將截取的吸收系數(shù)譜按軟件SIMCA需求進行整理，得出主成分數(shù)t1、t2等是總結(jié)X變量的新變量。分數(shù)是正交的，即彼此完全獨立。模型中的得分向量與組件一樣多。分數(shù)t1（第一分量）解釋了X空間的最大變化，其次是t2等。因此，t1與t2的散點圖是X空間中的一個窗口，顯示了X觀測值相對于彼此的位置。該圖顯示了數(shù)據(jù)中可能存在的異常值、組、相似性和其他模式。SIMCA使用二維分數(shù)圖，根據(jù)Hotelling的T2繪制公差橢圓。同時可以觀察到位于橢圓外部的觀測值是異常值?？傻?個主成分數(shù)，各個主成分的特征值和貢獻率見表1。主成分1和主成分2的累積貢獻率為92.9%，前2個主成分足以反映樣品的原始信息。

表1 4種柴胡THz量子指紋圖譜主成分分析的特征值和貢獻率

4種不同種類柴胡樣本的主成分1和主成分2得分圖如圖3所示。從圖3可以看出，錐葉柴胡和藏柴胡能明顯區(qū)分，而南、北柴胡有少許重疊且在同一片區(qū)域內(nèi)，這2種柴胡可能具有相同成分。

北柴胡的成分主要是柴胡皂苷、醇、揮發(fā)油、脂肪酸（油酸、亞麻油酸、棕櫚酸和硬脂酸等）和多糖等。南柴胡的成分主要是柴胡皂苷、甾醇、揮發(fā)油、脂肪油和莖葉尚含黃酮類。兩者的主要成分很多為相同成分，所以兩者有所重疊。

藥用柴胡以北柴胡為主，分別建立北柴胡與藏柴胡、北柴胡與錐葉柴胡的主成分分析（PCA）鑒別分類模型。根據(jù)圖3可知北柴胡與藏柴胡分類準確率均為100%。同理從圖3可知，北柴胡與錐葉柴胡分類準確率分別為100%和93.3%。

圖3 4種柴胡前2個主成分得分圖

DModX是訓練集中觀察到X模型平面或超平面的距離。DModX與X觀測的殘余標準偏差（RSD）成比例。默認情況下，DModX以標準化單位顯示，即絕對DModX除以模型的合并剩余標準偏差。DModX的臨界值表示為Dcrit，由F分布計算得出。Dcrit調(diào)節(jié)圍繞訓練集數(shù)據(jù)點的“包絡線”的大、小。DModX的觀測值是Dcrit的2倍，屬于中等異常值。這表明在變量的相關結(jié)構方面，這些觀測與正常觀測不同。貢獻圖顯示所有X變量的殘差。具有較大正或負殘差的變量是那些與模型捕獲的系統(tǒng)結(jié)構不同的變量。

將分數(shù)看作帶有權重的變量的加權平均值，即載荷（p）。第一分量中的p1和第二分量中的p2。p1和p2是每個變量具有一個元素的向量。這些權重（即負載）表示X矩陣的主要相關結(jié)構。因此，p1與p2顯示了X變量的相互關聯(lián)。

藏柴胡所含的柴胡皂苷遠高于北柴胡及南柴胡，非法商人常用藏柴胡替代北柴胡及南柴胡，其中柴胡皂苷是柴胡重要的化學成分之一，具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛和抗炎等藥理作用，有很強的生理活性作用。藏柴胡與北柴胡得以完全區(qū)分將有利于市場對柴胡品種的監(jiān)管。

3.2 利用算法區(qū)分不同比例下的藏柴胡和北柴胡

不法商家往往在其中摻入無藥效的地上部分，甚至用竹葉柴胡、錐葉柴胡等冒充柴胡售賣，獲取暴利，攪亂市場，損害消費者健康，更制約著柴胡產(chǎn)業(yè)化的發(fā)展。當前國內(nèi)對于柴胡真、偽的鑒別手段主要有感官檢測與化學分析法。前者主要是根據(jù)外觀性狀、顏色和氣味等差異對不同柴胡進行鑒別，該方法易受主觀條件及客觀環(huán)境因素的干擾，準確度有待提高?；瘜W分析方法主要是通過薄層色譜法、高效液相色譜法和氣質(zhì)聯(lián)用等方法檢測柴胡中各成分物質(zhì)。然而，這些方法樣品前處理復雜、試驗周期長、成本較高且步驟復雜，不能快速檢測柴胡真、偽。為解決以上問題，該文利用太赫茲光譜技術對不同比例的藏柴胡和北柴胡進行區(qū)分。

以北柴胡10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%和80%與相應的藏柴胡進行混合，按第1.2節(jié)的制樣方式，將柴胡樣品經(jīng)粉碎過200目篩，置60 ℃干燥4 h，按相應比例稱定總量為0.2 g，在壓強為24 MPa下壓制成直徑13 mm，厚度為1.0 mm～1.4 mm的圓形薄片，每種柴胡樣品各制備10片，共80片。開啟CCT-1800太赫茲時域光譜儀，打開測試工作站，儀器預熱20 min，通入氮氣除去樣品倉的水汽后獲取氮氣參考譜線。把制備的樣品放置樣品架上進行掃描測定，每個樣品片測定1次，平均次數(shù)100。

因為0.3 THz～2.0 THz沒有受到噪聲的影響，所以選擇該有效頻譜，可以反映出不同比例下藏柴胡及北柴胡的總體差異。結(jié)合算法對介電常數(shù)（實部）譜圖、介電常數(shù)（虛部）譜圖、頻域譜圖、時域譜圖、吸收譜圖、吸收系數(shù)譜圖、相位譜圖以及折射率譜圖分別進行統(tǒng)計及分析，得到精度平均值為0.9921。結(jié)果表明，該方法可以有效區(qū)分按不同比例混合的藏柴胡和北柴胡，是一種對柴胡進行摻假檢測的快速、高效并準確的方法。

4 結(jié)論

目前，我國野生柴胡數(shù)量已嚴重不足，而人工種植面積增長緩慢，市場上的柴胡數(shù)量正逐漸下降。與此同時，柴胡作為新藥開發(fā)的熱門對象，市場價格也在不斷上漲，種植前景可觀。然而，受種植、采收加工到儲存等多方面因素的影響，柴胡的標準化建設滯后。

太赫茲時域光譜技術已成為檢測中藥的新方法，太赫茲頻段作用機制是有機分子間氫鍵作用、生物大分子骨架振動以及分子晶體低頻振動等。利用太赫茲時域光譜技術結(jié)合主成分分析方法，可對北柴胡、南柴胡、錐葉柴胡和藏柴胡進行有效、快速的鑒別分類。選取THz吸收系數(shù)譜數(shù)據(jù)，通過主成分得分圖即可看出分類效果。其中，北柴胡和藏柴胡分類準確率均為100%，北柴胡與錐葉柴胡分類準確率分別為100%和93.3%。利用KNeighbors Classifier算法區(qū)分不同比例的藏柴胡和北柴胡，得到精度平均值為0.9921。結(jié)果表明，該方法可以有效區(qū)分按不同比例混合的藏柴胡和北柴胡，是一種對柴胡進行摻假檢測的快速、高效并準確的方法。