鴨疫里默氏桿菌耐藥機(jī)制研究進(jìn)展

劉玲俐，趙亞楠，靳亞潔，祁晶晶，田明星，王少輝，李 濤，于圣青

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

鴨疫里默氏桿菌（Riemerella anatipestifer, RA）是一種可引起鴨、鵝、雞、火雞等禽類(lèi)急性或慢性敗血癥的黃桿菌科革蘭氏陰性菌。該菌對(duì)水禽的感染在世界范圍內(nèi)均有報(bào)道，并由于其可造成家禽較高死亡率、低飼料轉(zhuǎn)化率從而給家鴨養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，由于RA血清型眾多，彼此之間無(wú)交叉保護(hù)，因此，現(xiàn)階段抗生素仍是防控RA的主要手段。然而抗生素的長(zhǎng)期使用，使得RA在藥物選擇壓力下，對(duì)藥物敏感的菌株被抑制或殺滅，而藥物抵抗菌株則獲得生存優(yōu)勢(shì)，繼續(xù)繁殖和克隆傳播，導(dǎo)致RA臨床分離株耐藥率逐年上升?，F(xiàn)有文獻(xiàn)表明，RA基因組中抗藥性基因的比重已大大提高，臨床分離株多重耐藥現(xiàn)象十分嚴(yán)重。流行病學(xué)研究調(diào)查顯示，不同區(qū)域、不同血清型的RA對(duì)不同抗菌藥物的耐藥水平存在一定差異[1-5]。同時(shí)，RA對(duì)抗菌藥物產(chǎn)生耐藥性通常是在多種因素共同作用下的結(jié)果。本文綜合國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)，對(duì)RA耐藥機(jī)制研究現(xiàn)狀進(jìn)行總結(jié)。

1 外排泵系統(tǒng)

外排泵系統(tǒng)是介導(dǎo)RA內(nèi)源性和獲得性耐藥的一種主要機(jī)制，它通過(guò)泵出菌體細(xì)胞內(nèi)的抗菌藥物，使其不能發(fā)揮作用。但是由外排泵系統(tǒng)引起的細(xì)菌耐藥性通常為非特異性。

仲崇岳等[6-7]通過(guò)對(duì)比分析加入外排泵抑制劑羰基-氰-間氯苯腙（CCCP）前后，RA對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗菌藥物敏感性的變化，證明了RA臨床株攜帶跨膜質(zhì)子梯度能驅(qū)動(dòng)型外排泵，并且初次總結(jié)出外排泵系統(tǒng)是與RA對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)、氨基糖苷類(lèi)、喹諾酮類(lèi)藥物的耐藥性相關(guān)。在此基礎(chǔ)上，金龍翔[8]檢測(cè)了CCCP對(duì)RA二代氟喹諾酮類(lèi)抗菌藥物敏感性的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，主動(dòng)外排泵系統(tǒng)與RA對(duì)大部分二代氟喹諾酮類(lèi)抗菌藥物的耐藥性相關(guān)，但主要影響RA對(duì)諾氟沙星和環(huán)丙沙星的敏感性，并不影響RA對(duì)左氧氟沙星的敏感性。Chen等[9]在臺(tái)灣地區(qū)分離的66株RA中，檢測(cè)出9株氟苯尼考耐藥株，通過(guò)PCR擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)這9株耐藥菌株均攜帶編碼外排泵蛋白的floR基因，藥敏實(shí)驗(yàn)證明，該外排泵系統(tǒng)與RA對(duì)氯霉素和氟苯尼考的耐藥性相關(guān)。利用基因組高通量測(cè)序技術(shù)，Wang等[10]發(fā)現(xiàn)RA ATCC11845株基因組中，攜帶兩種外排泵編碼基因：小多重耐藥家族（small multi-drug resistance family, SMR）和主要易化子超家族（major facilitator superfamily, MFS），猜測(cè)其可能與RA對(duì)抗菌藥物的耐藥性有關(guān)，但未進(jìn)行實(shí)驗(yàn)證實(shí)。Zhang等[11]在RA-CH-1中，鑒定了一個(gè)編碼耐藥結(jié)節(jié)化細(xì)胞分化家族（resistance nodulation cell division family,RND）外排泵RaeB的基因B739_0873，藥敏實(shí)驗(yàn)證明該基因的缺失會(huì)增強(qiáng)RA對(duì)氨基糖苷類(lèi)藥物和洗滌劑的敏感性。同樣，李生斗[12]在RA-GD株中，鑒定了一個(gè)編碼ATP結(jié)合盒超家族（ATP-binding cassette superfamily, ABC）外排泵MarB亞基的基因RIA_1614，利用基因缺失技術(shù)，證實(shí)該基因的缺失會(huì)增強(qiáng)RA對(duì)氨基糖苷類(lèi)藥物和有機(jī)溶劑的敏感性。Chen等[13]借助外排泵抑制劑及實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，證實(shí)了外排泵基因與RA耐藥表型之間有一定關(guān)聯(lián)，但不是絕對(duì)關(guān)聯(lián)，同時(shí)作者認(rèn)為外排泵抑制劑可以考慮應(yīng)用于臨床治療。現(xiàn)階段，相對(duì)其他種屬細(xì)菌，RA發(fā)現(xiàn)、鑒定的外排泵種類(lèi)仍不多，其功能研究也多局限于同源基因的比較，較少涉及外排泵排出藥物機(jī)制研究，這與RA缺乏成熟、穩(wěn)定的基因突變系統(tǒng)有關(guān)。

2 細(xì)胞膜通透性的改變

革蘭氏陰性菌可以通過(guò)改變細(xì)胞外膜的通透性，來(lái)降低菌體內(nèi)抗菌藥物濃度或者阻止抗菌藥物進(jìn)入細(xì)菌體內(nèi)。仲崇岳[7]發(fā)現(xiàn)臨床株RA14、RA58和RA59這3株菌株對(duì)苯唑西林、頭孢吡肟、頭孢噻肟、青霉素的MIC值均不受外排泵抑制劑CCCP的影響且對(duì)部分藥物顯示為耐藥表型，通過(guò)頭孢硝噻吩法和PCR擴(kuò)增方法，檢測(cè)其β-內(nèi)酰胺酶表型及基因型均為陰性，猜測(cè)這3株分離株的藥物耐藥機(jī)制可能是由于細(xì)胞膜通透性降低而引起。此外，仲崇岳[7]利用人工誘導(dǎo)耐藥方法，構(gòu)建了RA43頭孢吡肟耐藥株，SDS-PAGE電泳檢測(cè)原始頭孢吡肟敏感株和人工誘導(dǎo)耐藥株外膜蛋白，結(jié)果顯示，誘導(dǎo)后RA43的外膜蛋白條帶和誘導(dǎo)前有所不同，在大約20 kDa和45 kDa處各有2條條帶發(fā)生缺失，作者推測(cè)外膜蛋白缺失導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性改變是導(dǎo)致RA43發(fā)生耐藥性改變的主要原因之一。目前，臨床常用抗菌藥物多為親脂性，可自由進(jìn)入RA細(xì)胞膜磷脂雙層結(jié)構(gòu)，特別是β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素很容易通過(guò)RA細(xì)胞膜上存在的孔蛋白通道進(jìn)入胞內(nèi)，然而當(dāng)外膜的滲透性發(fā)生改變，如基因突變導(dǎo)致部分種類(lèi)孔蛋白通道關(guān)閉或缺失，RA就會(huì)產(chǎn)生對(duì)該抗菌藥物的耐藥性，目前該耐藥機(jī)制多見(jiàn)于β-內(nèi)酰胺類(lèi)藥物。

3 藥物靶基因突變

病原菌可以通過(guò)使藥物作用靶位點(diǎn)基因發(fā)生突變的方式，來(lái)改變藥物作用靶位點(diǎn)蛋白的結(jié)構(gòu)，從而改變藥物接合位點(diǎn)的空間構(gòu)象，使其與藥物的親和力降低甚至不能與藥物結(jié)合，從而導(dǎo)致藥物藥效降低甚至失活[14-15]，由于細(xì)菌突變進(jìn)化速度較快，藥物靶基因突變導(dǎo)致的耐藥機(jī)制是細(xì)菌產(chǎn)生藥物抵抗性主要原因。劉穎等[16]對(duì)比分析了喹諾酮類(lèi)藥物耐藥菌株與敏感菌株的gyrA基因喹諾酮類(lèi)藥物決定區(qū)（quinolone resistance determinational region,QRDR）核酸序列，發(fā)現(xiàn)耐藥菌株通過(guò)堿基突變，使QRDR對(duì)應(yīng)位點(diǎn)的氨基酸發(fā)生突變，從而使喹諾酮類(lèi)藥物作用靶蛋白DNA促旋酶A亞基空間構(gòu)象發(fā)生變化，導(dǎo)致RA對(duì)喹諾酮類(lèi)藥物的敏感性降低、耐藥性增強(qiáng)。孫亞妮等[17]分析了30株RA諾氟沙星耐藥株gyrA基因QRDR，發(fā)現(xiàn)氨基酸突變位點(diǎn)主要是QRDR第83位和第87位氨基酸，其中9株Ser83突變?yōu)锳rg83，21株Ser83突變?yōu)镮le83，30株RA耐藥株中，Gly87均突變?yōu)锳sp87。在此基礎(chǔ)上，Sun等[18]分析發(fā)現(xiàn)RAgyrA雙突變株（第83位和第87位氨基酸同時(shí)突變）對(duì)喹諾酮類(lèi)藥物的抗性水平顯著高于單突變株；同時(shí)，該研究還證實(shí)了RA菌株中與喹諾酮類(lèi)藥物耐藥相關(guān)的另一基因parC基因QRDR突變熱點(diǎn)不同于大腸桿菌[19]、銅綠假單胞菌[20]及胸膜肺炎桿菌[21]，parC的QRDR中只檢測(cè)到一個(gè)突變熱點(diǎn)Arg120Glu，作者推測(cè)該位點(diǎn)氨基酸的突變可能與環(huán)丙沙星耐藥相關(guān)，因?yàn)樵趃yrA和parC中均有突變的分離株比gyrA單突變株表現(xiàn)出更高的環(huán)丙沙星耐藥性。Sun等[22]對(duì)18個(gè)RArpoB基因氨基酸序列的比較分析和利福平MIC測(cè)定表明，以下5個(gè)氨基酸位點(diǎn)突變與利福平耐藥相關(guān)：V382I、H491N、G502K、R494K和S539Y，這些氨基酸的突變導(dǎo)致rpoB基因編碼的RNA聚合酶β亞基空間構(gòu)象發(fā)生改變，使利福平無(wú)法與作用靶位點(diǎn)之間形成緊密的分子作用力，從而致使利福平無(wú)法通過(guò)阻止RNA轉(zhuǎn)錄發(fā)揮抗菌作用。

4 產(chǎn)生滅活酶或鈍化酶

細(xì)菌可以通過(guò)產(chǎn)生滅活酶的方式，使進(jìn)入細(xì)菌菌體內(nèi)的抗菌藥物結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，然后轉(zhuǎn)變?yōu)閷?duì)細(xì)菌無(wú)活性的代謝物，失去抗菌藥物原本的活性。近年來(lái)，耐藥基因流行病學(xué)分析結(jié)果表明，RA中能夠檢測(cè)到的滅活酶的數(shù)量和種類(lèi)越來(lái)越多，主要可以分為以下幾類(lèi)：

4.1 滅活氨基糖苷類(lèi)抗生素的鈍化酶 鈍化酶是耐藥菌株產(chǎn)生的可通過(guò)水解或修飾作用破壞藥物活性基團(tuán)，從而使藥物失效的蛋白酶。劉穎[23]通過(guò)PCR方法，對(duì)RA進(jìn)行9種常見(jiàn)氨基糖苷類(lèi)鈍化酶基因的檢測(cè)，檢測(cè)到ant(3")-I基因。蔡秀磊[24]在22株臨床分離的RA中，檢測(cè)到編碼核苷轉(zhuǎn)移酶的aadA5、aadA1基因和編碼酰基轉(zhuǎn)移酶的aac6-II基因。Sun等[18]通過(guò)PCR方法，對(duì)103株RA氨基糖苷類(lèi)藥物的鈍化酶基因進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如下：共發(fā)現(xiàn)了6種氨基糖苷類(lèi)藥物的鈍化酶基因，包括aph（3'）-VII、aadAl、aadA2、aac（3'）-IV、aac(3')-IIc、aac(6')Ib。此外，楊芳芳[25]采用PCR方法，從2005-2006年臨床分離到的38 株RA中檢測(cè)出了ant(3")-Ia、aac(6')-Ib和aph(3')IIa這3種氨基糖苷類(lèi)鈍化酶基因，且其核苷酸的同源性與大腸桿菌和沙門(mén)菌中的氨基糖苷類(lèi)耐藥基因核苷酸的同源性很高。在此基礎(chǔ)上，李翠[26]將氨基糖苷類(lèi)敏感株E.coli8099與氨基糖苷類(lèi)耐藥株RA P3進(jìn)行混合培養(yǎng)，獲得了氨基糖苷類(lèi)耐藥結(jié)合子大腸桿菌E1，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)合子從RA P3菌株中獲得了編碼氨基糖苷類(lèi)乙酰轉(zhuǎn)移酶aac6-I基因，說(shuō)明aac6-I導(dǎo)致的氨基糖苷類(lèi)耐藥可在RA與E.coli之間水平傳播。

4.2 滅活氯霉素的乙酰轉(zhuǎn)移酶cat基因可編碼乙酰轉(zhuǎn)移酶，催化乙酰輔酶A乙?；芰Γ瑥亩淖兟让顾氐姆肿咏Y(jié)構(gòu)，最后形成1，3-二乙酸氯霉素，導(dǎo)致氯霉素失去抗菌活性[27]。蔡秀磊[24]在22株臨床分離的RA中，檢測(cè)到catB3基因。Huang等[28]通過(guò)PCR方法，對(duì)192株RA分離株進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果表明：有69株RA攜帶catB3基因，其中RA-CH-2攜帶有2個(gè)拷貝的catB3基因（G148_1769和G148_1772），作者利用自殺載體pRE112進(jìn)行同源重組使catB3基因缺失，并測(cè)定突變株對(duì)氯霉素的MIC，結(jié)果表明：當(dāng)這兩個(gè)基因同時(shí)缺失時(shí)，RA-CH-2對(duì)氯霉素的敏感性增強(qiáng)了8倍，說(shuō)明catB3基因與RA對(duì)氯霉素的耐藥性相關(guān)。

4.3 滅活林可酰胺類(lèi)藥物的核苷酸轉(zhuǎn)移 核苷酸轉(zhuǎn)移酶是調(diào)控DNA合成和修復(fù)的關(guān)鍵酶和限速酶，可催化4種核糖核苷酸還原，生成相應(yīng)的脫氧核糖核苷酸。Luo等[29]首次證明RA-CH-2中G148_1775基因，所編碼的蛋白是一種新型的林可酰胺核苷酸轉(zhuǎn)移酶，與其他報(bào)道中林可酰胺核苷酸轉(zhuǎn)移酶的同源性小于41%；通過(guò)體外動(dòng)力學(xué)測(cè)定，表明該蛋白可以抑制林可酰胺類(lèi)藥物的抗菌活性，從而使RA對(duì)該類(lèi)藥物產(chǎn)生高水平的耐受性；此外，作者還發(fā)現(xiàn)G148_1775基因可通過(guò)轉(zhuǎn)化的方式，使ATCC 11845對(duì)林可霉素和克林霉素的MIC分別增大512倍、32倍，猜測(cè)該基因的廣泛存在，是RA對(duì)林可酰胺類(lèi)藥物普遍耐受的主要原因。

4.4 滅活四環(huán)素類(lèi)藥物的氧化還原酶 產(chǎn)生滅活四環(huán)素類(lèi)藥物的氧化還原酶是病原菌對(duì)四環(huán)素類(lèi)藥物（四環(huán)素、米洛環(huán)素、多西環(huán)素、替加環(huán)素等）具有耐受性的主要原因之一，其中以tetX基因?yàn)榇?。Li等[30]利用轉(zhuǎn)座子隨機(jī)突變技術(shù)，使編碼氧化還原酶的M949_0459基因（tetX同源基因）失活，通過(guò)對(duì)比CH3及其突變株對(duì)替加環(huán)素的MIC，證明了RA氧化還原酶可增強(qiáng)CH3對(duì)替加環(huán)素的抵抗性。此外，Zhu等[31]發(fā)現(xiàn)RA菌株中tetX基因存在水平轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，可使四環(huán)素敏感株變成耐藥株。

5 產(chǎn)生修飾酶

erm基因編碼的核糖體甲基化酶可以使病原菌核糖體亞基甲基化，從而導(dǎo)致大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物不能與其作用靶位點(diǎn)結(jié)合。Luo等[32]通過(guò)PCR方法對(duì)206株RA進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有64株RA攜帶有編碼核糖體甲基轉(zhuǎn)移酶的ermF基因，基因缺失實(shí)驗(yàn)證明，ermF基因的缺失會(huì)增強(qiáng)RA對(duì)林可酰胺類(lèi)抗菌藥物和大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗菌藥物的敏感性，使RA對(duì)紅霉素、阿奇霉素、泰樂(lè)新和林可霉素的MIC分別降低1024、1024、4和2048倍。Xing等[33]同樣證實(shí)了由ermFU基因或ermF基因編碼的甲基化酶是導(dǎo)致RA對(duì)紅霉素耐藥的主要機(jī)制之一；此外，他還發(fā)現(xiàn)與其他病原菌一樣，RA攜帶的ermF和ermFU基因也可增強(qiáng)對(duì)大環(huán)內(nèi)酯-林可酰胺-鏈球菌B組抗生素的耐藥性[34]。

6 小結(jié)

近年來(lái)，病原菌耐藥性的出現(xiàn)和傳播已成為公共衛(wèi)生領(lǐng)域日益嚴(yán)重的問(wèn)題。除某些病原菌具有固有耐藥性，能對(duì)某些種類(lèi)的抗生素具有天然的耐藥性，許多敏感菌也可通過(guò)環(huán)境誘導(dǎo)基因突變及耐藥基因水平轉(zhuǎn)移的方式獲得耐藥性。流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，RA耐藥菌株分離率逐年上升，但現(xiàn)有研究文獻(xiàn)多偏重耐藥表型分析，對(duì)于RA耐藥機(jī)制的研究不夠全面。綜合相關(guān)文獻(xiàn)，我們可以看出RA對(duì)抗菌藥物產(chǎn)生耐藥性是多種因素共同作用的結(jié)果，但是這些機(jī)制在生物體內(nèi)共同作用的過(guò)程是一個(gè)極其復(fù)雜的生理生化過(guò)程，對(duì)于這一方面的研究仍然任重而道遠(yuǎn)。進(jìn)一步研究RA對(duì)各種藥物的耐藥機(jī)制，不僅有利于預(yù)防和治療RA感染、指導(dǎo)獸醫(yī)合理應(yīng)用抗生素，同時(shí)還可為研發(fā)新型藥物、制定有效治療方案提供理論依據(jù)。