基于元素分析―同位素質譜法研究枇杷蜂蜜成熟過程中穩(wěn)定碳同位素比值變化規(guī)律

季美泉 丁 濤 趙 灤 費曉慶* 吉 挺 王心怡 陳 磊 林 宏 胡國紳 李賢良韓 芳 閆景升

（1.南京海關動植物與食品檢測中心，南京 210019; 2.揚州大學 動物科學與技術學院，揚州 225000; 3.東南大學成賢學院，南京 210088;4.重慶海關技術中心，重慶 400020; 5.合肥海關技術中心,合肥 230000; 6.江蘇經(jīng)貿職業(yè)技術學院，南京 200002）

1 前言

蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露，與自身分泌物混合后，經(jīng)充分釀造而成的天然甜物質[1]。枇杷花蜜作為中蜂蜂蜜的重要冬季蜜源，花蜜充足且花期長。枇杷蜂蜜就是由蜜蜂采集枇杷花蜜釀造而成。依據(jù)蜂蜜的采集和釀造時間，可分為未成熟蜂蜜與成熟蜂蜜。中華蜜蜂采集釀造出的成熟枇杷蜜具有更優(yōu)的品質[2]；其具有濃郁的苦杏仁芬芳，優(yōu)越的口感，優(yōu)良的抗菌性，潤肺止咳、調節(jié)胃腸道功能、增強免疫力等較好的保健作用[3]。而利用未成熟蜂蜜制造假成熟蜜獲得更高收益的行為，在近些年變得最為常見。為了使未成熟蜂蜜中的水分、總糖含量等基本指標達標，對蜂蜜進行高溫加熱脫水處理但是加熱過程破壞了蜂蜜中的活性物質，產(chǎn)生了美拉德反應產(chǎn)物的同時，嚴重影響蜂蜜的營養(yǎng)價值[4]。蜂蜜的釀造過程是復雜的生物轉化過程，目前已有對蜂蜜成熟過程中水分、酸度、糖類含量及酶值等物質變化規(guī)律的研究[5-10]。穩(wěn)定碳同位素比值在蜂蜜的真假鑒別上運用的比較成熟[11-13]，但尚未有對蜂蜜成熟過程中穩(wěn)定碳同位素比值變化的相關研究。

本研究擬建立EA-IRMS 法研究枇杷蜂蜜成熟過程中穩(wěn)定碳同位素比值變化規(guī)律，為枇杷蜂蜜成熟過程的研究提供技術支撐，為枇杷蜂蜜的品質評價提供數(shù)據(jù)參考。

2 材料與方法

2.1 實驗材料

2021年12月，在江蘇省蘇州市吳中區(qū)西山枇杷園區(qū)，正值枇杷盛花期，中華蜜蜂負責枇杷蜜的采集工作。選擇枇杷園內的蜂場作為采樣點，隨機選取5群蜂群群勢比較接近的中華蜜蜂作為取樣對象，每個蜂箱內有5張巢脾；樣品采集前清空巢脾。每一張巢脾都取出進行標記（標記是否有進蜜），直至整張巢脾都儲滿蜂蜜。每天按照標記的巢房進行取樣，用5mL的一次性吸管吸取。5個蜂箱編號A~E，每天1個蜂箱取1次，共計18天 90 個枇杷蜜樣品，樣品采集情況見表1，其中12月27日起巢蜜已經(jīng)封蓋。枇杷花蜜樣品直接吸取于處于盛花期的枇杷花，共計6個枇杷花蜜樣品。2021年成熟枇杷蜜樣品2個，采于枇杷園內的蜂場。枇杷蜂蜜和枇杷花蜜樣品于4 ℃貯存直至分析。

天氣溫度記錄方式：天氣情況在每日取樣前進行記錄，記錄的是當天的外部環(huán)境溫度，情況見表1。

表1 成熟過程中枇杷蜂蜜樣品信息

2.2 儀器與試劑

元素分析儀與穩(wěn)定同位素質譜儀 (Thermo公司，穩(wěn)定同位素質譜儀型號DELTA PLUS)，用于測定蜂蜜和花蜜的δ13C值；純水儀（ Milli-Q， Millipore 公司），提供超純水用來溶解蜂蜜。

標準物質： Beet Sugar（IA-R005，δ13C值為-26.03‰，Sercon）；錫杯：5×3.5 mm（Element microanalysis公司）。

2.3 實驗方法

2.3.1 樣品前處理條件

EA-IRMS測定的樣品前處理：稱取約2g樣品于50mL 離心管中，加20 mL蒸餾水溶解，5000r/min離心5 min后取上清液1mL于1.5mL 離心管中，待測。

2.3.2 元素分析-同位素質譜儀條件

元素分析儀的氧化管溫度為950 ℃，還原管溫度為680℃，氣相色譜柱爐溫為50 ℃，氦氣流速為120 mL /min，吹掃氣流速為120 mL /min，氧氣流速為250 mL /min。每個樣品平行測定兩次。進行樣品測試時，每個樣品的分析起始階段通入CO2參考氣。

δ13C值的計算是基于國際標準物質Vienna peedee belemnite standard (VPDB)， 計算公式為：

這里R為同位素比率13C/12C，RVPDB= 0.0112372。

參考氣使用前，用已知δ13C值的標準物質Beet Sugar對CO2參考氣進行反標定，要求所測定的δ13C值與證書標示值相差小于0.30‰?；跇藴饰镔|比較稀有，樣品分析時采用質控樣來對儀器分析準確性評價。本實驗選取蜜二糖（melibiose）作為分析測定的質控樣，其標定結果為?25.08‰。

3 結果與分析

3.1 前處理條件的優(yōu)化

GB/T 18932.1?2002中對于蜂蜜樣品采用過尼龍濾布過濾的方式去除蜂蜜中固體雜質，后用移液器吸取3 μL 蜂蜜于錫杯中。枇杷蜂蜜采樣時，按照標記的巢房進行取樣，用5mL的一次性吸管吸取多個標記的蜂房，取滿20mL。而蜜蜂在釀蜜過程中是把花蜜攤薄在蜂巢壁上（這樣可以增加蒸發(fā)面積，水分蒸發(fā)快，能夠降低蜂蜜的水分），這期間也許會將蜂蜜在不同的巢房之間重新分配[14]。為了使測定更準確、更有代表性，本研究采取純水溶解的方式。同時，由于枇杷蜂蜜中的蛋白質和花粉，會對蜂蜜的碳同位素比值（δ13CH值）產(chǎn)生影響[3]，本研究通過5000r/min離心5 min可去除花粉等雜質，取上清液減少干擾，測定時用移液器吸取0.6 μL于錫杯中，密封備用。

3.2 EA-IRMS對枇杷蜂蜜的檢測

首先采用EA-IRMS法對90個枇杷蜂蜜樣品測定，記錄的碳同位素比值δ13CA、δ13CB、δ13CC、δ13CD、δ13CE，并計算每天的δ13C均值δ13Caverage，數(shù)據(jù)匯總見表2；用EA-IRMS法對6個枇杷花蜜樣品測定，δ13C值分別為：?27.51‰、?27.43‰、?27.37‰、?27.56‰、?27.49‰、?27.48‰，均值為，?27.47‰；用EAIRMS法對2021年東山、西山成熟枇杷蜜樣品測定，δ13C值分別為：?25.30‰、?25.33‰。圖1為某一枇杷蜂蜜的EA-IRMS色譜圖。

表2 EA-IRMS測得枇杷蜂蜜的同位素結果

圖1 一個枇杷蜂蜜的EA-IRMS色譜圖

3.3 蜂蜜δ13C隨釀造天數(shù)變化分析

3.3.1 蜂蜜δ13C隨釀造天數(shù)變化情況

蜂蜜釀造過程是脫除水分、富集與轉化營養(yǎng)物質的復雜生物過程。中蜂的外勤蜂通過口器吮吸枇杷花蜜，將其儲存到蜜囊中，帶入蜂巢，轉移給內勤蜂繼續(xù)釀造[14]。其中枇杷花蜜δ13C值為?27.47‰，當經(jīng)過中蜂采集、釀造、轉移至巢房后δ13C值為?20.21‰至?21.15‰，A~E5個蜂箱1d至18d的δ13C值的極差Δδ13C(max?min）分別為：4.90‰、4.08‰、4.71‰、5.39‰、4.60‰。δ13Caverage隨釀造天數(shù)變化情況見圖2。由圖2可知，從1d至10d的δ13C值下降比較快，而10d至18d的δ13C值小幅度波動下降。由此可見，蜂蜜δ13C值變化與釀造有關。

圖2 δ13Caverage隨釀造天數(shù)變化

3.3.2 各蜂箱間蜂蜜δ13C值釀造天數(shù)變化情況分析

浙西南山區(qū)中蜂蜂蜜封蓋時長可有效提高蜂蜜濃度，封蓋15d后的蜂蜜含水量顯著低于封蓋0d的含水量[15]。而華南地區(qū)中蜂蜂蜜連續(xù)9年研究結果顯示表明，華南地區(qū)在其特定的地域、氣候、蜜源條件下，自然成熟封蓋的中蜂原蜜水分含量均超過20%[16]。由此可見中蜂蜜蜂的封蓋行為是權衡當時的環(huán)境及蜂蜜狀態(tài)做出的決定。

從表2中看出，A~E 5個蜂箱中δ13C在同一釀造時間的數(shù)值并不完全相同，例如A~E蜂箱6d的δ13C值分別為：?23.10‰、?21.22‰、?23.94‰、?21.76‰、?22.09‰，最大差值達到2.72‰ 。這可能是由中華蜜蜂在釀蜜期間將蜂蜜在不同的巢房之間重新分配[14]，使得不同釀造時間的蜂蜜混到一起導致的。

3.3.3 各蜂箱內在蜂蜜封蓋后其蜂蜜δ13C情況分析

蜜蜂將采集來的枇杷花蜜利用自身的生物酶釀造，將枇杷花蜜充分酶解轉化，把花蜜水分蒸發(fā)后分泌蜂蠟，將釀好的蜂蜜封蓋，此時一般意義上認為蜂蜜成熟了。然而許政等發(fā)現(xiàn)此時的釀造好的蜂蜜在封蓋房里在蜂巢蜜并沒有完全成熟還存在釀造后熟轉化的過程[17]。本次研究采集的枇杷蜜在14d時已封蓋，從14d至18d所取的枇杷蜜樣品均為封蓋蜜樣品。通過表2我們知道，枇杷蜜δ13C 的值還在變化，A~E蜂箱14d至18d時間范圍內δ13C值的極差值Δδ13C(max?min)1分別為：1.46‰、0.47‰、0.80‰、1.17‰、1.00‰，見表3。而成熟蜜多次測定結果的絕對差值一般不超過0.30‰，由此說明封蓋蜜并沒有完全成熟，還存在釀造后熟轉化的過程。

表3 EA-IRMS測得封蓋枇杷蜂蜜的同位素結果

4 結論

通過研究證明枇杷蜂蜜δ13C值是跟其成熟過程相關的。枇杷蜂蜜δ13C值隨著釀造時間的推移，由?20.71‰降低至?25.16‰，最終可能趨于成熟枇杷蜜的?25.30‰左右。封蓋時期δ13C值的極差值Δδ13C(max?min)1遠大于成熟枇杷蜜多次測定的差值0.30‰，說明封蓋蜜并沒有完全成熟，還存在釀造后熟轉化的過程。本研究為確定枇杷蜂蜜的合理采收期及鑒別成熟枇杷蜜提供了數(shù)據(jù)支撐。