膽道閉鎖實驗動物模型的比較

韓曉燕,邱建利

(1.河南中醫(yī)藥大學,鄭州 450046;2.河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院兒科,鄭州 450000)

膽道閉鎖(biliary atresia,BA)是新生兒期一種進行性的、可導致肝內外膽管纖維阻塞性的膽管病變[1]。我國臺灣的發(fā)病率約為1.5/10000,高于美國及歐洲國家[2]。本病如不及時治療,可引起肝硬化及終末期肝衰竭,一般2歲之前死亡[3]。依據其梗阻部位可以分為3型,其中Ⅲ型病例發(fā)病率在90%以上[4]。BA的病因可能包括遺傳和環(huán)境兩方面因素,其中全基因組研究顯示:GPC1、ADD3以及ARF6基因在本病的發(fā)病中起到一定的作用[5-7];環(huán)境因素包括圍生期病毒感染以及環(huán)境毒素暴露相關[8],目前在患兒體內可以分離到的病毒包括巨細胞病毒(CMV)、人皰疹病毒、人乳頭瘤病毒、腺病毒、EB病毒、乙型肝炎病毒、呼腸孤病毒、細小病毒B19和輪狀病毒(RV)。其中呼腸孤病毒、巨細胞病毒和輪狀病毒目前研究較多[9]。本病的發(fā)病機制尚未完全闡明,相關研究表明CD68+巨噬細胞、以及分泌細胞因子IFN-γ的CD4+、CD8+T淋巴細胞在膽管上皮及匯管區(qū)的聚集提示本病的發(fā)病機制可能是病毒相關的免疫損傷[10]。Kasai術的出現(xiàn)在一定程度上改善了患兒的黃疸癥狀,但不僅給患兒造成較大的傷害,同時也給家庭帶來沉重的經濟壓力及心理負擔,影響著家庭的和諧穩(wěn)定[11]。本病已不僅僅是一個簡單的醫(yī)學問題,更是一個亟待解決的社會問題。因此,提高對本病具體發(fā)病機制的認知以及預防本病的發(fā)生顯得尤為重要。動物模型作為現(xiàn)代醫(yī)學研究疾病的基礎,因其可控性強、來源廣泛等優(yōu)點,為探索疾病病因及發(fā)病機制提供條件,BA模型的成功構建是研究本病的關鍵。目前,國內外醫(yī)學界對BA及其動物模型的認知在逐步加深,為進一步促進了解,本文對近些年的相關動物模型進行總結,以期對本病的研究提供幫助。

1 膽總管結扎BA模型

BA患兒主要由于各種病因導致的新生兒膽汁流受阻引起膽汁淤積,進而引起肝纖維化、肝硬化甚至終末期肝病的發(fā)生。葛軍濤等[12-13]采用新生BALB/c小鼠膽總管結扎的方法模擬膽道閉鎖,其在發(fā)病時間上較為相似,該模型術后第2天就會出現(xiàn)皮膚變黃隨、陶土樣大便,并伴隨生長發(fā)育的遲緩、精神不振以及食欲不振等消化道癥狀;這在一定程度上和膽道閉鎖患兒的臨床癥狀較為相似,該模型的優(yōu)點在于結扎膽總管的方法操作相對簡單、易于重復、建模周期短;并且采用新生鼠與本病臨床的發(fā)病年齡較為相似;但該動物模型也存在一些缺點:首先,膽總管結扎術后一般1周左右動物開始出現(xiàn)死亡,且在第10天出現(xiàn)死亡高峰,解剖后并未發(fā)現(xiàn)嚴重肝硬化以及肝衰竭的表現(xiàn),這與臨床上BA患兒終末期均會出現(xiàn)門靜脈高壓、食管靜脈曲張以及腹水等肝硬化失代償以及肝衰竭的表現(xiàn)不符;其次,BA患兒在生后一般就會出現(xiàn)膽汁淤積的表現(xiàn),因此我們可以認為在胎兒期已經出現(xiàn)膽管的損傷,其機制可能是多方面的,而膽總管結扎的方法出現(xiàn)的膽汁淤積是以健康小鼠的在體實驗,與實際的病因存在較大的差異,發(fā)病機制也完全不同,因此不能很好的解釋本病的真實病因。

另外,膽總管結扎構建膽道閉鎖模型的方法也由來已久,早在1957年Symeonidis等[14]報道了切除和簡單結扎總膽管后觀察大鼠肝功能和形態(tài)變化,但未能模擬出膽道閉鎖出現(xiàn)的臨床癥狀,對現(xiàn)在的模型構建參考意義不大,不再贅述。張守華等[15]通過對Balb/c小鼠開腹后游離膽總管,并進行雙重結扎的方法構建梗阻性黃疸模型研究其病因及病理生理機制,結果顯示白細胞及中性粒細胞變化和實際膽道閉鎖患兒較為相似,但該方法采用的是5～6周齡的成年小鼠,和膽道閉鎖發(fā)生的時間相差甚大,不能很好的模擬該病的發(fā)病時間。另外,其結扎膽管后第7天可以見到肝細胞片狀壞死,廣泛性的空泡樣變性,但是并未出現(xiàn)肝假小葉、腹水等肝硬化的征象,因此,也不能很好的模擬真實世界的膽道閉鎖。

2 毒素誘導BA模型

如前所述,BA的確切病因目前尚不清楚,環(huán)境因素可能參與其中。早在1990年澳大利亞學者Harper等[16]和Kopp等[17]發(fā)現(xiàn)當地羊和牛的幼崽在出生后大量死亡,且表現(xiàn)為表現(xiàn)為膽汁淤積癥狀,而他們的母親及成年動物未出現(xiàn)癥狀,且死亡的幼崽肝病理結果顯示為慢性肝損傷,伴有門靜脈周圍小管增生、進行性纖維化、偶爾小管斷裂、局灶性肝細胞壞死和最終肝硬化。在犢牛中觀察到的更嚴重的損傷可能反映了膽汁淤積或暴露于損傷的更長時間,或者可能反映了物種差異。形態(tài)學檢查不能確定是原發(fā)的肝內膽管的缺乏還是繼發(fā)于肝外膽道閉鎖,或同時影響肝外和肝內膽管的伴隨病變。在探索病因中發(fā)現(xiàn),在排除遺傳及感染等因素后,這些牛和羊在懷孕期間可能進食了藻類等植物引起膽道的損傷,而這些植物可能是含有某些毒素[16]?；诖?近年來國外的研究團隊采用斑馬魚膽汁分泌實驗,從這些植物中提取出一種新型的可以導致膽管損傷的化合物“異黃酮,膽甾烯”[8];這種化合物可對斑馬魚幼體的肝外膽管系統(tǒng)造成選擇性破壞,但對肝內膽管系統(tǒng)沒有影響。該研究還發(fā)現(xiàn)斑馬魚基因組中一個區(qū)域的突變可以增強膽甾烯毒性,該區(qū)域與已建立的人類BA易感性基因座具有保守的同源性。該毒素還導致培養(yǎng)的新生小鼠肝外膽管細胞纖毛喪失,并破壞膽管細胞的細胞極性和上皮細胞的完整性[18-19]。而我國學者也采用化學合成的“膽閉素”在斑馬魚動物模型中得到與上述一致的實驗結果[20]。綜上所述,這些發(fā)現(xiàn)為BA的病因提供了直接的證據,表明BA可能是由圍產期暴露于環(huán)境毒素以及可能的基因突變參與其中引起的。

3 輪狀病毒誘導型

3.1 輪狀病毒誘導BA模型

20世紀70年代,人們首次提出圍生期病毒感染是新生兒阻塞性膽管疾病的根本原因,其中包括BA[21]。在隨后的幾項研究也發(fā)現(xiàn),在BA患兒的肝中可見多種病毒的存在,包括輪狀病毒[22]、呼腸孤病毒[23]、巨細胞病毒[24]和人乳頭瘤病毒[25],然而,在所有的患兒肝標本中并未發(fā)現(xiàn)存在單一病毒。最近的研究表明,與CMV-IgM陰性病例相比,IgM陽性的BA患者預后較差,并且這些陽性病例具有獨特的臨床和病理表現(xiàn),通常對Kasai術反應較差。目前一個統(tǒng)一的觀點認為各種宮內或圍產期感染是引起B(yǎng)A臨床表現(xiàn)的病因。感染誘導的這些損傷觸發(fā)宿主的免疫反應,導致膽道進行性的破壞[26]。功能基因組學研究發(fā)現(xiàn),淋巴細胞分化相關基因的協(xié)同活化與細胞因子的過度表達使其在細胞免疫的激活中起著重要作用[27]。隨后的研究也表明巨噬細胞、樹突細胞和自然殺傷細胞在疾病發(fā)病機制中的重要性[28-30].

1993年首次描述的BA小鼠模型支持病毒是膽道閉鎖發(fā)病機制中重要證據,并已成為研究BA的重要工具[31]。在該模型中,采用恒河猴輪狀病毒(RRV)感染新生BALB/c小鼠會導致類似于人類BA的膽管炎性和病理表型,特征包括:(1)進行性阻塞性黃疸,表現(xiàn)為膽紅素尿、黃疸、陶土樣大便、生長發(fā)育遲緩,病最終導致死亡;(2)膽管樹的形態(tài)學和組織學變化與嬰兒期BA相似[32];(3)新生兒病毒感染的時間和臨床表現(xiàn)時間上的相關性[33-34]。Jafri等[35]之前研究發(fā)現(xiàn)膽管上皮細胞感染RRV后,膽管細胞內內信號傳導在輪狀病毒細胞內復制起到關鍵的作用。膽管細胞在收到RRV感染后,會釋放趨化因子啟動免疫介導的膽管阻塞[36]。最近的研究也發(fā)現(xiàn),RRV的VP4基因在發(fā)病機制中起著主要決定因素,VP4蛋白中的肽序列(SRL)在疾病發(fā)病機制中起重要作用[37]。這種特定的肽也存在于已知與人類BA相關的其他病毒中,如巨細胞病毒、呼腸孤病毒和Epstein-Barr。病毒通過這種肽與宿主細胞的結合引發(fā)不同的炎癥途徑,導致疾病的發(fā)病[38]。這些數據表明BA的發(fā)生與病毒感染存在相關性。因此,阻斷這些途徑可能有助于抑制疾病的發(fā)展。因此,輪狀病毒誘導的BA是研究BA發(fā)病機制的具有良好特征的重要模型。但是,不幸的是,雖然恒河猴輪狀病毒(RRV)感染新生幼鼠可以誘導與人類BA相似的膽管病變,并已用于研究該疾病的機制,但幾乎所有被RRV病毒感染的幼崽在出生后第14天都會死亡,這個時期肝纖維化及肝硬化尚未形成,研究該期的機制將不可能實現(xiàn),因此RRV誘導的BA模型依然存在缺陷[39]。

3.2 輪狀病毒重配株誘導的BA模型

隨著對BA研究的不斷深入,以及RRV誘導的新生乳鼠膽道閉鎖模型的日臻成熟,在一定程度上揭示了膽道閉鎖的可能發(fā)病機制,但令人遺憾的是該模型乳鼠存活的時間一般不超過14d,其肝組織并未形成纖維化或硬化[39],這與臨床表型存在較大的差別。為進一步優(yōu)化該動物模型,使其更能反映BA的表型,從而揭示其內在機制,為預防和治療該病提供基礎,Mohanty等[39]的研究發(fā)現(xiàn)RRV的VP4基因在BA的發(fā)病機制中起著重要作用,且VP2也起著一定的作用[40]。通過單基因重組的方法將RRV的VP4及VP2基因替換到TUCH的基因組,然后將重組的TR(VP2,VP4)接種到4d齡新生鼠,可以誘導產生BA的肝纖維化(Ishak分級3～5級)。眾所周知,肝纖維化與膽汁淤積相關,而且在匯管區(qū)周圍可以看到Mallory小體,同樣,肝膽管周圍的膽管細胞的增殖常常引起肝硬化的出現(xiàn),有意思的是膽管增殖也是Kasai術預后不好的表現(xiàn)。而TR(VP2,VP4)誘導的肝纖維化與BA患兒的肝組織及肝外膽管有著相似的組織病理學特征,意味著該方法建立的肝纖維化小鼠模型可以用來研究人類疾病。目前研究肝硬化的動物模型較多,其中主要有以CCl4為代表的藥物可以引起肝炎癥,活化肝星狀細胞,高脂飲食誘導的非酒精性肝病引起的肝硬化,以及膽管結扎引起的膽管機械性梗阻導致的肝纖維化[41]。這些均和BA引起的膽汁淤積導致的肝纖維化存在本質差異,并且在組織學上也存在不同的病理特征[42]。例如,膽管結扎的方法雖然可以引起肝纖維的表型,但是沒有像BA患兒的匯管-匯管以及匯管-中央橋接纖維化以及結節(jié)的病理表現(xiàn),可能由于大鼠不能夠存活至肝組織病理表現(xiàn)為Ishak分級的2級的時間[43],而TR(VP2,VP4)誘導的鼠肝纖維化模型其組織學特征與人類BA的病理特征極為相似,表現(xiàn)為膽汁淤積引起的膽管增殖,橋接以及結節(jié)形成[44]。雖然TR(VP2,VP4)病毒不能完全誘導肝外膽管的梗阻,但是可以表現(xiàn)為跳躍病變以及部分阻塞,其余和BA患兒的表現(xiàn)相似[45]。另一方面,相關研究表明MMP-7的血清水平被用作診斷BA的一個生物學標志物,這個發(fā)現(xiàn)也被其他的研究證實[46]。而且BA患兒肝組織免疫組化提示肝外膽管細胞中MMP-7升高,并且其肝以及肝內膽管細胞中MMP-7的基因表達也在升高,有意思的是小鼠在TR(VP2,VP4)病毒在接種2周后也會出現(xiàn)MMP-7的升高,雖然MMP-7在BA的發(fā)病機制中的作用尚不明確,但如果是,則可能是治療的一個靶點[47]。另外,轉錄組分析證實了這種小鼠模型和人類BA的基因表達模式相似。目前也有研究正在采用基因敲除的方法研究纖維化的機制。確定疾病的機制基礎有助于治療的發(fā)展[39]。

綜上所述,膽道閉鎖是新生兒時期一種膽管細胞進行性損傷的,且可以進展為肝纖維化甚至終末期肝衰竭的疾病。其病因復雜,包括圍生期病毒感染、免疫紊亂等,目前輪狀病毒感染是目前學術界較為認可的病原,因此,基于此的模型是研究者不斷探索其發(fā)病機制的方向。目前,人們雖然通過臨床流行病學以及動物模型研究等多種途徑對本病有較多的了解,但對疾病的本質認識還遠遠不夠。充分發(fā)揮與臨床實際相符的動物模型是研究本病原因及治療方法的最佳方案。當前諸多的動物模型中采用病毒基因重組的方法與臨床較為相似,但不能完全模擬人體,需要我們進一步去探索。