次氯酸鈉消毒劑在環(huán)境微生物消殺方面的應(yīng)用

李志鋼

（帝森福德（北京）國際環(huán)境科技有限公司，北京 100020）

如今，消費(fèi)者更加意識到營養(yǎng)與健康之間的關(guān)系，消費(fèi)者通常認(rèn)為健康的食品是水果和蔬菜。食品加工商和零售企業(yè)都預(yù)測到了這一市場趨勢，提供范圍廣泛的包裝鮮切蔬菜，并將這些產(chǎn)品定位為結(jié)合“健康”和“便利”的絕佳替代品。與此同時，鮮切產(chǎn)品的銷售數(shù)據(jù)也大幅增長。鮮切農(nóng)產(chǎn)品銷售，盡管卷心菜和萵苣因其高機(jī)械和生理脆弱性而難以加工，但它廣泛存在于水果沙拉中。由于它在進(jìn)入加工鏈的那一刻就已經(jīng)受到微生物的嚴(yán)重污染，一些加工程序（例如切碎）甚至?xí)黾游⑸锟倲?shù)。盡管在鮮切蔬菜回收的微生物是造成蔬菜腐爛的主要原因，但受到單核細(xì)胞增生等病原體的污染，依然會對消費(fèi)者身心健康帶來風(fēng)險。減少病原體存在或延長鮮切產(chǎn)品保質(zhì)期的潛在策略之一是在加工過程中實(shí)施去污和消毒步驟。

除了實(shí)現(xiàn)微生物減少外，在評估凈化過程的充分性時，還應(yīng)考慮對其他質(zhì)量屬性（如感官質(zhì)量和營養(yǎng)成分）的影響。一般來說，外觀是消費(fèi)者在決定接受包裝的葉類蔬菜時評估的最重要的屬性。與鮮切卷心菜和萵苣相關(guān)的最常見的質(zhì)量問題之一是切邊褐變。鮮切生菜制備過程中的切口會導(dǎo)致苯丙烷代謝酶的合成、酚類化合物的合成和積累，導(dǎo)致褐變的出現(xiàn)。據(jù)說去污劑（例如二氧化氯）具有氧化特性，可以誘導(dǎo)褐變，具有與酶促褐變相同的模式特征。

由于維生素C 和E 等維生素以及類胡蘿卜素和酚類物質(zhì)等次生代謝物的存在，水果和蔬菜，尤其是萵苣對健康有益，水果和蔬菜的攝入量與預(yù)防動脈粥樣硬化、癌癥、糖尿病和關(guān)節(jié)炎等疾病之間存在正相關(guān)關(guān)系。

1 消殺方案

關(guān)于去污對初加工卷心萵苣營養(yǎng)成分的影響，有研究表明：臭氧水和氯對生菜維生素C 含量的影響受儲存時間的影響比洗滌的影響更大。雖然一些研究包括去污對萵苣的營養(yǎng)價值的影響，大多數(shù)集中在微生物和感官品質(zhì)上。本研究的目的是評估除水洗外，使用不同濃度水平下的次氯酸鈉對降低微生物負(fù)荷的能力。

卷心萵苣購自當(dāng)?shù)嘏l(fā)企業(yè)，在30min 內(nèi)被運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室。到達(dá)后，生菜通過去除外葉和內(nèi)核并用鋒利的刀將其切成1cm 的絲進(jìn)行人工加工。由于實(shí)際限制，使用在不同時間購買的不同生菜頭來測試不同的去污劑。因此，為了研究特定消毒劑對特定參數(shù)的影響，每個實(shí)驗(yàn)都包括一個對照系列（未洗過的生菜）和用水洗過的生菜系列。將大量100g 卷心萵苣在1L 消毒劑溶液中在 16～18℃下在軌道搖床上連續(xù)攪拌處理5min。在次氯酸鈉處理之前用16～18℃自來水進(jìn)行1min的洗滌，再在1min 內(nèi)通過手動廚房離心機(jī)去除過量的自來水或消毒劑溶液。

（1）用不同的消毒劑溶液處理農(nóng)產(chǎn)品，液體試劑在2種濃度下進(jìn)行了測試，從實(shí)用的角度來看，最低濃度更為重要；最高值用于評估其對營養(yǎng)成分的影響是否與濃度有關(guān)。對照組對應(yīng)于未清洗的鮮切卷心萵苣。用飲用水沖洗切好作為參考處理。從次氯酸鈉水溶液開始，在酸性環(huán)境中進(jìn)行碘量滴定后，制備具有適當(dāng)濃度的溶液。最后，用鹽酸將pH值調(diào)節(jié)到6.00。每天通過碘量滴定法測定次氯酸鈉溶液的濃度。

（2）利用氣態(tài)二氧化氯處理微加工卷心萵苣以及測定液相和氣相中的二氧化氯濃度。在專門設(shè)計的處理室中用氣態(tài)二氧化氯處理2kg 鮮切卷心萵苣。從1000mg/L 二氧化氯溶液開始，在30s 內(nèi)通過空氣鼓泡將二氧化氯氣體從溶液中提取，然后通過管道將氣體通入機(jī)柜。此外，在室溫和1.0%的相對濕度下，萵苣與氣體接觸9.5min。定期從處理室中抽取氣體樣本，用以監(jiān)測處理過程中二氧化氯氣體濃度的變化。處理完成后，打開柜門取樣分析，二氧化氯氣體濃度的測定采用碘量滴定法。

（3）無菌環(huán)境取出30g 卷心萵苣樣品并轉(zhuǎn)移到無菌袋中，用生理鹽水溶液，在30℃孵育3 天后，對菌落形成單位進(jìn)行計數(shù)和感官分析，以確定產(chǎn)品之間是否存在由于應(yīng)用去污處理而導(dǎo)致的感官質(zhì)量差異。在60min 內(nèi)，在4℃下處理樣品并將其轉(zhuǎn)移到塑料封閉容器中，在獨(dú)立的房間進(jìn)行感官評估。對于每個測試，3 個編碼樣本（其中1 個與其他2 個樣本不同）呈給18 名訓(xùn)練有素的小組成員，并且隨機(jī)呈現(xiàn)相同數(shù)量的可能組合。每個小組成員必須評估樣品的整體感官質(zhì)量，選出最差的樣品，并給出選定樣本的原因。

（4）顏色測量作為感官分析的客觀測量進(jìn)行。通過在Spectra Magix 軟件上運(yùn)行并在便攜式分光光度計進(jìn)行顏色測量。1 個2cm 深的塑料培養(yǎng)皿中完全裝滿了卷心萵苣，以防止下面桌面的顏色干擾。關(guān)閉培養(yǎng)皿，通過將儀器觀察口放在蓋子上進(jìn)行測量。為了排除可變的覆蓋表面條件，在顏色測量中包含了鏡面干涉。在一個培養(yǎng)皿上隨機(jī)進(jìn)行10 次測量。

分析期間的所有玻璃制品都被保護(hù)免受日光照射。均質(zhì)化后，在燒杯中分析稱量10g 生菜。加入3 滴消泡劑和50mL 萃取緩沖液后，混合均勻并定量轉(zhuǎn)移至100mL 容量瓶。然后，用萃取緩沖液將燒瓶的內(nèi)容物稀釋至100mL。在折疊過濾器上過濾后，將10mL 濾液放入含有200mg 酸洗活性炭的試管中。在30s 內(nèi)劇烈搖動試管并在6000g 下離心11min。再次過濾上清液，用蒸餾水稀釋至25mL。通過過濾器過濾后，將5mL 轉(zhuǎn)移到10mL 燒瓶中。隨后，加入1mL鄰苯二胺并用流動水進(jìn)一步稀釋至燒瓶的體積。在此過程中，使用了外部校準(zhǔn)。將10mL 稀釋溶液添加到200mg 酸洗活性炭中。隨后，如前所述遵循該程序。為制備校準(zhǔn)曲線，將 0、0.5、1.0、1.5、2 和2.5mL 濾液與1mL OPD 溶液混合，隨后用流動相稀釋至10mL。每天制作標(biāo)準(zhǔn)曲線以說明熒光響應(yīng)的日常變化。在黑暗中孵育60min 后，通過具有熒光檢測的HPLC 測定。

（5）制備12.5mgβ-胡蘿卜素、17.5mg 反式-β-apo-80-胡蘿卜素和1.0mg 葉黃素在100mL 氯仿中的儲備溶液，儲存在-18℃的琥珀色瓶。從儲備溶液開始，制作工作標(biāo)準(zhǔn)，每周通過測量最大波長處的吸光度來檢查濃度。為制備β-胡蘿卜素、反式-β-apo-80-胡蘿卜素和葉黃素的工作溶液，分別取400μL、400μL 和1mL，在N2 下蒸發(fā)。隨后，β-胡蘿卜素殘基溶液在己烷中得到。

提取過程不包括皂化過程，因?yàn)橹饕念惡}卜素峰和內(nèi)標(biāo)峰與葉綠素峰分離。在分析過程中，通過用鋁箔覆蓋玻璃器皿來保護(hù)樣品免受日光照射。將萵苣樣品用手動攪拌器混合，然后在錐形瓶中對3g 生菜進(jìn)行分析稱重。加入反式-β-apo-80-胡蘿卜醛作為內(nèi)標(biāo)物和35mL 乙醇/己烷后，將樣品充分混合。

隨后，在室溫下在氮?dú)庀逻B續(xù)攪拌提取樣品15min，將混合物在分液漏斗上過濾。折疊的過濾器用35mL 乙醇/己烷混合物洗滌，用12.5mL 乙醇洗滌2 次，最后用12.5mL 己烷洗滌，直到白色殘余物留在過濾器上。然后，將濾液依次用10%氯化鈉和水分別進(jìn)行多次洗滌。在每個洗滌步驟之后，棄去水層。將含有類胡蘿卜素的有機(jī)層在圓底燒瓶中用無水硫酸鈉干燥并在40℃減壓蒸發(fā)直至獲得油樹脂。然后，在氮?dú)庀抡舭l(fā)樹脂直至干燥。將殘留物進(jìn)行超聲處理15s，并通過過濾器儲藏在儲存瓶中。

最后，在流動相中對類胡蘿卜素提取物進(jìn)行適當(dāng)稀釋，并立即進(jìn)行HPLC 分析。不同類胡蘿卜素通過它們的吸收光譜（最大吸收波長和光譜形狀）和極性程度（與它們的洗脫時間相關(guān)）以及葉黃素和β-胡蘿卜素的比較來識別與標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間。為了量化那些沒有商業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的類胡蘿卜素，葉黃素的響應(yīng)因子用于葉黃素，而β-胡蘿卜素的響應(yīng)因子用于胡蘿卜素。每個生菜樣品中內(nèi)標(biāo)（反式胡蘿卜素）的回收率均高于83%。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

以每100g 鮮重的微克數(shù)表示?？寡趸芰νㄟ^鐵還原抗氧化能力技術(shù)測定，通過將25mg 添加到100mL 己烷中來制備儲備溶液，溶液在-18℃避光保存。取4mL 體積并在氮?dú)庀抡舭l(fā)。殘余物10mL 甲醇重新溶解。隨后，在292nm（E1%=76）處讀取R-生育酚標(biāo)準(zhǔn)品和298nm（E1%=87）處的δ-生育酚標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度讀數(shù)。通過測量適當(dāng)發(fā)射波長處的吸光度，每周檢查生育酚的濃度。將樣品混合，并在100mL 錐形瓶中分析稱量5g 樣品。隨后，添加具有0.05%BHT 的50mL 己烷/乙醇（4:1，v/v）。δ-生育酚用作內(nèi)標(biāo)，因?yàn)榫硇娜n苣中不存在δ-生育酚。在室溫下萃取15min 后，混合物在分液漏斗上過濾。

過濾器用25mL 己烷洗滌后，濾液用10mL 水洗滌2 次。有機(jī)層經(jīng)硫酸鈉干燥并在減壓下及在50℃蒸發(fā)直至獲得油樹脂。此外，在氮?dú)庀抡舭l(fā)油樹脂直至干燥。將殘余物用己烷重新溶解，通過小瓶中的0.45μm HPLC 過濾器過濾，并注入用于描述維生素C 測定程序的HPLC 系統(tǒng)中。生育酚（R-和δ-）通過將它們的保留時間和熒光光譜來鑒定。每個生菜樣品中內(nèi)標(biāo)（δ-生育酚）的回收率均高于85%。

為了確定總酚含量，將分析稱重的部分（5g）用50%甲醇水溶液稀釋至50mL，在80℃下振搖2h，然后過濾。提取物一式三份進(jìn)行，并在-20℃下最多儲存24h。將適當(dāng)體積（5mL）的濾液加入100mL 容量瓶中。6min 后加入15mL 的20%碳酸鈉。用蒸餾水稀釋至刻度并搖動，混合物在室溫下避光反應(yīng)2h。

抗氧化能力通過鐵還原抗氧化能力技術(shù)測定。稱取約5g均質(zhì)卷心萵苣并在氮?dú)庀掠?0mL 乙醇/水萃取15min。隨后，將混合物在10℃以5000g 離心15min，并保留上清液。重復(fù)提取過程并通過在10℃下以12000g 離心15min 完成。收集2 種上清液并用95%乙醇調(diào)節(jié)至50mL。最后，過濾上清液并在-80℃的氮?dú)庀聝Υ妗?/p>

FRAP 是通過監(jiān)測在593nm 處由Fe3+- TPTZ 復(fù)合物在pH3.6 下還原為亞鐵形式引起的吸光度變化而獲得的。將100μL FRAP 試劑或醋酸鹽緩沖液（空白）添加到樣品或標(biāo)準(zhǔn)品中。在37℃的20min 內(nèi)，每分鐘測量一次吸光度。通過比較樣品中的吸光度變化與從增加濃度的Fe3+獲得的吸光度變化，獲得FRAP 值。

所有吸光度讀數(shù)均通過微孔板分光光度計使用微孔板管理器軟件，結(jié)果表示為每100g 鮮重的Fe2+微摩爾數(shù)。

3 統(tǒng)計分析

對每種液體處理進(jìn)行了3 次重復(fù)，以研究它們對初始微生物質(zhì)量、類胡蘿卜素和R-生育酚含量以及FRAP 抗氧化能力的影響，而進(jìn)行2 次重復(fù)以評估它們對維生素C 和苯酚含量的影響。對于二氧化氯氣體處理，從一批處理過的蔬菜中隨機(jī)抽取三個樣品。通過使用以下方法分析不同系列（對照、水（參考處理）、低濃度次氯酸鈉、高濃度次氯酸鈉）之間的微生物減少、顏色測量和養(yǎng)分含量的顯著差異（P < 0.05），在3 個或更多重復(fù)可用且滿足正態(tài)性和等方差條件的情況下進(jìn)行方差分析（單向方差分析）。在存在顯著差異的情況下，采用事后多重比較檢驗(yàn)建立均值的多重比較。在非正態(tài)性或不等方差的情況下，使用非參數(shù)等價物。在18 名評估員的情況下，獲得統(tǒng)計顯著性（R=0.05）差異的正確響應(yīng)的臨界數(shù)量是10（25）。

4 結(jié)論

用水、含有4.5 和30mg L-1游離氯的中性、次氯酸鈉（20和200mg L-1）與未清洗的生菜相比，用中性、200mg L-1次氯酸鈉對萵苣進(jìn)行消毒并與二氧化氯氣體接觸，微生物負(fù)荷顯著減少，但高濃度的次氯酸鈉可能會帶來不同的缺點(diǎn)，例如可能形成有害的消毒副產(chǎn)物。從微生物的角度來看，用中性電解氧化水（30mg L-1）與氣態(tài)二氧化氯接觸對鮮切卷心萵苣最有效，而不會影響其感官品質(zhì)。