腫瘤來源外泌體在誘導(dǎo)腫瘤相關(guān)成纖維細胞生成中作用的研究進展

楊浩綜述；趙侃侃，王夢川審閱（南方醫(yī)科大學珠江醫(yī)院 普通外科，廣東 廣州 510282）

外泌體（exosome）是一種由細胞分泌的、直徑約為30～150 nm的囊泡結(jié)構(gòu)，其內(nèi)包含蛋白質(zhì)、DNA和RNA 等物質(zhì)[1-3]。外泌體被不同的細胞（例如腫瘤細胞、免疫細胞、成纖維細胞、造血細胞和上皮細胞等）攝取后，其可與這些細胞進行信息傳遞和物質(zhì)交換[4-6]。目前，現(xiàn)已被證實的外泌體與細胞結(jié)合方式包括兩大類：一是外泌體與細胞膜直接融合；二是外泌體通過細胞表面受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進入細胞內(nèi)[7-10]。在體內(nèi)條件下，腫瘤細胞并非孤立存在，而是存在于腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment，TME）中[11]。TME 由腫瘤細胞、腫瘤間質(zhì)細胞和非細胞成分組成[11-12]，而腫瘤相關(guān)成纖維細胞（cancer-associated fibroblast，CAF）屬于腫瘤間質(zhì)細胞的一種[13-15]。值得一提的是，正常人體內(nèi)并不存在CAF，而一旦體內(nèi)發(fā)生腫瘤后，腫瘤細胞可誘導(dǎo)成纖維細胞轉(zhuǎn)化為CAF，同時CAF 又進一步促進腫瘤細胞增殖，從而形成惡性循環(huán)[16-18]。近年的研究結(jié)果[19-20]表明，腫瘤來源外泌體（tumor-derived exosome，TDE）亦可誘導(dǎo)CAF 的生成，因此，本綜述旨在闡述TDE 的提取和鑒定方法、TDE 誘導(dǎo)CAF 的具體機制和對TME 的作用，通過深入了解上述過程，期望能從CAF 入手為將來基于TME的靶向治療提供新的思路。

1 TDE的提取和鑒定

TDE的高效提取和準確鑒定是研究外泌體誘導(dǎo)成纖維細胞分化為CAF 的先決條件。目前，絕大多數(shù)的研究均是從腫瘤細胞中提取外泌體，這些細胞系包括：肝癌細胞系HepG2、CSQT-2、MHCC-97L、HCC-LM3和SMMC-7721，前列腺癌細胞系LNCAP、Du145、PC3 和22Rv1，膀胱癌細胞系HT1376、RT4、T24和SW1710，乳腺癌細胞系MCF-7、MDA-MB-231和MDA-MB-468，結(jié)直腸癌細胞系CaCo2、舌癌細胞系HSC-3、子宮內(nèi)膜癌細胞系Ishikawa和霍奇金淋巴瘤細胞系KM-H2 等[21-22]。僅有極少數(shù)研究是從人原代腫瘤細胞中提取外泌體，兩者各有利弊。從細胞中提取外泌體的優(yōu)勢在于細胞來源單一，獲得的外泌體干擾較少，劣勢是不能反映腫瘤患者的自身情況；從原代腫瘤細胞中提取外泌體的優(yōu)點是能真實地反映患者的情況，其缺點是原代腫瘤細胞僅代表某一個個體，實驗結(jié)果可能不具有普遍性[22]。另外，由于外泌體常與其他細胞外囊泡混合在一起，在提取過程中難免混雜其他成分，如何提取高純度的外泌體亦是一個問題[23-24]。目前，公認的提取方法包括超速離心法和ExoQuick-TC試劑盒法（亦有部分研究采用蔗糖緩沖法），但無論哪一種提取方法，都或多或少地摻雜有其他細胞的外囊泡，所以準確地鑒定外泌體亦是非常重要的一個步驟[19，25]。由于外泌體的直徑遠小于細胞和細菌，在光學顯微鏡下無法直接觀察其形態(tài)，因此常需借助透射電鏡或Nanosight激光粒度儀鑒定其大小，后者還可用于外泌體的定量檢測[26-28]。除了形態(tài)學的觀察方法外，研究者[29-30]還采用納米顆粒跟蹤分析法或BCA蛋白定量法檢測某些特征性蛋白腫瘤易感基因-101、CD9、CD63、CD81、HSP70 和脂筏特征蛋白flotillin 等來鑒定外泌體。

2 成纖維細胞轉(zhuǎn)化為CAF的研究現(xiàn)狀

目前的研究所采用的成纖維細胞主要來源于兩大類：一類是來源于成纖維細胞系，例如人肺成纖維細胞系A(chǔ)G02262、AG02262 和MRC5，人表皮成纖維細胞系HDFn和NHDF，人前列腺間質(zhì)成纖維細胞系WPMY-1和小鼠胚胎成纖維細胞系NIH/3T3等；另一類是從人體原代組織中提取成纖維細胞，例如人肺成纖維細胞、前列腺間質(zhì)細胞、子宮內(nèi)膜細胞和膀胱成纖維細胞等。值得注意的是，成纖維細胞并非永生細胞，在培養(yǎng)傳代過程中會逐漸失去其特性，因此，無論是原代細胞還是培養(yǎng)傳代的細胞，通常選用十代之內(nèi)的細胞進行研究[31-32]。另外，雖然成纖維細胞和CAF 的形態(tài)具有相似性，但由于CAF 表達α-平滑肌肌動蛋白（alpha-smooth muscle actin，α-SMA）等特征性蛋白，可通過檢測特征性蛋白的表達來區(qū)分兩者[33-34]。

如前所述，研究TDE 誘導(dǎo)成纖維細胞轉(zhuǎn)變?yōu)镃AF 的重要環(huán)節(jié)之一是觀察成纖維細胞是否攝取TDE。對于該問題，通常利用PKH26或CFSE標記外泌體，然后將標記的外泌體與成纖維細胞共培養(yǎng)，最后利用流式細胞術(shù)檢測細胞的熒光信號，或者采用免疫熒光法觀察細胞是否顯色來判斷成纖維細胞是否捕獲和攝取外泌體[35]。一旦成纖維細胞攝取外泌體后，將可能轉(zhuǎn)變?yōu)镃AF，雖然兩者在形態(tài)上難以區(qū)別，但可通過檢測CAF 的特征蛋白，包括α-SMA、成纖維細胞活化蛋白（fibroblast activation protein，F(xiàn)AP）、半乳糖結(jié)合蛋白、纖維連接蛋白和組織金屬蛋白酶抑制因子-2 等來進行區(qū)分[36]。并且，CAF 的遷移、侵襲以及分泌的細胞因子的能力均顯著提高，這些細胞因子包括促炎癥因子IL-1α、IL-6、IL-8和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、促血管生成因子VEGF、HGF 和FGF2，以及生長因子G-CSF、GM-CSF、EGF和Pro-MMP等[37]。

3 TDE誘導(dǎo)CAF生成的機制

3.1 外泌體攜帶蛋白誘導(dǎo)CAF生成

在TME 內(nèi)，腫瘤細胞可通過轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）/SMAD 通路誘導(dǎo)CAF 的生成，其具體機制是腫瘤細胞分泌的游離TGF-β 與成纖維細胞的TGF-βⅠ型和Ⅱ型受體結(jié)合，促使下游的SMAD2 和SMAD3磷酸化，并進一步與SMAD4形成復(fù)合物，該復(fù)合物再進入成纖維細胞核內(nèi)，通過上調(diào)α-SMA 的轉(zhuǎn)錄進而促使成纖維細胞轉(zhuǎn)變?yōu)镃AF。WEBBER等[19]研究發(fā)現(xiàn)，TDE 亦攜帶TGF-β，不同之處在于TGF-β 并非游離而是與外泌體包膜上的TGF-β Ⅲ型受體形成三聚體，當外泌體與成纖維細胞接觸后，TGF-β Ⅲ型受體可將TGF-β 傳遞至成纖維細胞的TGF-βⅠ型和Ⅱ型受體，從而激活成纖維細胞下游的SMAD通路。從上述研究結(jié)果不難看出，TGF-β似乎需要在外泌體的包膜表面才能發(fā)揮作用，但有研究者[31]的結(jié)果則截然相反，為了明確TGF-β 的定位，用蛋白酶K 和Triton X-100 處理膀胱癌細胞來源外泌體，其原理是蛋白酶K具備降解包膜內(nèi)蛋白的功能，但無法通過磷脂雙分子層，而Triton X-100 可破壞外泌體的磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)，進而協(xié)助蛋白酶K進入外泌體內(nèi)，并降解包膜內(nèi)蛋白。此外，他們將蛋白酶K單獨加入外泌體，發(fā)現(xiàn)外泌體攜帶的TGF-β 并未減少，且仍可誘導(dǎo)CAF的生成，說明TGF-β并非位于外泌體的包膜上；而同時加入蛋白酶K 和Triton X-100后，絕大多數(shù)外泌體所攜帶的TGF-β 被降解，且外泌體不能誘導(dǎo)CAF 的生成，表明TGF-β 定位于外泌體的包膜內(nèi)。上述兩項研究結(jié)果表明，外泌體可通過TGF-β/SMAD 通路誘導(dǎo)成纖維細胞轉(zhuǎn)變?yōu)镃AF，但不同類型的TDE 所攜帶TGF-β 的部位可能有所不同。

除了經(jīng)典的TGF-β/SMAD 通路以外，越來越多的通路亦逐漸被發(fā)現(xiàn)，例如，霍奇金淋巴瘤來源外泌體可引起成纖維細胞TNF-α 蛋白的表達，后者進一步上調(diào)核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）的表達，從而參與CAF 的生成[33]；ZHAO 等[35]發(fā)現(xiàn)，黑色素瘤細胞來源外泌體可促進成纖維細胞細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2（ERK1/2）蛋白磷酸化，并提高其血管細胞黏附分子-1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）的表達，而ERK1/2/VCAM-1通路的活化可能與CAF形成相關(guān)；SUNG等[38]通過三陰性乳腺癌MBA-MB-231細胞過表達整合素β4（integrin beta 4，ITGB4），使其細胞來源外泌體攜帶高表達的ITGB4，后者可經(jīng)BNIP3L 依賴的自噬途徑促進CAF 的生成；YEUNG等[39]的研究結(jié)果表明，前列腺癌來源外泌體攜帶的囊泡轉(zhuǎn)運因子Ras 超家族三磷酸鳥苷激酶-35（Rab35）通過改變成纖維細胞MMP1和MMP3的表達來調(diào)控其α-SMA 的轉(zhuǎn)錄，而一旦敲除腫瘤細胞中Rab35 基因，其分泌的外泌體則不能誘導(dǎo)成纖維細胞分化為CAF，說明Rab35/MMP1/MMP3 亦可能是一條重要的信號通路。

3.2 外泌體miRNA可誘導(dǎo)CAF生成

miRNA 屬于小分子非編碼RNA，其主要功能是抑制信使RNA 的轉(zhuǎn)錄[40]。TDE 攜帶大量miRNA，這些miRNA 參與腫瘤細胞的免疫調(diào)控、耐藥及轉(zhuǎn)移等過程[41]。當外泌體被成纖維細胞攝取后，前者通過釋放其中的miRNA 可影響后者的基因轉(zhuǎn)錄，進而促使其分化為CAF[40-42]。例如，雌激素受體陽性乳腺癌MCF-7細胞和三陰性乳腺癌MBA-MB-231細胞來源外泌體攜帶的miR-146a可靶向抑制成纖維細胞中的硫氧還蛋白互作蛋白（thioredoxin-interacting protein，TXNIP）的基因轉(zhuǎn)錄，并進一步活化下游的Wnt/βcatenin 通路，從而促使成纖維細胞轉(zhuǎn)化為CAF[43]；FANG 等[44]研究發(fā)現(xiàn)，肝癌細胞來源外泌體攜帶的miR-1247-3p 通過下調(diào)成纖維細胞β-1,4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶Ⅲ，進一步激活下游的ITGBβ1/NF-κB 信號通路，從而促使成纖維細胞轉(zhuǎn)化為CAF。此外，MAIDA等[45]研究發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜癌細胞來源外泌體攜帶有miR-141-3p 和miR-200b-3p，當這些外泌體被子宮內(nèi)膜成纖維細胞攝取后，釋放出大量的miR-141-3p 和miR-200b-3p 可顯著降低靶基因的轉(zhuǎn)錄，從而促使子宮內(nèi)膜成纖維細胞轉(zhuǎn)變?yōu)镃AF。進一步采用miRNA質(zhì)譜分析法比較子宮內(nèi)膜癌細胞和其分泌的外泌體miRNA水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)約23%的miRNA僅存在于外泌體而并未存在于子宮內(nèi)膜癌細胞，該現(xiàn)象說明，TDE 所攜帶的miRNA 種類與腫瘤細胞自身攜帶的miRNA不盡相同。

4 CAF對TME的促進作用

在體外環(huán)境下，CAF 通過分泌各種細胞因子作用于不同細胞，包括腫瘤細胞、成纖維細胞和內(nèi)皮細胞等，其綜合效應(yīng)是促進腫瘤的生長。例如，結(jié)腸癌SW480 細胞來源外泌體可促進CAF 生成，而后者又可破壞TME 中的細胞外基質(zhì)成分，從而促進SW480細胞的轉(zhuǎn)移[46]；GIUSTI等[37]的研究結(jié)果表明，人源性卵巢癌CABA I 和SKOV3 細胞來源外泌體促使人皮膚成纖維細胞轉(zhuǎn)變?yōu)镃AF，CAF又可提高CABA I和SKOV3 細胞的遷移和侵襲能力；FANG 等[44]發(fā)現(xiàn)，高轉(zhuǎn)移性肝癌細胞通過分泌富含miR-1247-3p 的外泌體促使成纖維細胞轉(zhuǎn)變?yōu)镃AF，而CAF 釋放的IL-6和IL-8 會促進肝癌細胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，并提高腫瘤細胞對化療藥物的耐藥性。此外，CAF 尚具有促進血管生成的作用。例如，有研究[47]發(fā)現(xiàn)肺癌細胞來源外泌體通過激活CAF的非受體型蛋白酪氨酸激酶2（Janus kinase 2，JAK2）/STAT3通路，可促進TME內(nèi)的微血管生成；WEBBER 等[19]利用血管生成實驗證實，經(jīng)TDE作用后，TME內(nèi)的血管長度和厚度均顯著增加；無獨有偶，GIUSTI 等[37]用卵巢癌CABA I 細胞來源外泌體誘導(dǎo)生成的CAF與人臍靜脈內(nèi)皮細胞共培養(yǎng)，通過細胞劃痕愈合實驗證實CAF 可提高人臍靜脈內(nèi)皮細胞的增殖和遷移能力。

在體內(nèi)環(huán)境下，CAF 同樣具有促腫瘤的作用。例如，TP53 基因缺失的結(jié)腸癌細胞外泌體可促進小鼠移植瘤內(nèi)CAF 的增殖，而后者可進一步提高小鼠的成瘤能力[16]；FANG等[44]用CAF條件培養(yǎng)基培養(yǎng)高轉(zhuǎn)移性肝癌細胞，再將這些肝癌細胞注入裸鼠皮下建立異種移植瘤模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與普通肝癌細胞相比，經(jīng)CAF 預(yù)處理的肝癌細胞其皮下成瘤能力顯著增強，并且更易發(fā)生肺部轉(zhuǎn)移；D?RSAM等[33]將CAF和霍奇金淋巴瘤細胞一起接種至NOD免疫缺陷小鼠皮下，并通過鼠尾靜脈輸注霍奇金淋巴瘤來源外泌體，經(jīng)病理檢查證實上述小鼠體內(nèi)成瘤的微血管生成較對照組顯著增多。

5 結(jié)語

目前的研究已證實，TDE 可誘導(dǎo)成纖維細胞分化為CAF，該作用可進一步促進腫瘤的生長和進展。然而目前仍有一些亟待解決的問題，例如依據(jù)分子標志物α-SMA 和FAP 的表達差異，可將CAF 細分為不同的亞型，這些亞型的CAF 功能不盡相同甚至截然相反，因此采用分子生物學和生物信息學相結(jié)合的方式對CAF 的亞型進行深入挖掘和分析，將有助于人們加深對CAF的理解和認識。除了CAF自身以外，探討CAF與TME其他細胞的關(guān)系亦是未來研究的方向之一，例如CAF 可影響TME 內(nèi)免疫細胞（包括具有抑癌作用的效應(yīng)T 細胞和促癌作用的調(diào)節(jié)性T 細胞等）的代謝過程，而T 細胞的代謝與其針對腫瘤抗原的免疫識別和免疫應(yīng)答又息息相關(guān)；此外，CAF 還具有重塑細胞外基質(zhì)的作用，其結(jié)果是阻止免疫細胞浸潤，對腫瘤細胞的局部侵襲和遠處轉(zhuǎn)移發(fā)揮功效，說明CAF 可能會影響腫瘤免疫治療的療效[48-49]?？傊?，隨著對CAF 作用機制和TME 內(nèi)細胞間相互作用的深入研究，將為基于TME 的靶向治療和免疫治療提供新的思路和方向。