高蛋白酶活力米曲霉BL18在豆瓣醬制曲和發(fā)酵中的應(yīng)用

范林旭，付建華，鈕成拓，鄭飛云，王金晶，劉春鳳，許鑫，李崎*

1(工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué))，江蘇 無錫，214122)2(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫，214122)

豆瓣醬是一種以蠶豆和面粉為主要原料，在霉菌、酵母菌和乳酸菌等微生物的協(xié)同作用下，自然發(fā)酵而成的半固體粘稠狀食品。其色澤紅潤、風(fēng)味獨(dú)特、營養(yǎng)豐富，已成為日常生活及餐飲行業(yè)不可缺少的調(diào)味品[1]。豆瓣醬發(fā)酵主要分為制曲和醬醅發(fā)酵兩步，其中制曲主要依賴微生物分泌的豐富蛋白酶資源實(shí)現(xiàn)對(duì)蠶豆瓣中大分子物質(zhì)的降解，為后期豆瓣醬發(fā)酵過程中微生物生長代謝與風(fēng)味化合物形成提供了關(guān)鍵前體物質(zhì)。因此，在制曲過程中提高成曲的蛋白酶活力是加快豆瓣醬發(fā)酵周期且改善豆瓣醬品質(zhì)的關(guān)鍵。

米曲霉是一種絲狀真菌，其通常作為常用發(fā)酵劑應(yīng)用于亞洲傳統(tǒng)豆類發(fā)酵食品的生產(chǎn)，被美國食品藥品監(jiān)督管理局和世界衛(wèi)生組織認(rèn)定為公認(rèn)安全(Generally Recognized as Safe，GRAS)的微生物[2]。在制曲過程中，米曲霉會(huì)分泌大量蛋白酶，將蠶豆中的蛋白質(zhì)降解成寡肽和氨基酸。這些酶解產(chǎn)物不僅可以為發(fā)酵過程中微生物的生長代謝提供必須的營養(yǎng)源，也作為豆瓣醬中的增味劑，促進(jìn)風(fēng)味化合物的積累[3]。因此，具有高蛋白酶活力生產(chǎn)能力的米曲霉被認(rèn)為是豆瓣醬生產(chǎn)的理想菌種。米曲霉3.042是國內(nèi)豆瓣醬發(fā)酵行業(yè)中常用的菌株，在制曲過程中具有較強(qiáng)的蛋白酶生產(chǎn)能力[4]。近年來，研究人員通過菌株誘變篩選及菌種改造策略獲得了高產(chǎn)蛋白酶的米曲霉菌株，如紫外線誘變[5]、原生質(zhì)體融合育種[6]和常溫等離子體(atmospheric room temperature plasma，ARTP)誘變。GAO等[7]通過ARTP獲得了米曲霉3.042突變體H8，其酸性、中性和堿性蛋白酶活力較出發(fā)菌提高7.56%、28.92%和26.23%。在前期研究過程中，本研究室從豆瓣醬醬醅中篩選得到1株具有較高蛋白酶產(chǎn)生能力的米曲霉BL18[8]。在此基礎(chǔ)上，以目前行業(yè)常用釀造菌株米曲霉3.042為對(duì)照，分析了制曲過程米曲霉孢子數(shù)、蛋白酶活力以及成曲游離氨基酸含量，測(cè)定了后續(xù)發(fā)酵過程蛋白酶活力、理化參數(shù)，從制曲、發(fā)酵2個(gè)階段探究了米曲霉BL18在實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)用的可能，同時(shí)從基因組水平深入挖掘了米曲霉BL18表型產(chǎn)生差異的原因。

1 材料和試劑

1.1 材料

1.1.1 菌株及主要試劑

菌株：米曲霉(Aspergillusoryzae) BL18(保藏號(hào)CGMCC No.19628)篩選自豆瓣醬醬醅、米曲霉3.042為目前常用的豆瓣醬制曲微生物，保藏于本實(shí)驗(yàn)室。

主要試劑：H2SO4、NaCl、36%(體積分?jǐn)?shù)，下同)甲醛水溶液、Na2CO3、三氯乙酸、95%乙醇、干酪素等。

1.1.2 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar, PDA)培養(yǎng)基：稱取土豆200 g，煮沸30 min，過濾后定容至1 L，加入葡萄糖20 g，瓊脂20 g，121 ℃，高壓蒸汽滅菌20 min。

1.1.3 儀器和設(shè)備

超凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；HHS型數(shù)顯式電熱恒溫水浴鍋，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；全自動(dòng)高壓蒸汽滅菌鍋，日本HIRAYAMA株式會(huì)社；恒溫恒濕培養(yǎng)箱，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；紫外可見分光光度計(jì)，UNICO(上海)儀器有限公司；1100液相色譜儀，美國安捷倫科技有限公司；電子天平、pH計(jì)，METTLER TOLEDO公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌株活化及孢子液制備

米曲霉BL18與米曲霉3.042接種到PDA培養(yǎng)基活化后，接種至PDA固體平板，30 ℃培養(yǎng)3 d，用無菌生理鹽水將孢子沖下經(jīng)紗布過濾后完成孢子懸液制備。

1.2.2 制曲

干蠶豆泡發(fā)，經(jīng)高溫蒸煮并冷卻到40 ℃左右拌入面粉(15%，質(zhì)量分?jǐn)?shù))，分別接種米曲霉BL18和3.042孢子液，接種量為1×106個(gè)/g。放置在30 ℃、相對(duì)濕度90%恒溫恒濕培養(yǎng)箱，每隔8 h通過肉眼觀察并通過照相機(jī)拍照，取樣測(cè)定蛋白酶活力及孢子數(shù)，48 h后每隔16 h觀察拍照及取樣測(cè)定。

1.2.3 發(fā)酵

將成曲與170 g/L的鹽水按質(zhì)量比1∶1.1投入透明塑料小桶，攪拌均勻。置于30 ℃培養(yǎng)箱中靜置發(fā)酵。發(fā)酵第一周，每天進(jìn)行翻醬。發(fā)酵一周后每隔7 d進(jìn)行翻醬取樣。

1.2.4 理化指標(biāo)測(cè)定

孢子數(shù)測(cè)定參照SB/T 10315—1999《孢子數(shù)測(cè)定法》；蛋白酶活力測(cè)定參照SB/T 10317—1999《蛋白酶活力測(cè)定法 福林法》，條件為酸性(pH 3.0)、中性(pH 7.2)和堿性(pH 10.0)；氨基酸態(tài)氮測(cè)定參照GB 5009.235—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氨基酸態(tài)氮的測(cè)定 酸度計(jì)法》；可滴定酸測(cè)定參照GB 12456—2021《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中總酸的測(cè)定 pH計(jì)電位滴定法》。水分及pH測(cè)定參照文獻(xiàn)[9]的方法。

1.2.5 游離氨基酸含量測(cè)定

稱取樣品1.0 g研磨均勻，用50 g/L三氯乙酸溶解并轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶定容。常溫超聲20 min，靜置2 h。經(jīng)雙層濾紙過濾后，取1 mL濾液于1.5 mL離心管中，12 000 r/min離心10 min，取上清液500 μL經(jīng)0.22 μm水膜過濾于液相瓶，使用Agillent 1100高效液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定分析，條件如下：色譜柱：ODS柱4.6 mm×250 mm×5 μm；流動(dòng)相A：醋酸鈉溶液(20 mmol/L)；B：V(醋酸鈉溶液)∶V(甲醇)∶V(乙腈)=1∶2∶2；流速1.0 mL/min；檢測(cè)波長338 nm(脯氨酸262 nm)；洗脫方式等度洗脫；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

1.2.6 米曲霉BL18基因組測(cè)序分析

使用BGI定制的磁性植物基因組DNA試劑盒提取米曲霉BL18的基因組DNA。確認(rèn)提取DNA濃度、純度以及完整性后，在華大基因(中國深圳)的PacBio Sequel系統(tǒng)上進(jìn)行全基因組測(cè)序。首先，使用g-TUBE裝置將1 μg基因組DNA剪切成10～15 kb的片段。然后通過SMRTbell?Express Template Preparation Kit 2.0構(gòu)建文庫，最終使用Sequel (PacBio) Sequencing Kit 2.0對(duì)SMRTbell文庫進(jìn)行測(cè)序。

原始測(cè)序數(shù)據(jù)首先過濾包含測(cè)序接頭、低質(zhì)量堿基比率和高未知堿基比率的讀數(shù)。對(duì)這些過濾后的高質(zhì)量數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析和下游生物信息學(xué)分析。結(jié)合多種軟件對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行組裝，經(jīng)過Subreads糾正、Corrected Reads組裝、組裝結(jié)果糾正、構(gòu)建Scaffold及補(bǔ)洞四步對(duì)基因組進(jìn)行組裝。從頭注釋所采用的軟件包括Genewise[10]、SNAP[11]、Augustus[12]、Genemarkes[13]；同時(shí)利用多種數(shù)據(jù)庫進(jìn)行功能注釋，包括分析NR、KEGG、COG、GO數(shù)據(jù)庫、EggNOG以及Swiss-Prot等數(shù)據(jù)庫(無特殊說明的軟件采用默認(rèn)參數(shù))。原始數(shù)據(jù)和基因組組裝結(jié)果已上傳至NCBI，注冊(cè)號(hào)JAJGRD000000000 (BioProject PRJNA776566)。

對(duì)米曲霉BL18和米曲霉3.042的共有及特有基因進(jìn)行分析，首先對(duì)菌株的蛋白質(zhì)基因集進(jìn)行CD-HIT(v4.6.6)[14]聚類分析，將聚類的最終基因集作為Pan基因集。提取聚類結(jié)果中每個(gè)樣本共有的序列作為共有基因集。每個(gè)樣品中特有的基因集為特有基因集，Pan基因集中去除共有基因集和特有基因集為非必要基因集。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果中的數(shù)據(jù)均為3個(gè)平行樣品均值，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在表和圖中分別以數(shù)值和誤差棒表示，采用Origin 2022作圖分析，顯著性分析由SPSS 19.0軟件完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 制曲過程中的形態(tài)變化

將米曲霉BL18和米曲霉3.042在制曲過程中進(jìn)行應(yīng)用，并對(duì)制曲過程中曲塊表面米曲霉菌絲生長和產(chǎn)孢現(xiàn)象進(jìn)行跟蹤觀察。如圖1所示，米曲霉BL18產(chǎn)孢提前8 h，在培養(yǎng)32 h時(shí)就能明顯觀察到菌絲與孢子產(chǎn)生，在培養(yǎng)40 h和48 h時(shí)曲塊產(chǎn)孢現(xiàn)象已經(jīng)比較明顯。而接種米曲霉3.042的曲塊在制曲40 h時(shí)才開始出現(xiàn)明顯產(chǎn)孢，且在48 h和64 h成曲產(chǎn)孢程度明顯不如米曲霉BL18制備成曲。

圖1 制曲過程形態(tài)變化Fig.1 Morphological changes during koji making

2.2 制曲過程中孢子數(shù)的變化

進(jìn)一步對(duì)米曲霉BL18和米曲霉3.042在制曲過程中的孢子數(shù)進(jìn)行了測(cè)定。如圖2所示，在發(fā)酵前32 h米曲霉BL18和3.042的孢子數(shù)幾乎相同(P>0.05)。

圖2 制曲過程中的孢子數(shù)變化Fig.2 Changes in the number of spores during koji making

在制曲40～48 h時(shí)，米曲霉BL18制曲的孢子數(shù)開始上升，而米曲霉3.042的孢子數(shù)則幾乎不變。米曲霉BL18制備的曲樣品在48 h和64 h的孢子量分別為2.28×108個(gè)/g干曲和4.19×108個(gè)/g干曲，顯著高于(P<0.05)米曲霉3.042樣品孢子數(shù)(1.25×108個(gè)孢子/g干曲和2.89×108個(gè)孢子/g干曲)。上述結(jié)果說明米曲霉制曲過程的孢子數(shù)測(cè)定結(jié)果與制曲狀態(tài)觀察結(jié)果一致。豆瓣曲表面綠色孢子的形成是曲成熟的指標(biāo)之一[15]，因此孢子形成速度越快，制曲時(shí)間越短。先前的研究還報(bào)道，米曲霉綠色孢子的形成伴隨著蛋白酶的產(chǎn)生和分泌[16]。具有更多孢子的曲樣品可能具有更高的蛋白酶活性。

2.3 制曲過程蛋白酶活力的變化

如圖3所示，米曲霉BL18和米曲霉3.042產(chǎn)生酸性蛋白酶的速率相似，而米曲霉BL18中性和堿性蛋白酶的分泌速率明顯快于米曲霉3.042。米曲霉BL18制曲樣品在培養(yǎng)64 h后的酸性、中性和堿性蛋白酶活性分別達(dá)到542.36、1 828.41、2 283.58 U/g，和米曲霉3.042制備的曲樣品(356.76、1 698.66、1 548.98 U/g)相比分別提高52%、7.6%和45.6%。米曲霉BL18制備的成曲總蛋白酶活性為4 654.35 U/g，比米曲霉3.042制備的成曲(3 604.40 U/g)提高29.1%。米曲霉在制曲過程發(fā)揮主要作用，米曲霉通過產(chǎn)生蛋白酶將原料中的蛋白質(zhì)降解為寡肽和氨基酸，其生長和分泌蛋白酶的能力對(duì)成熟豆瓣曲的質(zhì)量具有重要意義[17]，在豆瓣醬制曲過程中，首選蛋白酶活性較高的米曲霉，因?yàn)橥ㄟ^分解蛋白質(zhì)產(chǎn)生的氨基酸和寡肽越多，豆瓣醬產(chǎn)品的質(zhì)量可能會(huì)更好。

2.4 制曲過程中游離氨基酸的含量

取制曲時(shí)間為64 h樣品對(duì)17種游離氨基酸進(jìn)行測(cè)定。如圖4所示，相比于米曲霉3.042，除了甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、蛋氨酸外，其他13種氨基酸含量在米曲霉BL18所制曲中均有提升。其中天冬氨酸、谷氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸分別提高了30.1%、8.9%、11.7%和1.2%；組氨酸、蘇氨酸、精氨酸、半胱氨酸、賴氨酸分別提升了96.8%、83.6%、85.7%、114.1%、179.7%；游離氨基酸總量提升16.3%。游離氨基酸含量的提升依賴于蛋白質(zhì)及多肽的降解，蛋白酶活力的高低將直接影響游離氨基酸產(chǎn)生，具有較高制曲酶活力的米曲霉BL18能有效提高多種氨基酸含量。

a-酸性蛋白酶；b-堿性蛋白酶；c-中性蛋白酶；d-總蛋白酶圖3 制曲過程蛋白酶活力的變化Fig.3 Changes of protease activity during koji making

圖4 制曲64 h游離氨基酸的含量Fig.4 Free amino acid content at 64 h of koji making

2.5 發(fā)酵過程中可滴定酸和pH的變化

可滴定酸通常是檢測(cè)發(fā)酵過程的一個(gè)重要參數(shù)，它的變化同微生物菌群的代謝情況有密切關(guān)系。在醬醅發(fā)酵的初始階段，由于高鹽環(huán)境的抑制作用，僅有少量的耐鹽微生物可以在其中生長繁殖，其中占優(yōu)勢(shì)的主要是葡萄球菌屬及魏斯氏菌屬微生物。由于沒有其他微生物的競(jìng)爭抑制，它們的數(shù)量快速增加，并產(chǎn)生大量的乳酸等有機(jī)酸，導(dǎo)致了醬醅發(fā)酵初期的pH值迅速下降(圖5-a)。隨著發(fā)酵過程的繼續(xù)，由于產(chǎn)酸的不斷積累，pH值下降到 5.5左右，而過低的pH值又抑制了產(chǎn)酸微生物(如葡萄球菌屬及魏斯氏菌屬)的生長，此時(shí)，一些可以耐高鹽和低pH值的酵母開始大量繁殖，并逐漸占優(yōu)勢(shì)[18]。

米曲霉BL18和3.042醬醅可滴定酸含量在發(fā)酵過程迅速積累(圖5-b)。米曲霉BL18可滴定酸從0.64 g/100 g增加到了1.63 g/100 g，pH則從6.21下降到了5.81。米曲霉3.042可滴定酸從0.51 g/100 g增加到了1.63 g/100 g，pH則從6.22下降到了5.87。制曲過程米曲霉BL18具有更高的蛋白酶活力，高蛋白酶活力可使原料更充分地降解，使成曲氨基酸及寡肽等營養(yǎng)物質(zhì)含量提高，這些營養(yǎng)物質(zhì)為發(fā)酵初始階段產(chǎn)酸微生物提供了快速增長條件，從而造成產(chǎn)酸以及pH等指標(biāo)差異。

a-pH;b-可滴定酸圖5 發(fā)酵過程pH及可滴定酸的變化Fig.5 Titratable acid and pH changes during fermentation

2.6 發(fā)酵過程中蛋白酶活力的變化

蛋白酶的活力和穩(wěn)定性對(duì)豆瓣醬的原料利用率和品質(zhì)有著重要的作用。豆瓣醬醅屬于一種極端的生理環(huán)境，具有高鹽度和低pH的特點(diǎn)[19]。蛋白酶的活力在其中會(huì)受到高鹽度的抑制，從而導(dǎo)致發(fā)酵周期的延長，低 pH 值則會(huì)影響到蛋白酶的穩(wěn)定性。如圖6所示，醬醅蛋白酶活力在發(fā)酵過程呈現(xiàn)先上升后下降趨勢(shì)，中性和堿性蛋白酶活力在發(fā)酵第7天達(dá)到峰值，然后呈現(xiàn)下降趨勢(shì)；米曲霉BL18成曲所制醬醅發(fā)酵過程酸性蛋白酶活力在第28天達(dá)到最大，而米曲霉3.042則在第35天達(dá)到最大。米曲霉BL18成曲所制醬醅酸性、堿性及中性蛋白酶活力在發(fā)酵前28天均高于米曲霉3.042。以上結(jié)果說明米曲霉BL18發(fā)酵豆瓣醬在發(fā)酵前期的蛋白酶具有優(yōu)勢(shì)。之前的研究表明米曲霉在加入鹽水發(fā)酵后生長受到抑制，在發(fā)酵前期逐漸消亡[20]，但是米曲霉分泌的許多蛋白酶都具有一定的耐鹽性，仍然能夠繼續(xù)在高鹽醬醅體系里發(fā)揮作用，研究表明耐鹽米曲霉蛋白酶在發(fā)酵相同時(shí)間后剩余蛋白酶活力更高，使發(fā)酵成品氨基酸及風(fēng)味物質(zhì)含量得到提升[21]。發(fā)酵前期，米曲霉BL18成曲所制醬醅蛋白酶活力優(yōu)于米曲霉3.042，可能與它分泌的蛋白酶耐鹽性具有一定關(guān)系，同時(shí)也有助于豆瓣醬品質(zhì)提升。另一方面米曲霉BL18更高的蛋白酶活力能產(chǎn)生更豐富的寡肽氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)，這些營養(yǎng)物質(zhì)為其他產(chǎn)蛋白酶微生物如芽胞桿菌等的生長提供了條件[18]。

a-酸性蛋白酶；b-堿性蛋白酶；c-中性蛋白酶；d-總蛋白酶圖6 發(fā)酵過程蛋白酶活力的變化Fig.6 Changes of protease activity during fermentation

2.7 發(fā)酵過程中氨基酸態(tài)氮的變化

氨基態(tài)氮是衡量豆瓣醬品質(zhì)的一個(gè)重要指標(biāo)，它的含量同蛋白酶活力有著密切關(guān)系。如圖7所示，發(fā)酵前21天，米曲霉BL18醬醅的氨基酸態(tài)氮迅速積累，從開始的0.27 g/100 g增加到了0.90 g/100 g，米曲霉3.042則從0.27 g/100 g增加到了0.84 g/100 g。之后增速放緩，發(fā)酵結(jié)束時(shí)，氨基酸態(tài)氮含量分別達(dá)到1.03 g/100 g和0.99 g/100 g。氨基酸態(tài)氮含量變化與蛋白酶活力變化相反，發(fā)酵28 d后，酸性、中性和堿性蛋白酶活力都呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，而氨基酸態(tài)氮增速恰好放緩，這說明氨基態(tài)氮的產(chǎn)生主要集中在發(fā)酵前期，這與CHOU等[22]的研究一致，且和蛋白酶的逐漸失活密切相關(guān)。

圖7 發(fā)酵過程氨基酸態(tài)氮含量的變化Fig.7 Changes of amino acid nitrogen content during fermentation

2.8 發(fā)酵結(jié)束的游離氨基酸含量

食物的口感主要由低分子質(zhì)量物質(zhì)和非揮發(fā)性物質(zhì)所決定?？谖锻ǔ７?種，即甜味、苦味、咸味、酸味和鮮味[23]。豆瓣醬中的游離氨基酸主要是由多肽的進(jìn)一步降解而產(chǎn)生，對(duì)豆瓣醬口感的形成具有重要的作用。不同的氨基酸可以提供不同的口味，谷氨酸具有強(qiáng)烈的鮮味，甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和丙氨酸具有甜味，而纈氨酸、苯丙氨酸和組氨酸具有苦味。如圖8所示，相比于米曲霉3.042豆瓣樣品，米曲霉BL18豆瓣樣品中的鮮味氨基酸、甜味氨基酸總量分別提升33.3%和10.8%，必需氨基酸、苦味氨基酸總量略有提升(8.1%、9.4%)，鮮味及甜味氨基酸的提升可能有助于提高豆瓣醬鮮甜口感。以上結(jié)果表明米曲霉BL18發(fā)酵的豆瓣醬在氨基酸組成方面優(yōu)于3.042。

a-鮮味氨基酸；b-甜味氨基酸；c-苦味氨基酸；d-必需氨基酸圖8 發(fā)酵56 d游離氨基酸含量Fig.8 Free amino acid content at day 56 of fermentation

2.9 米曲霉BL18基因組測(cè)序結(jié)果

為進(jìn)一步分析米曲霉BL18遺傳信息，挖掘其具有優(yōu)良發(fā)酵性能的分子基礎(chǔ)，對(duì)米曲霉BL18進(jìn)行全基因組測(cè)序?；蚪M組裝結(jié)果如表1及圖9-a顯示。

表1 米曲霉BL18基因統(tǒng)計(jì)Table 1 Aspergillus oryzae BL18 gene statistics

米曲霉BL18基因組共有9個(gè)Scaffold、17個(gè)Contig，全長38 438 172 bp，GC含量為47.18%。編碼蛋白基因共13 251個(gè)，占全基因組長度的49.38%；外顯子數(shù)41 555，占全基因組長度的49.38%；內(nèi)含子數(shù)28 304，占全基因組長度的5.73%。米曲霉3.042則預(yù)測(cè)到11 379個(gè)基因，外顯子區(qū)總長度為44%[24]，基因數(shù)量和外顯子長度比例的差異，一方面是測(cè)序技術(shù)和分析手段的進(jìn)步引起的，另一方面也體現(xiàn)了米曲霉BL18優(yōu)勢(shì)釀造性能的分子基礎(chǔ)。

對(duì)米曲霉 BL18 基因組注釋的基因進(jìn)行 KOG 功能注釋(圖10)，其中以下功能類群富集了大量功能基因：氨基酸的運(yùn)輸與代謝(Amino acid transport and metabolism)、能量生產(chǎn)與轉(zhuǎn)換(Energy production and conversion)、脂肪運(yùn)輸與代謝(Lipid transport and metabolism)、糖運(yùn)輸與代謝(Carbohydrate transport and metabolism)、次級(jí)代謝(Secondary metabolisms biosynthesis，transport and catabolism)、翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物發(fā)生(Translation, ribosomal structure and biogenesis)、輔酶運(yùn)輸和代謝(Coenzyme transport and metabolism)、翻譯后修飾(Posttranslational modification，protein turnover, chaperones)。大量功能基因的富集，表明米曲霉具有強(qiáng)大的能量合成能力、蛋白質(zhì)合成及轉(zhuǎn)運(yùn)的能力，這是其在發(fā)酵工業(yè)廣泛應(yīng)用的遺傳基礎(chǔ)[25]。類群次級(jí)代謝富集大量基因，表明米曲霉具有較強(qiáng)的次級(jí)代謝產(chǎn)物合成能力，這為米曲霉產(chǎn)生多種多樣的風(fēng)味功能物質(zhì)提供了可能。

a-米曲霉BL18基因組圈圖；b-米曲霉BL18特有基因注釋結(jié)果；c-米曲霉3.042特有基因注釋結(jié)果圖9 米曲霉BL18基因組及特有基因注釋信息Fig.9 A. oryzae BL18 genome and unique gene annotation information

圖10 米曲霉BL18基因KOG功能注釋Fig.10 A. oryzae BL18 gene KOG annotation results

對(duì)米曲霉BL18基因組注釋的基因進(jìn)行KEGG途徑分析(圖11)，以下途徑富集了大量功能基因：碳水化合物代謝(Carbohydrate metabolism)、氨基酸代謝(Amino acid metabolism)、運(yùn)輸和分解代謝(Transport and catabolism)、翻譯(Translation)、脂質(zhì)代謝(Lipid metabolism)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(Signal transduction)、折疊、排序與降解(Folding, sorting and degradation)、能量代謝(Energy metabolism)。這與KOG功能富集分析的結(jié)果是一致的，說明米曲霉BL18在碳代謝(與生長相關(guān))、蛋白質(zhì)合成、能量代謝方面具有遺傳優(yōu)勢(shì)。此前關(guān)于米曲霉釀造模式菌株RIB40轉(zhuǎn)錄組研究的結(jié)果表明，與能量代謝、蛋白質(zhì)合成等相關(guān)的基因在固體發(fā)酵條件下具有高的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平[26]，也說明米曲霉在基因組上與能量代謝、蛋白質(zhì)合成相關(guān)優(yōu)勢(shì)也能體現(xiàn)在實(shí)際的發(fā)酵應(yīng)用中。

圖11 米曲霉BL18基因的KEGG代謝途徑注釋Fig.11 KEGG pathway analysis of annotated genes in the genome of A. oryzae BL18

同時(shí)分析比較了米曲霉 BL18和米曲霉3.042的基因序列，共同擁有的基因?yàn)楣灿谢?多數(shù)為菌株生長必須基因)，而某個(gè)樣品所特有的基因稱為這個(gè)樣品的特有基因。共有基因和特有基因的研究對(duì)不同樣品基因組的功能差異性和相似性的研究有重要作用，為物種表型的相似性和差異性的研究提供分子依據(jù)。2株米曲霉共有基因?yàn)? 359個(gè)，米曲霉BL18中有647個(gè)特有基因，而米曲霉3.042僅為57個(gè)。進(jìn)一步對(duì)特有基因在COG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行注釋，結(jié)果如圖9-b及圖9-c所示，米曲霉BL18注釋到11個(gè)基因，而米曲霉3.042只注釋到5個(gè)基因，而且米曲霉BL18特有基因注釋到氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)及代謝、能量產(chǎn)生和轉(zhuǎn)化以及脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)及代謝功能。

3 結(jié)論

本研究通過對(duì)米曲霉BL18進(jìn)行豆瓣醬的制曲發(fā)酵，并對(duì)常規(guī)理化指標(biāo)進(jìn)行跟蹤，發(fā)現(xiàn)米曲霉BL18在豆瓣醬的生產(chǎn)過程具有優(yōu)勢(shì)性能，同時(shí)對(duì)優(yōu)勢(shì)性能的分子基礎(chǔ)進(jìn)行了初步探究。在豆瓣醬制曲過程，米曲霉BL18能有效提高制曲過程孢子數(shù)以及成曲蛋白酶活力，米曲霉BL18成曲的孢子數(shù)達(dá)到4.19×108個(gè)/g干曲，酸性、中性和堿性蛋白酶活力分別提高52%、7.6%和45.6%。13種游離氨基酸包括天冬氨酸、谷氨酸、酪氨酸等含量也有所提高。米曲霉BL18蛋白酶在豆瓣醬發(fā)酵前期具有優(yōu)勢(shì)，由于可滴定酸的迅速增加，醬醅的pH值快速下降，導(dǎo)致蛋白酶活力的下降，氨基酸態(tài)氮的生成主要集中在發(fā)酵初期。對(duì)發(fā)酵后的豆瓣醬游離氨基酸進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)米曲霉BL18豆瓣樣品中的鮮味氨基酸、甜味氨基酸總量分別提升33.3%和10.8%。與米曲霉3.042進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)從制曲過程蛋白酶的活力、孢子產(chǎn)生速率及數(shù)量、發(fā)酵豆瓣醬的蛋白酶活力及氨基酸組成等方面，米曲霉BL18均優(yōu)于對(duì)照組。米曲霉BL18基因KOG和KEGG數(shù)據(jù)庫注釋結(jié)果表明米曲霉 BL18具有強(qiáng)大的能量合成、蛋白質(zhì)合成及次級(jí)代謝產(chǎn)物合成能力。分析米曲霉BL18和3.042共性基因與特性基因時(shí)，發(fā)現(xiàn)米曲霉BL18中有647個(gè)特有基因，而米曲霉3.042僅為57個(gè)，特有基因功能集中在氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)及代謝、能量產(chǎn)生和轉(zhuǎn)化以及脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)及代謝功能。米曲霉BL18在制曲發(fā)酵過程表現(xiàn)出的優(yōu)勢(shì)性能及大量功能基因的注釋為其在豆瓣醬發(fā)酵應(yīng)用中提供了理論基礎(chǔ)。