產(chǎn)巖藻多糖酶菌株的篩選及其酶解制備低分子質(zhì)量巖藻多糖的研究

王聰聰，周劍麗,2，顧秋亞，楊文華，張文帥，余曉斌*

1(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫，214122)2(貴州大學(xué) 釀酒與食品工程學(xué)院，發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng)，550025)

巖藻多糖是一種來(lái)源于褐藻的水溶性硫酸化雜多糖，主要由L-巖藻糖和硫酸基團(tuán)組成，并含有其他的單糖和糖醛酸等[1-2]。研究表明，巖藻多糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)會(huì)因采收季節(jié)、褐藻種類、提取方法的不同而發(fā)生變化[1]。巖藻多糖化學(xué)結(jié)構(gòu)的多樣性賦予了其廣泛的生理活性[3]，使其越來(lái)越受到研究者的關(guān)注[4]，如抗腫瘤[5-7]、抗氧化[8]、保護(hù)胃黏膜[9]、降血脂[10]、保濕等。但從褐藻中提取的天然巖藻多糖分子質(zhì)量大、溶解性差、黏度高、難以吸收，限制了其在臨床上的應(yīng)用，因而研究者將目光轉(zhuǎn)移到了低分子質(zhì)量巖藻多糖(low molecular weight fucoidan，LMWF)。

LMWF是指經(jīng)部分水解生成的分子質(zhì)量1～100 kDa的巖藻多糖，具有溶解性好、黏度低、生物活性高等優(yōu)點(diǎn)[5]。制備方法主要有化學(xué)法和酶法。化學(xué)法主要使用酸降解和H2O2降解，但此方法的反應(yīng)條件劇烈、容易破壞多糖活性結(jié)構(gòu)，且產(chǎn)物分子質(zhì)量的分布范圍大，給分離純化帶來(lái)困難[11-12]；酶水解法因具有反應(yīng)條件溫和、對(duì)環(huán)境友好、產(chǎn)物分子質(zhì)量易于控制等優(yōu)點(diǎn)，顯示出廣闊的應(yīng)用前景。當(dāng)前，已知的巖藻多糖酶主要來(lái)源于海洋軟體動(dòng)物和微生物，從海洋軟體動(dòng)物L(fēng)ambissp.消化腺中分離得到的巖藻多糖酶活力為0.124 U/mL[13]，海洋真菌DendryphiellaarenariaTM94酶活力為0.012 U/mL[14]、Cladosporiumsalinae為0.048 U/mL[15]、Mucorsp.3P為9.26 U/L[16]，AspergillusnigerPSH為0.013 8 U/mL[17]，這些巖藻多糖酶的活力較低，難以進(jìn)行大規(guī)模的生產(chǎn)應(yīng)用。因此，尋找酶活力更高的產(chǎn)巖藻多糖酶菌株成為亟待解決的重要問(wèn)題。

本研究首次從酒曲中篩選得到了1株產(chǎn)巖藻多糖酶的菌株，通過(guò)單因素和正交實(shí)驗(yàn)對(duì)酶解條件進(jìn)行優(yōu)化，在最佳酶解條件下制備分子質(zhì)量<10 kDa的LMWF，探究LMWF的DPPH、·OH和總氧自由基清除能力。以期豐富陸生真菌產(chǎn)巖藻多糖酶的來(lái)源，并發(fā)掘其酶解產(chǎn)物L(fēng)MWF作為天然抗氧化劑在食品、保健和化妝品領(lǐng)域的應(yīng)用潛力。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源

菌株來(lái)自于從不同酒廠采集的酒曲：汾酒酒曲、貴州酒曲、古井酒曲。

1.2 材料與設(shè)備

巖藻多糖(Mw：392 kDa)，青島明月海藻集團(tuán)有限公司，其中巖藻糖19.3%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同)、糖醛酸51.5%、SO42-30.1%；麩皮、黃豆皮、玉米皮、小麥粉、黃豆粉、大米粉、玉米粉等,市售；葡萄糖、蛋白胨、酵母粉等，國(guó)藥集團(tuán)。

高壓滅菌鍋，美國(guó)致微儀器有限公司；7GI-16M高速冷凍離心機(jī)，美國(guó)賽默飛世爾科技公司；Synergy H4 酶標(biāo)儀，美國(guó)BioTek公司；SPX-250-Z恒溫培養(yǎng)箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；1260型高效液相色譜儀，美國(guó)安捷倫科技公司。

1.3 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基(g/L)：馬鈴薯 200，葡萄糖 20，瓊脂 20，pH自然。

篩選培養(yǎng)基(g/L)：巖藻多糖10，NH4NO32，MgSO40.05，瓊脂 20，50 μg/mL的青霉素及鏈霉素。

液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：麩皮50，巖藻多糖5，酵母粉10，蛋白胨5，pH 5.0。

固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基(250 mL錐形瓶)：麩皮10 g，巖藻多糖0.1 g，含水量60%，pH 5.0。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 菌株篩選

取5 g酒曲溶于45 mL的無(wú)菌水中，振蕩培養(yǎng)2 h。分別取1 mL培養(yǎng)液進(jìn)行10倍梯度稀釋，吸取100 μL稀釋液(10-1～10-5)涂布于篩選培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)3～7 d，挑取生長(zhǎng)良好的、不同形態(tài)的單菌落進(jìn)行分離純化。將所得菌株劃線于PDA平板，30 ℃培養(yǎng)5 d。使用100 mL無(wú)菌水洗滌菌落并轉(zhuǎn)移至含有玻璃珠的250 mL錐形瓶中，于25 ℃、180 r/min的搖床中振蕩30 min，使用無(wú)菌水稀釋至孢子含量為106個(gè)/mL。將制備的孢子懸液按照1.0%(體積分?jǐn)?shù))的接種量分別接種于液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基(250 mL錐形瓶，裝液量50 mL)和固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基(250 mL錐形瓶中含有10 g發(fā)酵基質(zhì))中，其中液態(tài)發(fā)酵于30 ℃、180 r/min的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)5 d，固態(tài)發(fā)酵于30 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)5 d，測(cè)定巖藻多糖酶活力。

1.4.2 菌株鑒定

形態(tài)特征：將菌株接種于PDA固體培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)3～7 d，觀察菌落的形態(tài)變化，并在掃描電子顯微鏡下觀察菌絲和孢子形態(tài)。

分子生物學(xué)鑒定：使用真菌基因組提取試劑盒提取全基因組DNA，設(shè)計(jì)ITS序列引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行檢測(cè)。測(cè)序結(jié)果于NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì)，對(duì)比結(jié)果利用MEGA7構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，確定菌株的種屬。

1.4.3 巖藻多糖酶活力測(cè)定

粗酶液的制備：將50 mL預(yù)冷的0.1 mol/L Na2HPO4-檸檬酸緩沖液(pH 6.0)添加于終止發(fā)酵的固態(tài)培養(yǎng)基中，攪拌均勻，4 ℃過(guò)夜浸提，使用紗布進(jìn)行過(guò)濾，濾出液離心(8 000 r/min，10 min)獲得的上清液即為固態(tài)發(fā)酵下的粗酶液。

由于缺乏特定的巖藻多糖酶活力檢測(cè)方法，研究者主要通過(guò)測(cè)定反應(yīng)系統(tǒng)中還原糖的生成量來(lái)確定巖藻多糖酶的活力[14,18-19]，常用的方法為3,5-二硝基水楊酸(3,5-dinitrosalicylic acid，DNS)法[20]。使用0.1 mol/L Na2HPO4-檸檬酸緩沖液(pH 6.0)將粗酶液稀釋至適當(dāng)濃度，取0.2 mL稀釋液與0.2 mL 5 g/L巖藻多糖溶液(0.1 mol/L Na2HPO4-檸檬酸緩沖液，pH 6.0)混合均勻，50 ℃反應(yīng)1 h，添加0.6 mL DNS溶液，混勻，沸水浴10 min，冷卻后測(cè)定540 nm下吸光度。巖藻多糖酶活力單位(U/mL)定義為：在50 ℃下，每分鐘水解巖藻多糖產(chǎn)生1 μmol巖藻糖所需要的酶量。

1.4.4 LMWF得率的測(cè)定

取1 mL水解液并添加3 mL無(wú)水乙醇沉淀高分子質(zhì)量巖藻多糖(high molecular weight fucoidan，HMWF)，8 000 r/min離心15 min獲得含有LMWF的上清液，蒸發(fā)上清液，所得產(chǎn)物用1 mL蒸餾水復(fù)溶[21]?？偺菧y(cè)定采用苯酚硫酸法[22]，SO42-測(cè)定采用BaCl2-明膠比濁法。LMWF得率按公式(1)計(jì)算：

(1)

1.4.5 酶解條件對(duì)LMWF得率的影響

底物質(zhì)量濃度：分別取5 mL不同質(zhì)量濃度的巖藻多糖溶液(1、2.5、5、10、15、20、25 g/L)與4 mL粗酶液混合均勻，50 ℃反應(yīng)4 h，測(cè)定LMWF得率和SO42-含量，確定最佳底物質(zhì)量濃度。

酶解pH：將巖藻多糖溶于不同pH下的緩沖液中，Na2HPO4-檸檬酸緩沖液(pH 3～7)，PBS(pH 7～8)，Na2HPO4-K2HPO4緩沖液(pH 8～9)。分別取5 mL不同pH(4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0)的巖藻多糖溶液與4 mL粗酶液混合均勻，50 ℃反應(yīng)4 h，測(cè)定LMWF得率和SO42-含量，確定最佳酶解pH。

酶解溫度：取5 mL巖藻多糖溶液與4 mL粗酶液混合均勻，分別在不同溫度(35、40、45、50、55、60 ℃)下反應(yīng)4 h，測(cè)定LMWF得率和SO42-含量，確定最佳酶解溫度。

酶解時(shí)間：取5 mL巖藻多糖溶液與4 mL粗酶液混合均勻，在50 ℃分別反應(yīng)0、2、4、6、8、10、12、24、36、48、60 h，測(cè)定LMWF得率和SO42-含量，確定最佳酶解時(shí)間。

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取底物質(zhì)量濃度、酶解pH、酶解溫度設(shè)計(jì)三因素三水平的正交實(shí)驗(yàn)(表1)，在各個(gè)條件下反應(yīng)24 h，以LMWF得率為指標(biāo)，確定最佳酶解條件。

表1 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Design of orthogonal test

1.4.6 LMWF的制備

在最佳酶解條件下制備LMWF，酶解液沸水浴10 min后終止反應(yīng)，8 000 r/min離心5 min，獲得上清液。然后添加3倍體積的無(wú)水乙醇沉淀出HMWF，8 000 r/min離心10 min，棄去沉淀，向上清液中添加1/4體積的Sevage溶液[V(氯仿)∶V(正丁醇)=4∶1]，振蕩45 min，重復(fù)操作直至蛋白質(zhì)完全去除。將含有LMWF的上清液減壓濃縮，使用500 Da透析袋透析24 h以除去其中的鹽。使用不同孔徑的超濾管進(jìn)行分級(jí)，冷凍干燥后獲得不同分子質(zhì)量的LMWF。

使用高效凝膠滲透色譜法(high performance gel permeation chromatography，HPGPC)測(cè)定各組分的分子質(zhì)量。色譜柱：UltrahydrogelTMLinear(300 mm×7.8 mmid×2)，流動(dòng)相：0.1 mol/L NaNO3，流速0.9 mL/min，柱溫45 ℃，檢測(cè)器：示差檢測(cè)器。將不同分子質(zhì)量的葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品(DextrantT系列)配制為10 mg/mL的溶液，液相測(cè)定后以保留時(shí)間(Rt)為橫坐標(biāo)，重均分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)(lgMw)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.7 LMWF抗氧化活性的研究

將1.4.6中制備得到的不同分子質(zhì)量的LMWF配制為10 mg/mL的溶液，參考文獻(xiàn)[8]和文獻(xiàn)[23]的方法測(cè)定水解前后巖藻多糖的DPPH自由基、·OH、總氧自由基清除能力，其中F0代表水解前的巖藻多糖。

1.4.8 數(shù)據(jù)處理

使用Origin軟件繪制圖表，使用SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，各實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均重復(fù)3次，數(shù)據(jù)以方差進(jìn)行(ANOVA)分析，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)巖藻多糖酶菌株的篩選與鑒定

2.1.1 菌株篩選

以巖藻多糖為唯一碳源，共從酒曲中獲得35株真菌。將菌株分別接種于液態(tài)和固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)5 d，測(cè)定巖藻多糖酶活力，結(jié)果如表2所示，在固態(tài)發(fā)酵條件下，35株真菌中只有7株能檢測(cè)到巖藻多糖酶活力，其中WA1207、GZ1701、FJ07酶活力相對(duì)較高，分別為(0.315±0.013)、(0.250±0.33)、(0.187±0.017)U/mL，其中WA1207的酶活力最高。在液態(tài)發(fā)酵條件下，僅有3株真菌能檢測(cè)到巖藻多糖酶活力，且酶活力相對(duì)較低。綜合2種發(fā)酵方式下菌株的巖藻多糖酶活力，確定菌株WA1207為目標(biāo)菌株進(jìn)行后續(xù)研究，發(fā)酵方式選用固態(tài)發(fā)酵。

表2 部分菌株在液態(tài)、固態(tài)發(fā)酵下的酶活力 單位:U/mL

將菌株WA1207于固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中30 ℃培養(yǎng)5 d，利用其粗酶液在50 ℃下對(duì)巖藻多糖酶水解0、12、24、36 h，使用HPGPC法對(duì)水解產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖1所示。隨著水解時(shí)間的增加，高分子質(zhì)量的巖藻多糖逐漸被水解，峰面積變小，并開(kāi)始出現(xiàn)分子質(zhì)量較小的巖藻多糖。水解12 h時(shí)，主要產(chǎn)物的重均分子質(zhì)量(Mw)為4 074 Da，隨著水解時(shí)間繼續(xù)增加，分子質(zhì)量較大的巖藻多糖繼續(xù)被水解，水解24 h時(shí)，主要產(chǎn)物的重均分子質(zhì)量(Mw)為2 529 Da。通常，分散系數(shù)(Mw/Mn)用來(lái)衡量多聚物分子質(zhì)量分布的分散程度，當(dāng)分散系數(shù)為1時(shí)，表明聚合物是由均一分子質(zhì)量的聚合物組成的，分散系數(shù)越大，表明聚合物的分子質(zhì)量分布范圍越大。

a-0 h;b-12 h;c-24 h;d-36 h圖1 不同水解時(shí)間下產(chǎn)物的HPGPC圖譜Fig.1 The HPGPC chromatographs of products in different hydrolysis times注：圖中標(biāo)記的分子質(zhì)量為峰最高點(diǎn)的分子質(zhì)量

由表3可知，隨著水解時(shí)間的增加，產(chǎn)物分散系數(shù)的值降低，產(chǎn)物的離散程度變小，表明LMWF中分子質(zhì)量較大的被繼續(xù)水解。這表明菌株WA1207來(lái)源的巖藻多糖酶具有水解高分子質(zhì)量巖藻多糖、降低巖藻多糖分子質(zhì)量并產(chǎn)生LMWF的功能。

表3 不同水解時(shí)間下產(chǎn)物的分子質(zhì)量Table 3 Molecular weights of products in different hydrolysis times

2.1.2 菌株鑒定

如圖2-a所示，菌株WA1207于PDA固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)3～7 d后，觀察到其菌落呈現(xiàn)為不規(guī)則圓形，結(jié)構(gòu)疏松，中央為黃褐色凸起，邊緣為新生菌落呈白色絲絨狀。通過(guò)掃描電子顯微鏡(圖2-b，圖2-c)可以觀察到，菌株WA1207的分生孢子頂部膨大形成頂囊，分生孢子呈輻射狀孢子鏈，菌絲有隔。根據(jù)其形態(tài)特征，初步鑒定為曲霉屬(Aspergillussp.)。

a-菌落形態(tài)；b-孢子形態(tài)；c-菌絲形態(tài)圖2 WA1207的菌落及掃描電子顯微鏡下的菌絲、孢子形態(tài)Fig.2 The colony morphology of strain WA1207, and the SEM photograph of its spores and mycelia

通過(guò)PCR擴(kuò)增ITS序列，結(jié)果送至上海生工進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST比對(duì)，將對(duì)比結(jié)果通過(guò)MEGA7軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖3)。綜合形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)的鑒定結(jié)果，菌株WA1207被鑒定為謝瓦氏曲霉(Aspergilluschevalieri)。

圖3 菌株WA1207的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of strain WA1207

2.2 A.chevalier WA1207來(lái)源的巖藻多糖酶制備LMWF的探究

實(shí)驗(yàn)前期對(duì)菌株A.chevalierWA1207的固態(tài)發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)該菌株在以10 g麩皮為發(fā)酵基質(zhì)、巖藻多糖0.1 g、含水量70%、初始pH 6.0，發(fā)酵溫度30 ℃，發(fā)酵時(shí)間5 d的條件下酶活力最高，為0.414 U/mL，較優(yōu)化前提高了31.43%。在此條件下大量制備粗酶液用于酶解制備LMWF。同時(shí)，為了進(jìn)一步提高LMWF得率，通過(guò)單因素和正交實(shí)驗(yàn)對(duì)酶解條件進(jìn)行探索，以LMWF得率為指標(biāo)，探究最佳酶解條件，同時(shí)監(jiān)控SO42-含量的變化，保證降解后組分不會(huì)因脫硫而失去活性。

2.2.1 酶解條件對(duì)LMWF得率的影響

2.2.1.1 最佳底物質(zhì)量濃度的確定

如圖4-a所示，隨著底物質(zhì)量濃度的升高，LMWF得率逐漸上升，底物質(zhì)量濃度為15 g/L時(shí)，LMWF得率達(dá)到最高，為(30.51±2.49)%，而后隨著底物質(zhì)量濃度的繼續(xù)升高，得率開(kāi)始下降。因此最佳底物質(zhì)量濃度為15 g/L。

2.2.1.2 最佳酶解pH的確定

如圖4-b所示，隨著pH的不斷增加，LMWF得率迅速上升，在pH 6.0時(shí)的得率最高，為(36.53±0.65)%。表明K2HPO4-檸檬酸緩沖液為該酶的最佳緩沖液，且最佳酶解pH為6.0。

2.2.1.3 最佳酶解溫度的確定

在酶水解多糖的實(shí)驗(yàn)中，酶解溫度影響著酶的穩(wěn)定性，溫度過(guò)高會(huì)使酶結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，失去催化活性；溫度過(guò)低則會(huì)影響酶的催化效率。此外，酶解溫度對(duì)多糖也存在一定的影響，多糖具有高黏性，隨著溫度的升高，多糖黏度降低，有利于酶水解。如圖4-c所示，隨著溫度的升高，LMWF得率逐漸上升，在55 ℃時(shí)達(dá)到最高，此時(shí)為最佳酶解溫度。當(dāng)溫度繼續(xù)升高至60 ℃時(shí)，得率明顯降低，說(shuō)明高溫使酶發(fā)生變性，逐漸失去催化活性，催化效率降低。因此最佳酶解溫度為55 ℃。

2.2.1.4 最佳酶解時(shí)間的確定

如圖4-d所示，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，LMWF得率逐漸增加。在0～4 h時(shí)，巖藻多糖酶活性高，水解速率快，在4 h時(shí)得率為(30.33±2.18)%；4～24 h時(shí)，水解速率降低，得率緩慢提升，在24 h時(shí)達(dá)到(52.82±1.97)%。在此基礎(chǔ)上繼續(xù)延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間，LMWF得率沒(méi)有明顯提升，基本保持不變。因此最佳酶解時(shí)間為24 h。

SO42-是影響巖藻多糖活性的重要基團(tuán)[23]，由圖4可知，未水解巖藻多糖中SO42-的含量為(30.06±0.75)%，在酶水解過(guò)程中，SO42-含量基本保持不變，表明來(lái)源于菌株A.chevalieriWA1207的巖藻多糖酶可以溫和地水解巖藻多糖，保證了酶水解產(chǎn)物L(fēng)MWF不會(huì)因脫硫而降低或失去活性。

a-底物質(zhì)量濃度；b-酶解pH；c-酶解溫度；d-酶解時(shí)間圖4 不同酶解條件下的LMWF得率和SO42-含量變化Fig.4 The yield of LMWF and sulfate content in different enzymatic hydrolysis conditions

2.2.1.5 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取底物質(zhì)量濃度、酶解pH、酶解溫度進(jìn)行三因素三水平實(shí)驗(yàn)，酶解時(shí)間為24 h。結(jié)果如表4所示，各因素對(duì)LMWF得率的影響為酶解溫度>底物質(zhì)量濃度>酶解pH，最佳組合為A2B2C2，即底物質(zhì)量濃度為15 g/L，酶解pH 6.0，在55 ℃酶解24 h，此條件下LMWF得率為52.82%，高于正交實(shí)驗(yàn)中的最高值，為最佳酶解條件。與已知的巖藻多糖酶相比，菌株WA1207來(lái)源的巖藻多糖酶在降解巖藻多糖方面具有一定的優(yōu)勢(shì)。來(lái)自海洋細(xì)菌FormosaalgaeKMM 3553的巖藻多糖酶，于34 ℃下水解巖藻多糖72 h，其LMWF的得率為45%[24]；從海洋軟體動(dòng)物的消化腺中分離得到的巖藻多糖酶，在37 ℃酶解巖藻多糖24 h后，再次添加酶液水解24 h，測(cè)得其得率為73%[13]。這表明來(lái)源于A.chevalieriWA1207的巖藻多糖酶能在相對(duì)短的時(shí)間下獲得相對(duì)多的LMWF。

表4 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 The results of orthogonal test

2.2.2 LMWF的分級(jí)純化

通過(guò)蛋白去除、透析除鹽和超濾分級(jí)共獲得了3種不同分子質(zhì)量的LMWF，冷凍干燥后采用HPGPC法進(jìn)行分子質(zhì)量測(cè)定，結(jié)果如圖5和表5所示。

圖5 不同LMWF的HPGPC圖譜Fig.5 The HPGPC chromatographs of different LMWF注：圖中標(biāo)記的分子質(zhì)量為峰最高點(diǎn)的分子質(zhì)量

組分F1的重均分子質(zhì)量(Mw)為1 250 Da且分散系數(shù)為1.4，表明該聚合物中LMWF的分子質(zhì)量分布范圍窄，鏈長(zhǎng)差距較小；F2的重均分子質(zhì)量為2 505 Da，其分散系數(shù)為2.3，說(shuō)明其分子質(zhì)量分布范圍較寬；F3的分散系數(shù)大，表明該聚合物中LMWF的鏈長(zhǎng)差距大，分子質(zhì)量分布范圍大。

表5 HPGPC測(cè)定產(chǎn)物的相對(duì)分子質(zhì)量Table 5 Determination of relative molecular weight of products by HPGPC

2.3 LMWF的抗氧化活性

如表6所示，巖藻多糖經(jīng)水解后獲得的LMWF的抗氧化活性均有提高。LMWF的·OH清除能力變化明顯，且F1>F2>F3>F0，分子質(zhì)量越小，清除活性越高，這是因?yàn)楫?dāng)HMWF被水解成LMWF時(shí)，LMWF會(huì)暴露出更多的還原和非還原端，且分子質(zhì)量越小，數(shù)量越多，抗氧化活性越強(qiáng)。由此可知，分子質(zhì)量是影響LMWF 的·OH清除活性的重要因素，清除活性與分子質(zhì)量大小呈負(fù)相關(guān)。經(jīng)酶解生成的LMWF的DPPH自由基清除能力變化小，F(xiàn)1、F2和F3的清除能力基本相同，表明分子質(zhì)量<10 kDa的LMWF的DPPH自由基清除能力受分子質(zhì)量的影響較小。在總氧自由基清除能力方面，LMWF的清除能力均遠(yuǎn)高于F0，抗氧化能力明顯提高，其中F2(2 505 Da)的清除能力最高，其次為F3(8 227 Da)，最后為F1(1 250 Da)。綜上可知，分子質(zhì)量降低后的LMWF的·OH清除能力和總氧自由基能力均明顯提高，表明<10 kDa的LMWF具有良好的抗氧化活性。

表6 巖藻多糖的抗氧化活性Table 6 Antioxidant activity of fucoidan

3 結(jié)論

從酒曲中篩選得到1株產(chǎn)巖藻多糖酶的菌株，其酶活力為0.414 U/mL，與之前的研究相比，真菌A.chevalieriWA1207的巖藻多糖酶活力具有一定的優(yōu)勢(shì)。酶水解實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，該酶能在不損失硫酸基團(tuán)的條件下水解巖藻多糖，穩(wěn)定生成分子質(zhì)量<10 kDa的LMWF。該菌株的發(fā)現(xiàn)表明以酒曲為來(lái)源篩選產(chǎn)巖藻多糖酶的菌株是一個(gè)可深入探索的新方向，豐富了產(chǎn)巖藻多糖酶菌株的來(lái)源，將巖藻多糖酶的來(lái)源從海洋微生物擴(kuò)大到了陸生微生物?？寡趸瘜?shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，酶水解后得到(<10 kDa)的LMWF抗氧化活性遠(yuǎn)優(yōu)于未水解前巖藻多糖(F0)，表明利用該酶水解巖藻多糖降低其分子質(zhì)量是一種十分有效的方法，這為后續(xù)利用該酶降解巖藻多糖、解析巖藻多糖結(jié)構(gòu)、探索巖藻多糖結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。