烷基鏈結(jié)構(gòu)對吐溫表面活性劑包載姜黃素的影響

鄭雨晴，王小永

（華東理工大學化學與分子工程學院，上海 200237）

姜黃素（Curcumin）是一種天然植物多酚，在許多生理和藥理實驗中已被證實具有抗癌、抗氧化以及抗阿爾茲海默癥等重要活性[1-3]。自20 世紀以來，姜黃素一直受到國內(nèi)外學者的廣泛關(guān)注。姜黃素分子含有芳香環(huán)和雙鍵，這是姜黃素具有生理和藥理活性的分子結(jié)構(gòu)根源。但是，與其他高疏水性多酚化合物類似，姜黃素在水溶液中的溶解度低、穩(wěn)定性差，嚴重限制了姜黃素的實際應用效果[4]。

膽酸鹽、十二烷基三甲基溴化銨、吐溫-20 等表面活性劑可以通過疏水、氫鍵和靜電等弱分子間作用力對姜黃素進行包載，從而有效提高姜黃素的溶解度、穩(wěn)定性和生物利用度[5-7]。劉調(diào)調(diào)等[8]制備了十二烷基三甲基溴化銨/吐溫-80 混合膠束，發(fā)現(xiàn)兩種表面活性劑之間的偶極-離子作用有利于提高姜黃素的溶解度。Leung 等[6]發(fā)現(xiàn)帶正電荷的烷基季銨鹽表面活性劑膠束可以與帶負電荷的姜黃素產(chǎn)生靜電吸引作用，能夠抑制姜黃素的堿性水解，使姜黃素的穩(wěn)定性提高了至少8 倍。本課題組在使用吐溫表面活性劑包載姜黃素時，發(fā)現(xiàn)吐溫表面活性劑的烷基鏈越長，越有利于姜黃素通過疏水作用包載于吐溫聚集體中的疏水區(qū)域[9]。表面活性劑烷基鏈結(jié)構(gòu)的變化不僅影響其生成的聚集體結(jié)構(gòu)，也會改變活性分子的包載性能[10-11]。但烷基鏈不飽和度和烷基鏈數(shù)目對表面活性劑包載姜黃素的影響鮮有報道。

本文選擇吐溫-60、吐溫-80 和吐溫-85 3 種表面活性劑，探究烷基鏈雙鍵和烷基鏈數(shù)目對表面活性劑包載姜黃素的影響。這3 種吐溫表面活性劑具有相同的頭基，但尾部烷基鏈結(jié)構(gòu)不同：吐溫-60 含有1 條C18飽和烷基鏈，吐溫-80 的C18烷基鏈中含有1 個雙鍵，而吐溫-85 含有3 條與吐溫-80 相同的不飽和烷基鏈。在表面活性劑濃度為1 mmol/L 時，吐溫-80 在水溶液中生成膠束，而吐溫-60 和吐溫-85 生成粒徑不同的囊泡。本文考察了姜黃素在3 種吐溫聚集體中的穩(wěn)定性和結(jié)合常數(shù)，并通過紫外吸收光譜、熒光發(fā)射光譜和核磁共振氫譜研究了姜黃素在不同吐溫聚集體中的包載位置和作用力。

1 實驗部分

1.1 試劑

姜黃素（w=65%）、芘（w=99%）、吐溫-60（Tween-60，w=99%）、吐溫-80（Tween-80，w=99%），吐溫-85（Tween-85，w=99%），均購于Sigma-Aldrich（上海）貿(mào)易有限公司；重水（D2O,w=99%），購于北京百靈威科技有限公司。

1.2 表面張力的檢測

使用表面張力儀（德國Dataphysics 公司 DCAT21型）測定吐溫-60、吐溫-80 和吐溫-85 溶液的表面張力（γ）。測定過程中，使用恒溫水浴控制樣品溫度為298 K。

1.3 粒徑的測定

使用英國Malvern Delsa Nano 型動態(tài)光散射儀測定1 mmol/L 吐溫聚集體的粒徑。儀器溫度調(diào)至298 K 后預熱 30 min，樣品恒溫 5 min 后開始測定，每個樣品測定 3 次以保證實驗數(shù)據(jù)的準確性。

1.4 芘的微極性參數(shù)

以芘為熒光探針，使用熒光光譜儀（日本島津Shimadzu RF-5301 型）測定芘的穩(wěn)態(tài)熒光光譜。使用芘的微極性參數(shù)（I1/I3，即373 nm 和384 nm 處芘熒光發(fā)射強度比值）來表示吐溫聚集體疏水區(qū)域的疏水性。樣品中芘的濃度固定為5×10?7mol/L，激發(fā)波長為335 nm，掃描范圍為350～500 nm，溫度控制在298 K。

1.5 姜黃素的穩(wěn)定性

將10 μmol/L 姜黃素分別加入到水和3 種吐溫聚集體中。在298 K 下，根據(jù)姜黃素在425 nm 處的紫外吸收強度隨時間的變化規(guī)律，考察姜黃素的穩(wěn)定性。使用紫外光譜儀（日本島津Shimadzu UV-1800型）測定姜黃素的紫外吸收強度的變化情況。

1.6 姜黃素的結(jié)合常數(shù)

將不同濃度的姜黃素（2～12.5 μmol/L）加入到水和3 種吐溫聚集體中，在298 K 下，使用紫外光譜儀（日本島津Shimadzu UV-1800 型）檢測姜黃素在425 nm處的紫外吸收強度，并通過Benesi-Hildebrand 方程計算姜黃素與吐溫-60 囊泡、吐溫-80 膠束和吐溫-85 囊泡的結(jié)合常數(shù)[12]。

1.7 姜黃素的紫外吸收和熒光發(fā)射光譜

在298 K 下，將10 μmol/L 姜黃素分別加入到水和3 種吐溫聚集體中，使用紫外光譜儀（日本島津Shimadzu UV-1800 型）測定姜黃素樣品的紫外吸收光譜。同時，使用熒光光譜儀（日本島津Shimadzu RF-5301 型）測定姜黃素樣品的熒光發(fā)射光譜。測定過程中，紫外波長掃描范圍為325～525 nm，熒光激發(fā)波長為425 nm，掃描范圍為450～600 nm。

1.8 吐溫表面活性劑樣品的核磁共振氫譜（1HNMR）

對于包載和未包載姜黃素的吐溫-60 囊泡、吐溫-80 膠束和吐溫-85 囊泡樣品，使用核磁共振波譜儀（德國Brucker 公司Ascend 600 型）測定其1H-NMR。實驗樣品所用的溶劑為重水。

2 結(jié)果與討論

2.1 吐溫表面活性劑的聚集過程

采用表面張力法研究吐溫表面活性劑的膠束生成過程，結(jié)果如圖1 所示。吐溫-60、吐溫-80 和吐溫-85的表面張力隨濃度對數(shù)的變化曲線均出現(xiàn)了明顯的突變點，即為吐溫的臨界膠束濃度（CMC）。當吐溫濃度低于CMC 時，吐溫分子會自發(fā)地在溶液表面進行定向吸附，使溶液表面張力減小；當吐溫濃度高于CMC 時，吐溫分子在溶液表面定向吸附達到飽和，同時在溶液內(nèi)部生成吐溫膠束，使溶液表面張力趨于穩(wěn)定[13]。從圖1 可得出吐溫-60、吐溫-80 和吐溫-85的CMC 值分別為0.028、0.021 mmol/L 和0.018 mmol/L，與其他研究者使用表面張力、熒光光譜等方法報道的CMC 值接近[14]。相比烷基鏈長度相當?shù)碾x子型表面活性劑，3 種吐溫表面活性劑表現(xiàn)出極低的CMC 值[15-16]。由于其非離子性，吐溫表面活性劑的極性頭基之間不存在靜電排斥作用，因而更容易在溶液中生成膠束。吐溫-60 與吐溫-80 頭基大小和烷基鏈長度完全相同，但吐溫-80 的表面張力值及CMC 值均小于吐溫-60[17]，歸因于吐溫-80 烷基鏈中的雙鍵引起的偶極-偶極相互作用[18]。雖然吐溫-85 烷基鏈中含有雙鍵，但是每個吐溫-85 分子中含有3 條烷基鏈，這使其能夠產(chǎn)生最強的疏水聚集作用。因此，吐溫-85 在3 種表面活性劑中具有最小的表面張力及CMC 值。

圖1 吐溫-60、吐溫-80 和吐溫-85 的表面張力曲線Fig.1 Surface tension curves of Tween-60, Tween-80 and Tween-85

當表面活性劑濃度高于CMC 時，繼續(xù)增大濃度能夠使表面活性劑聚集體結(jié)構(gòu)發(fā)生改變[19]。當表面活性劑濃度等于CMC 時，3 種吐溫樣品均為澄清透明溶液。隨著表面活性劑濃度逐漸增大到1 mmol/L，吐溫-80 溶液仍保持澄清透明狀態(tài)，而吐溫-60 溶液輕微泛藍，吐溫-85溶液呈現(xiàn)明顯泛藍狀態(tài)且具有一定濁度（圖2）。在1 mmol/L 時，不同表面活性劑樣品的外觀狀態(tài)表明3 種吐溫生成了不同的聚集體結(jié)構(gòu)。由于對光線散射作用的吸收強度不同，表面活性劑球形膠束溶液通常呈現(xiàn)澄清透明狀態(tài)，而表面活性劑溶液泛藍是生成囊泡的主要特征之一[20]。為了進一步探究3 種吐溫生成的聚集體結(jié)構(gòu)，采用動態(tài)光散射儀測定了濃度為1 mmol/L的吐溫-60、吐溫-80 和吐溫-85 的粒徑分布曲線，結(jié)果如圖3所示?？梢钥闯?，3 種吐溫樣品均具有單一的聚集體粒徑分布，吐溫-80 樣品的粒徑約為10 nm，而吐溫-60 和吐溫-85 樣品的粒徑分別約為92 nm 和150 nm。基于吐溫分子尺寸、吐溫濃度以及實驗或計算機模擬方法，吐溫球形膠束的粒徑范圍為4～10 nm[21]。Sahu 等[22]報道了濃度為1.25 mmol/L 時吐溫-80 球形膠束的粒徑約為9 nm，與吐溫-80 樣品的測定結(jié)果基本一致。因此，樣品外觀和動態(tài)光散射數(shù)據(jù)均可以說明吐溫-80 在1 mmol/L 時生成了球形膠束，更高的粒徑結(jié)果則說明吐溫-60 和吐溫-85 在濃度為1 mmol/L 時生成了更大尺寸的囊泡結(jié)構(gòu)，這也與許多研究者使用光散射、電鏡等方法報道的吐溫囊泡的粒徑范圍相符[7, 23-26]。

圖2 吐溫-60、吐溫-80 和吐溫-85 在1 mmol/L 時的表觀形貌Fig.2 Appearance of Tween-60, Tween-80 and Tween-85 at 1 mmol/L

圖3 吐溫-60、吐溫-80 和吐溫-85 的粒徑分布曲線Fig.3 Size distribution curves of Tween-60, Tween-80 and Tween-85

不同結(jié)構(gòu)吐溫聚集體的生成可以利用臨界堆積參數(shù)理論來解釋[19]。表面活性劑的臨界堆積參數(shù)P=V/（A0l）（V為表面活性劑烷基鏈的體積，A0為表面活性劑頭基的有效橫截面積，l為表面活性劑烷基鏈的長度）。當P小于 1/3 時，表面活性劑生成球形膠束；當P為0.5～1 時，表面活性劑生成囊泡。根據(jù)吐溫-80 分子的烷基鏈和頭基數(shù)據(jù)，Amani 等[21]計算得到吐溫-80 的P為0.07，此低P值可以解釋吐溫-80 膠束的生成。吐溫-60 的烷基鏈中不含有雙鍵，相比吐溫-80 具有更高的柔軟性，因而吐溫-60聚集體容易由球形膠束轉(zhuǎn)變?yōu)槟遗荨Ｏ啾韧聹?80，烷基鏈的增多能夠使吐溫-85 的P值增大，更有利于球形膠束向囊泡的轉(zhuǎn)變，從而生成了粒徑更大的囊泡[27]。另一方面，由芘探針實驗測定的吐溫-80 膠束、吐溫-60和吐溫-85 囊泡的I1/I3值分別為1.28、1.23、1.13，說明其烷基鏈聚集區(qū)域的疏水性大小順序為[28]：吐溫-85囊泡 > 吐溫-60 囊泡 > 吐溫-80 膠束。

2.2 姜黃素在吐溫聚集體中的穩(wěn)定性

姜黃素的紫外-可見光吸收強度隨時間的變化情況可反映姜黃素在吐溫聚集體中的穩(wěn)定性。圖4 示出了10 μmol/L 游離姜黃素和吐溫-60 囊泡、吐溫-80 膠束和吐溫-85 囊泡（吐溫表面活性劑濃度均為1 mmol/L）包載姜黃素的降解曲線。實驗結(jié)果表明，游離姜黃素在180 min 后降解了約27%，而當使用吐溫-60 囊泡、吐溫-80 膠束和吐溫-85 囊泡包載姜黃素后，姜黃素的降解率分別減少至7.7%、14.1%和2.9%?？碌さ萚29]使用表面活性劑膠束包載姜黃素，能夠使姜黃素的降解率降低至3.10%～23.7%。相比之下，吐溫-85 囊泡表現(xiàn)出更好的包載效果，這可能是由于吐溫-85 囊泡的烷基鏈聚集雙分子層能夠為姜黃素提供更強的疏水環(huán)境。姜黃素在水溶液中的降解過程通常符合一級動力學反應[30]。使用一級動力學方程對姜黃素的降解數(shù)據(jù)進行擬合，得到游離姜黃素的降解速率常數(shù)為0.0018 min?1，而姜黃素在吐溫-60 囊泡、吐溫-80 膠束和吐溫-85 囊泡中的降解速率常數(shù)分別為0.00044、0.00082、0.00014 min?1。目前，游離姜黃素的降解過程和降解機理已經(jīng)有了不少研究，通常認為，由于其酮-烯醇結(jié)構(gòu)容易發(fā)生去質(zhì)子化，因而姜黃素在水環(huán)境中容易分解[31]。當姜黃素被吐溫聚集體包載后，能夠減弱姜黃素的酮-烯醇結(jié)構(gòu)與水的接觸，從而使姜黃素表現(xiàn)出更高的穩(wěn)定性。在3 種吐溫聚集體中，姜黃素的穩(wěn)定性大小順序為：吐溫-85 囊泡>吐溫-60 囊泡>吐溫-80 膠束。雖然吐溫-80比吐溫-60 的CMC值低，但是雙鍵的存在會增大吐溫-80 烷基鏈的剛性，這能夠減弱吐溫-80 的不飽和烷基鏈和姜黃素的芳香環(huán)之間的疏水作用[32]。同時，吐溫-80 膠束疏水區(qū)域可能會產(chǎn)生部分水合，這也會降低吐溫-80 膠束對姜黃素的保護作用。吐溫-85 分子中含有3 條烷基鏈，因此吐溫-85 囊泡的雙分子層比另外2 種吐溫聚集體具有更高疏水性，從而使姜黃素在吐溫-85 囊泡中表現(xiàn)出最高的穩(wěn)定性。

圖4 游離姜黃素和吐溫聚集體包載姜黃素的降解曲線Fig.4 Degradation curves of free curcumin and curcumin encapsulated by Tween aggregates

2.3 姜黃素與吐溫聚集體的結(jié)合常數(shù)

通過測定不同濃度的姜黃素在3 種吐溫聚集體中最大紫外吸收強度的變化，并依據(jù)Benesi-Hildebrand方程計算得出姜黃素與3 種吐溫聚集體的結(jié)合常數(shù)[12]。(Kb)

式中：A0為游離姜黃素的最大紫外吸收強度，A為3 種吐溫聚集體包載姜黃素的最大紫外吸收強度，c為姜黃素的濃度，a為常數(shù)。

根據(jù)圖5 中1/(A?A0) 與 1/c的線性擬合曲線，姜黃素與吐溫-60 囊泡、吐溫-80 膠束和吐溫-85囊泡的結(jié)合常數(shù)分別為2.85 ×104、0.99×104、3.06×105L/mol，符合文獻報道的姜黃素與表面活性劑的結(jié)合常數(shù)范圍[33]。相比于陰離子表面活性劑琥珀酸二異辛酯磺酸鈉[34]，吐溫表面活性劑與姜黃素之間的結(jié)合常數(shù)更大。這是由于陰離子表面活性劑與姜黃素之間存在一定的靜電排斥作用，不利于對姜黃素的包載。在3 種吐溫聚集體中，姜黃素與吐溫-85 囊泡之間具有最大的結(jié)合常數(shù)，這與姜黃素的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)一致。吐溫-85 囊泡具有最高的疏水性，其雙分子層疏水區(qū)域能夠為姜黃素提供最適宜的包載環(huán)境，因而表現(xiàn)出最高的姜黃素包載能力。

圖5 吐溫-60、吐溫-80 和吐溫-85 聚集體的1/(A?A0)對1/c 線性擬合曲線Fig.5 1/(A?A0) vs.1/c fitting curves of Tween-60, Tween-80 and Tween-85 aggregates

2.4 吐溫聚集體包載姜黃素的紫外-可見吸收和熒光發(fā)射光譜

姜黃素是一種高度共軛性分子，其紫外吸收和熒光發(fā)射光譜性質(zhì)對周圍環(huán)境的變化非常敏感[35-36]。如圖6 所示，游離姜黃素的紫外吸收峰較寬，熒光發(fā)射峰很弱。當姜黃素包載于吐溫聚集體中時，姜黃素的芳香環(huán)、雙鍵能夠和吐溫的烷基鏈產(chǎn)生疏水相互作用，使姜黃素包載于吐溫聚集體的疏水區(qū)域。因此，姜黃素從極性較大的水環(huán)境變?yōu)闃O性較小的膠束或囊泡環(huán)境，其紫外吸收和熒光發(fā)射強度顯著提高[5]。一方面，低極性的包載環(huán)境能夠使姜黃素的π- π?和n- π?躍遷吸收峰發(fā)生分離，所以，吐溫聚集體包載的姜黃素在 425 nm 處有顯著增強的吸收峰，同時在450 nm 處顯示出肩峰[37]；另一方面，姜黃素的熒光基團在水環(huán)境中不穩(wěn)定，其熒光發(fā)射強度較弱[38]，但當姜黃素由水環(huán)境轉(zhuǎn)移至極性極小的吐溫膠束或囊泡環(huán)境后，姜黃素熒光發(fā)射峰發(fā)生藍移，由553 nm向499 nm偏移。3 種吐溫聚集體中，姜黃素的紫外吸收強度大小順序為：吐溫-85 囊泡>吐溫-60 囊泡>吐溫-80 膠束。3 種吐溫聚集體包載姜黃素的熒光強度也具有相同的大小變化，與姜黃素穩(wěn)定性和結(jié)合常數(shù)的結(jié)果一致。值得注意的是，姜黃素在吐溫-80 膠束中表現(xiàn)出最低的紫外吸收和熒光發(fā)射強度，證實雙鍵會增大吐溫-80 烷基鏈的剛性，導致吐溫-80 不飽和烷基鏈與姜黃素的剛性分子結(jié)構(gòu)之間存在錯配，因此會使吐溫-80 膠束與姜黃素之間的疏水聚集作用降低[39]。在研究表面活性劑體系或表面活性劑與其他分子的相互作用時，一些研究者觀察到烷基鏈不飽和度的增大不利于分子相互聚集，甚至可以抵消烷基鏈增長帶來的分子相互聚集的增強作用[14,17]。然而，吐溫-85 分子含有3 條烷基鏈，烷基鏈數(shù)目的增多能夠極大促進吐溫-85 分子之間的疏水聚集作用，從而生成具有最強疏水性的吐溫-85 囊泡。因此，吐溫-85 囊泡對姜黃素具有最高的包載能力，使姜黃素表現(xiàn)出最大的紫外吸收強度和熒光發(fā)射強度。

圖6 游離姜黃素和吐溫聚集體包載姜黃素的紫外吸收光譜（a）和熒光發(fā)射光譜（b）Fig.6 UV absorption spectra (a) and fluorescence emission spectra (b) of free curcumin and curcumin encapsulated by Tween aggregates

2.5 姜黃素在吐溫聚集體中的包載位置

姜黃素在表面活性劑聚集體中的包載位置與表面活性劑的分子結(jié)構(gòu)有密切關(guān)系[40]。1H-NMR 測定結(jié)果可以進一步揭示姜黃素在3 種吐溫聚集體中的包載位置。表1 和圖7 分別示出了吐溫-60、吐溫-80 和吐溫-85 包載姜黃素前后的質(zhì)子化學位移和1HNMR 圖譜。姜黃素的芳香環(huán)、雙鍵可以與吐溫-60的烷基鏈產(chǎn)生疏水作用，能夠使吐溫-60 烷基鏈中亞甲基上質(zhì)子b 的化學位移向高場移動。在加入姜黃素后，吐溫-60 酯基相鄰基團上的質(zhì)子 e、f 和 g的化學位移也向高場方向移動。這個結(jié)果表明姜黃素在吐溫-60 囊泡中的包載位置靠近吐溫-60 極性頭基，能夠與吐溫-60 的酯基生成氫鍵[23,41]。當包載姜黃素后，吐溫-80 分子中質(zhì)子b、e、f、g 的化學位移表現(xiàn)與吐溫-60 相似的變化。同時，在吐溫-80 烷基鏈雙鍵及其相鄰基團中，質(zhì)子d 和c 也出現(xiàn)了化學位移變化。Karanth 等[32]發(fā)現(xiàn)雙鍵會增大吐溫-80 烷基鏈的剛性，造成吐溫-80 膠束中烷基鏈存在彎曲狀態(tài)，使吐溫-80 膠束疏水區(qū)域中烷基鏈排列更加松散、極性更高。相比吐溫-60，吐溫-80 極性頭基附近的質(zhì)子e 表現(xiàn)出更明顯的化學位移變化，這可能是由于姜黃素在吐溫-80 膠束中的包載位置更靠近吐溫-80 的極性頭基，可以產(chǎn)生更強的氫鍵作用。對于吐溫-85，雖然包載姜黃素使其烷基鏈上質(zhì)子b、c、d 的化學位移發(fā)生變化，但是吐溫-85 極性頭基附近質(zhì)子的化學位移并沒有變化。因此，姜黃素在吐溫-85 囊泡中的包載位置應該更加靠近囊泡雙分子層的疏水中心區(qū)域而遠離吐溫-85 的極性頭基。綜上所述，吐溫-60 囊泡和吐溫-80 膠束對姜黃素的包載作用力除了疏水作用外還有氫鍵作用，而吐溫-85 囊泡對姜黃素的包載作用力主要為疏水作用。

圖7 吐溫-60、吐溫-80 和吐溫-85 包載姜黃素前后的1H-NMR 圖譜Fig.7 1H-NMR spectra of Tween-60, Tween-80 and Tween-85 before and after encapsulating curcumin

表1 吐溫表面活性劑包載姜黃素前后分子中質(zhì)子的化學位移Table 1 Chemical shifts of protons of Tween surfactants before and after encapsulating curcumin

3 結(jié) 論

烷基鏈雙鍵和烷基鏈數(shù)目對吐溫表面活性劑包載姜黃素具有重要的影響。紫外吸收和熒光發(fā)射光譜結(jié)果說明姜黃素包載于吐溫聚集體的烷基鏈疏水區(qū)域，雙鍵的存在會增大烷基鏈的剛性，使吐溫-80 膠束疏水區(qū)域排列更加松散、極性更高，導致吐溫-80 膠束包載姜黃素比吐溫-60 囊泡包載姜黃素有更低的穩(wěn)定性、結(jié)合常數(shù)、紫外吸收和熒光發(fā)射強度。具有3 條不飽和烷基鏈的吐溫-85 能夠生成大粒徑的囊泡結(jié)構(gòu)，為姜黃素提供了最適宜的雙分子層疏水區(qū)域，對姜黃素具有最好的包載效果。因此通過改變表面活性劑的烷基鏈結(jié)構(gòu)，可以精細調(diào)節(jié)表面活性劑聚集體疏水區(qū)域的微觀結(jié)構(gòu)，使表面活性劑聚集體作為一種高效載體應用于姜黃素等植物多酚活性分子的包載及性質(zhì)調(diào)控。