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    艾灸足三里、太溪對腎虛-黃體抑制流產(chǎn)模型孕鼠蛻膜組織細(xì)胞凋亡及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

    2022-12-25 07:48:12陳鵬典劉昱磊邱婷婷覃曉玲
    中國醫(yī)藥導(dǎo)報 2022年33期
    關(guān)鍵詞:蛻膜孕酮艾灸

    胡 珊 陳鵬典 寧 艷 馬 飛 劉昱磊 邱婷婷 覃曉玲 唐 夢

    南方醫(yī)科大學(xué)附屬深圳婦幼保健院中醫(yī)科,廣東深圳 518028

    自然流產(chǎn)是目前全球生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的熱點難點,發(fā)生在妊娠12 周內(nèi)稱為早期自然流產(chǎn)。近年研究[1-2]表明,細(xì)胞凋亡是調(diào)控細(xì)胞增殖、保證胎盤組織結(jié)構(gòu)和功能的重要調(diào)控機制,妊娠過程中胎盤絨毛和蛻膜的細(xì)胞凋亡與增殖處于一種相對平衡的狀態(tài),當(dāng)這種平衡被打破可能影響妊娠結(jié)局?,F(xiàn)代研究[3]發(fā)現(xiàn),中醫(yī)藥可通過調(diào)節(jié)生殖內(nèi)分泌功能和免疫因子功能、協(xié)調(diào)母胎界面滋養(yǎng)細(xì)胞增殖凋亡及改善胎盤微循環(huán)障礙等環(huán)節(jié)干預(yù)自然流產(chǎn)。本課題組前期臨床研究[4-5]發(fā)現(xiàn),“補腎健脾”中藥可一定程度改善早期妊娠先兆流產(chǎn)患者焦慮情緒狀態(tài)及免疫和凝血功能,提高保胎療效。在此基礎(chǔ)上,觀察“補腎健脾”灸法對腎虛-黃體抑制流產(chǎn)模型孕鼠蛻膜組織相關(guān)凋亡細(xì)胞蛋白表達(dá)的影響,以探討艾灸防治早期流產(chǎn)的可能作用機制。

    1 材料與方法

    1.1 實驗動物

    選購廣東省實驗動物中心SD 大鼠雄性16 只、雌性36 只,周齡8~10 周,體重220~250 g,許可證號為SCXK(粵)2018-0002,實驗動物使用許可證號為SYXK(粵)2020-0230。購入后于SPF 實驗動物中心空調(diào)下架式單籠喂養(yǎng),環(huán)境溫度20~25℃,濕度50%~60%,光照、黑暗各12 h 交替,標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料、滅菌注射用水喂養(yǎng)。本實驗已通過深圳拓普生物科技有限公司動物實驗福利和倫理審查(TOP-IACUC-2020-07-0011)。

    1.2 主要儀器及試劑

    1.2.1 主要儀器 超凈工作臺(型號:YJ-VS-1,無錫一凈凈化設(shè)備有限公司);倒置顯微鏡(型號:Mshot MF53,廣州明美光電有限公司);生物組織包埋機(型號:EG11504,德國Leica 公司);組織脫水機(型號:ASP3 00S,德國Leica 公司);冷卻臺(型號:EG1150C,德國Leica 公司);石蠟切片機(型號:RM2235,德國Leica公司)等。

    1.2.2 試劑 地屈孕酮片(360397,10 mg/片,荷蘭Abbott公司);米非司酮片(200402,25 mg/片,廣州朗圣藥業(yè)有限公司);羥基脲片(0B0193D05,0.5 g/片,齊魯制藥有限公司);TUNEL 檢測試劑盒(G1507,塞維爾生物科技有限公司);大鼠抗Bcl-2 多克隆抗體(12789-1-AP)、大鼠抗Caspase-3 多克隆抗體(19677-1-AP)、大鼠抗Bax 多克隆抗體(50599-2-Ig)均來自Proteintech 公司;清艾條(200505,江蘇康美制藥有限公司)。

    1.3 實驗方法

    1.3.1 動物分組、造模與干預(yù)治療 雌鼠(36 只)和雄鼠(16 只)合籠交配。合籠第1 天晨起雌鼠行陰道涂片,觀察到大片精子及陰道栓脫落作為妊娠第1 天[6]。選取32 只孕鼠采用隨機數(shù)字表法將其分為正常組、模型組、地屈孕酮組和艾灸組,每組8 只。其他四只雌鼠未妊娠。除正常組以外,其他組均采用“羥基脲+米非司酮”造模[7]:從妊娠第1 天開始,每天上午正常組予4 ml生理鹽水灌胃;模型組予2 ml 蒸餾水灌胃;造模同時,地屈孕酮組予生理鹽水+地屈孕酮片(3.02 mg/kg)2 ml/d 灌胃;艾灸組予艾灸雙側(cè)足三里和太溪穴,其定位參照大鼠常用針灸穴位[8],用艾條懸灸以上兩組穴位,持續(xù)時間為15 min/(次·穴),每日1 次至動物處死。下午除正常組予蒸餾水灌胃外,其余各組均予生理鹽水+羥基脲(450 mg/kg)1 ml 灌胃,共9 d。在妊娠第10 天早上除正常組外,其余各組均分別加用米非司酮(RU486)4.0 mg/kg,以造成腎虛-黃體抑制流產(chǎn)模型。孕鼠出現(xiàn)形體消瘦,精神萎靡,毛色枯槁,喜蜷縮,脫毛,小便頻且清長,納呆,甚至出現(xiàn)陰道出血,提示造模成功[9]。

    1.3.2 標(biāo)本制備與采集 各組均在妊娠第11 天(除正常組外,其他組均在灌服米非司酮24 h 后)處死大鼠,取子宮濾紙吸干,計算胚胎數(shù)并測量子宮直徑。將取得的新鮮蛻膜組織用甲醛溶液固定、石蠟包埋、組織切片、TUNEL 檢測及免疫組化等制作。

    1.4 觀察指標(biāo)及檢測方法

    1.4.1 一般情況 觀察大鼠的精神狀態(tài)、鼠毛、納食、大小便及活動情況等。

    1.4.2 免疫組織化學(xué)法測定Bax、Bcl-2 和Caspase-3蛋白的表達(dá) 將石蠟切片用二甲苯及梯度酒精脫蠟至水,經(jīng)EDTA 抗原修復(fù),并按標(biāo)準(zhǔn)分別使用5%山羊血清、分別予兔抗大鼠Bax 多克隆抗體(1∶200 稀釋)、兔抗大鼠Bcl-2 多克隆抗體(1∶200 稀釋)、兔抗大鼠Caspase-3 多克隆抗體(1∶200 稀釋)、兔抗大鼠Fas 多克隆抗體(1∶200 稀釋)、兔抗大鼠FasL 多克隆抗體(1∶200 稀釋)、兔抗大鼠P53 多克隆抗體(1∶200 稀釋)及兔抗大鼠CDKN1A 多克隆抗體(1∶200 稀釋),4℃過夜,PBS 沖洗,二抗孵育,DAB 顯色,蘇木精返藍(lán)液返藍(lán),梯度酒精二甲苯脫水,中性樹膠封片等操作后,在顯微鏡下觀察棕色陽性點,高倍鏡(100×)下隨機選擇5 個不重疊的視野;采用Image-Pro Plus 6.0 圖像分析系統(tǒng),選用陽性區(qū)域積分光密度(optical density,OD)及陽性面積行統(tǒng)計分析,并計算陽性表達(dá)的平均OD 值。

    1.4.3 TUNEL 法測定原位細(xì)胞凋亡 檢測遵照試劑盒說明書進(jìn)行。石蠟切片常規(guī)脫蠟至水,新鮮稀釋的蛋白酶K 溶液消化,TBS 沖洗;加3%H2O2;加100 μl 1×TdT 平衡緩沖液,室溫孵育。加標(biāo)記反應(yīng)混合液,TBS洗;加終止緩沖液,室溫孵育;加封閉緩沖液;加稀釋過的1×偶聯(lián)物,室溫孵育;加DAB 顯色液,室溫孵育;dH2O 漂洗,甲基綠復(fù)染,脫水,透明,封片,顯微鏡下觀察。細(xì)胞核中有棕黃色顆粒者為陽性細(xì)胞。凋亡指數(shù)(apoptosisindex,AI)=凋亡細(xì)胞核數(shù)/總細(xì)胞核數(shù)。

    1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

    采用SPSS 20.0 軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。符合正態(tài)分布的計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,比較采用t 檢驗;多組間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗,計數(shù)資料采用例數(shù)表示。以P <0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 各組大鼠一般情況

    造模期間,與正常組比較,模型組孕鼠形體消瘦,精神萎靡,毛色枯槁,喜蜷縮,脫毛明顯,小便頻且清,納呆,妊娠約第6 天開始逐漸出現(xiàn)陰道出血;地屈孕酮組和艾灸組均可改善腎虛-黃體抑制流產(chǎn)模型一般體征,減少其陰道出血癥狀。

    2.2 各組大鼠子宮直徑及宮內(nèi)胚胎數(shù)比較

    與正常組比較,模型組大鼠子宮直徑減小,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P <0.05);與模型組比較,艾灸組子宮直徑均增大,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P <0.05);正常組和模型組,模型組和艾灸組宮內(nèi)胚胎總數(shù)比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P >0.05)。見表1。

    表1 各組大鼠子宮直徑及宮內(nèi)胚胎數(shù)比較()

    表1 各組大鼠子宮直徑及宮內(nèi)胚胎數(shù)比較()

    注 與正常組比較,aP <0.05;與模型組比較,bP <0.05

    2.3 各組大鼠蛻膜組織Bax、Bcl-2、Caspase-3 蛋白平均OD 值及細(xì)胞AI 值比較

    各組大鼠蛻膜組織Bax、Bcl-2 蛋白陽性染色位于細(xì)胞漿,Caspase-3 蛋白陽性染色位于細(xì)胞核和細(xì)胞漿,均呈棕黃色,Bax、Caspase-3 蛋白在正常組、地屈孕酮組及艾灸組中分布較為稀疏,在模型組分布較密集。見圖1。與正常組比較,模型組Bax、Caspase-3蛋白平均OD 值升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P <0.05),與模型組比較,艾灸組Bax、Caspase-3 蛋白平均OD值降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P <0.05)。見表2。Bcl-2蛋白在正常組、地屈孕酮組及艾灸組中分布較為密集,在模型組分布較為稀疏,且在地屈孕酮組染色較為明顯,正常組及艾灸組次之,模型組染色較輕。見圖1。與正常組比較,模型組Bcl-2 蛋白平均OD 值降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P <0.05),與模型組比較,艾灸組Bcl-2 蛋白平均OD 值升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P <0.05)。見表2。凋亡細(xì)胞陽性染色主要位于細(xì)胞核,呈棕黃色-黃色,在模型組中凋亡蛋白表達(dá)較為密集。見圖2。與正常組比較,模型組細(xì)胞AI 值升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P <0.05),與模型組比較,艾灸組細(xì)胞AI 值降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P <0.05)。見表2。

    表2 各組大鼠蛻膜組織Bax、Bcl-2、Caspase-3 蛋白平均OD 值及AI 值比較()

    表2 各組大鼠蛻膜組織Bax、Bcl-2、Caspase-3 蛋白平均OD 值及AI 值比較()

    注 與正常組比較,aP <0.05;與模型組比較,bP <0.05。OD:光密度;AI:凋亡指數(shù)

    圖1 四組大鼠蛻膜組織Bax、Bcl-2 和Caspase-3 蛋白表達(dá)水平(免疫組化法染色,100×)

    圖2 四組原位凋亡細(xì)胞表達(dá)比較(TUNEL 法,100×)

    3 討論

    細(xì)胞凋亡是機體清除病理性受損組織的一種重要途徑[10]。妊娠過程中,適當(dāng)?shù)牡蛲龀绦蚩纱龠M(jìn)蛻膜組織結(jié)構(gòu)改建并完善其功能,但過度表達(dá),尤其在妊娠早期,可引起蛻膜變性壞死,影響胚胎的正常發(fā)育,導(dǎo)致自然流產(chǎn)[11-12]。研究發(fā)現(xiàn)[13],蛻膜細(xì)胞發(fā)生凋亡時Bcl-2 與Bax 保持一個相對平衡,當(dāng)Bcl-2 過量表達(dá)時,則細(xì)胞存活;反之則導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。由此,研究者推測蛻膜細(xì)胞Bcl-2/Bax 比值降低會影響妊娠結(jié)局[14]。Caspase 蛋白酶也可通過線粒體途徑介導(dǎo)Bax 表達(dá),誘導(dǎo)細(xì)胞色素C 從線粒體釋放出來,激活Caspase-3,引發(fā)Caspase 級聯(lián)反應(yīng),引起蛻膜細(xì)胞凋亡[15]。

    中醫(yī)認(rèn)為,自然流產(chǎn)與脾腎功能不足有關(guān),名醫(yī)羅元愷教授根據(jù)“腎主生殖”理論提出“腎-天癸-沖任-子宮軸”概念,和現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的“下丘腦-垂體-卵巢軸”相似[16]。據(jù)此羅頌平教授團隊首創(chuàng)以羥基脲和米非司酮制備腎虛-黃體抑制(病證結(jié)合)流產(chǎn)大鼠模型[17-18]。該模型模擬了臨床上妊娠期腎虛和黃體抑制導(dǎo)致自然流產(chǎn)的病理狀態(tài),表現(xiàn)出腎虛癥狀、外周血孕酮水平下降、蛻膜孕激素受體表達(dá)被抑制等,均符合腎虛和黃體不健的早期先兆流產(chǎn)臨床表現(xiàn)。研究證實[19-20],灸法可改善卵巢儲備功能減退大鼠卵巢臟器指數(shù)及組織學(xué)形態(tài),調(diào)整大鼠動情周期、血清性激素和炎癥因子水平,并可降低先兆流產(chǎn)患者外周血Th17水平和Th17/Treg 比值,改善其妊娠結(jié)局。并可雙向調(diào)節(jié)Bcl-2、Bax、Caspase-3 蛋白表達(dá)[21-22]。其機制是通過光熱傳導(dǎo)刺激神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫系統(tǒng)發(fā)揮效應(yīng),是多靶點、多通道、多機制的綜合網(wǎng)絡(luò)效果[23]。本研究所選穴位足三里及太溪具有補腎健脾之功,在動物實驗中發(fā)現(xiàn)[24-25],二者對Bcl-2/Bax 比值及Caspase-3 蛋白表達(dá)均具有雙向調(diào)節(jié)作用。

    本研究結(jié)果示,與正常組比較,模型組Bax、Bcl-2和Caspase-3 蛋白表達(dá)異常,其凋亡細(xì)胞明顯增多,提示腎虛-黃體抑制模型大鼠流產(chǎn)與蛻膜組織細(xì)胞凋亡關(guān)系密切。艾灸足三里和太溪穴可明顯改善其流產(chǎn)情況和相關(guān)指標(biāo),且可達(dá)到與地屈孕酮相似的效果,提示艾灸足三里和太溪穴可通過上調(diào)腎虛-黃體抑制流產(chǎn)孕鼠蛻膜組織Bcl-2 蛋白表達(dá)并下調(diào)其Bax和Caspase-3 蛋白過量表達(dá),降低其AI 值,從而調(diào)控母胎界面細(xì)胞凋亡,發(fā)揮干預(yù)早期流產(chǎn)的作用。灸法無痛、無創(chuàng)傷的特點在臨床上接受性強,依從性高,具有很好的臨床價值。因此,后續(xù)大樣本的臨床研究具有重要的臨床意義。而對于艾灸發(fā)揮其他的作用如調(diào)節(jié)生殖內(nèi)分泌功能、調(diào)節(jié)免疫因子功能、改善胎盤微循環(huán)障礙等機制有待作者在以后的研究工作中繼續(xù)闡明。

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