馬梨形蟲病病原雙重?zé)晒釶CR快速檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用

高志強(qiáng)，汪 琳，尹 羿，張 偉，蒲 靜，趙相鵬，任 彤

（北京海關(guān)技術(shù)中心，北京 101113）

馬 梨 形 蟲 ?。╡quinE piroplasmosis，EP）又稱馬焦蟲病，是由蜱傳播的馬科動(dòng)物血液原蟲病。該病病原有兩種，分別為馬泰勒蟲（Theileria equi）和駑巴貝斯蟲（Babesia caballi）[1]，其中的任何一種都可引起馬科動(dòng)物的急性感染，主要表現(xiàn)為發(fā)熱、溶血性貧血、血紅蛋白尿、黃疸、脾腫大，甚至死亡。有證據(jù)表明，馬泰勒蟲可經(jīng)胎盤由母馬傳播給胎兒，造成流產(chǎn)、死產(chǎn)或新生幼駒梨形蟲病[2]。

無明顯臨床癥狀的隱性帶蟲馬科動(dòng)物進(jìn)入本病非疫區(qū)是造成本病傳播的主要原因[2]。因此，各國(guó)想要保持無EP 狀態(tài)，必須制定法規(guī)，防止感染動(dòng)物進(jìn)入。在國(guó)際馬匹交易及相關(guān)活動(dòng)中，均要求進(jìn)行EP 檢測(cè)[3-4]。對(duì)于隱性帶蟲馬科動(dòng)物，采用特異敏感的檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)非常必要。

cELISA 方法目前已廣泛應(yīng)用于進(jìn)出口馬匹的檢疫。馬泰勒蟲cELISA 檢測(cè)方法，是使用了重組馬泰勒蟲裂殖子抗原1（EMA-1）蛋白和特異性單克隆抗體建立的，是檢測(cè)動(dòng)物感染抗體的成熟和敏感方法，能夠檢出不同地域的馬泰勒蟲抗體[5]。駑巴貝斯蟲cELISA 檢測(cè)方法，目前是使用了棒狀體相關(guān)蛋白1（RAP-1）及其特異性單克隆抗體建立的[6]。

隨著EP 病原分子生物學(xué)的發(fā)展，一些針對(duì)馬泰勒蟲和駑巴貝斯蟲基因組特異位點(diǎn)擴(kuò)增的檢測(cè)方法也相繼出現(xiàn)，如PCR、套式PCR、LAMP 以及定量PCR 等。本研究通過對(duì)國(guó)內(nèi)外不同地理區(qū)域的馬泰勒蟲EMA1 基因以及駑巴貝斯蟲18S rRNA進(jìn)行序列比對(duì)，設(shè)計(jì)2 套帶有不同熒光素標(biāo)記的MGB 引物探針，經(jīng)體系優(yōu)化，建立了可同時(shí)檢測(cè)馬泰勒蟲和駑巴貝斯蟲的雙重?zé)晒釶CR檢測(cè)方法，并應(yīng)用該方法，對(duì)10 份進(jìn)口馬全血和20 份馬血清進(jìn)行了檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒核酸及被檢樣品 西尼羅病毒（West Nile virus）NY-99、馬動(dòng)脈炎病毒CVL Bucyrus、馬流感病毒A/Equine/Xibei/1/2007（H3N8）、東部馬腦脊髓炎病毒ssp. North American variant、西部馬腦脊髓炎病毒McMillan 等病原的cDNA 以及馬皰疹病毒1型、馬鏈球菌獸疫亞種（C55100）的核酸，均為本實(shí)驗(yàn)室保存；2018 年進(jìn)口的20 份馬血清及10 份馬全血，由本實(shí)驗(yàn)室收集保存。

1.1.2 主要試劑 血液/組織/細(xì)胞基因組提取試劑盒（DP304），購(gòu)自天根生化科技有限公司；Ex HS Taq DNA 聚合酶、dNTP 等，購(gòu)自TaKaRa 公司；核酸純化柱及套管，購(gòu)自上海生工。

1.1.3 主要設(shè)備 7500 熒光PCR 儀以及AB 9700 PCR 儀，均為AB 公司產(chǎn)品；毛細(xì)管電泳儀QIAxcel，為QIAGEN 公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物和探針合成 對(duì)于馬泰勒蟲，隨機(jī)選取不同地域的EMA1 基因進(jìn)行序列比對(duì)，選取保守位置，設(shè)計(jì)引物探針（圖1）；對(duì)于駑巴貝斯蟲，則比對(duì)馬泰勒蟲和駑巴貝斯蟲的18S rRNA 序列，僅在駑巴貝斯蟲間保守的位置，設(shè)計(jì)引物探針（圖2）。同時(shí)合成一對(duì)可用于擴(kuò)增馬泰勒蟲的完整EMA1 基因引物，引物探針名稱、序列及靶基因見表1。

表1 引物、探針的名稱、序列及靶基因

圖1 馬泰勒蟲引物探針設(shè)計(jì)區(qū)域的序列比對(duì)

圖2 駑巴貝斯蟲引物探針設(shè)計(jì)區(qū)域的序列比對(duì)

1.2.2 反應(yīng)條件優(yōu)化 通過AB7500 設(shè)備，對(duì)各組分濃度進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)最優(yōu)反應(yīng)參數(shù)進(jìn)行篩選。

1.2.3 靈敏度試驗(yàn) 將經(jīng)測(cè)定計(jì)算的已知拷貝數(shù)的質(zhì)粒DNA pGEM-T-EMA1 和pSKII-18SrRNA 作10 倍系列稀釋，應(yīng)用優(yōu)化的反應(yīng)體系進(jìn)行檢測(cè)，確定建立方法的分析靈敏度。

1.2.4 檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線建立 對(duì)質(zhì)量濃度分別為8.7×10-4～8.7×103ng/mL 和1.0×10-3～1.0×103ng/mL的pGEM-T-EMA1 和pSKII-18SrRNA 的質(zhì)粒DNA進(jìn)行檢測(cè)，以Ct 平均值為縱軸，質(zhì)粒質(zhì)量濃度為橫軸，進(jìn)行線性回歸分析并作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸系數(shù)（R2）和PCR 擴(kuò)增效率。

1.2.5 特異性試驗(yàn) 應(yīng)用建立的反應(yīng)體系，對(duì)西尼羅病毒NY-99、馬動(dòng)脈炎病毒CVL Bucyrus、馬流感病毒A/Equine/Xibei/1/2007（H3N8）、東部馬腦脊髓炎病毒ssp. North American variant、西部馬腦脊髓炎病毒McMillan 等病原的cDNA 以及馬皰疹病毒1 型、馬鏈球菌獸疫亞種（C55100）的核酸進(jìn)行檢測(cè)，以驗(yàn)證方法的特異性。

1.2.6 樣品檢測(cè) 應(yīng)用建立的方法，對(duì)20 份進(jìn)口馬血清及10 份馬全血，進(jìn)行實(shí)際應(yīng)用檢測(cè)。

1.2.7 馬泰勒蟲陽(yáng)性樣品EMA1 全基因擴(kuò)增 使用表1 中的引物，對(duì)TeEMA1-S/TeEMA1-R，進(jìn)一步對(duì)熒光PCR 檢測(cè)為陽(yáng)性的2 份馬泰勒蟲樣品進(jìn)行擴(kuò)增，采用50 μL 體系，每個(gè)反應(yīng)體系均包含1×PCR Buffer、3.0 mmol/L MgCl2、200 nmol/L dNTP、0.8 μmol/L TeEMA1-S/TeEMA1-R 引物以及2.5 U Taq DNA 聚合酶、5 μL 模板DNA。反應(yīng)參數(shù)為：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃1 min，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃最后延伸10 min。擴(kuò)增后取PCR 產(chǎn)物5 μL，用2%瓊脂糖凝膠電泳。

1.2.8 目的片段克隆、測(cè)序和序列分析 將PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收目的片段，按照說明書克隆入pGEM-T 載體，轉(zhuǎn)化Top10 感受態(tài)細(xì)胞，對(duì)每個(gè)陽(yáng)性質(zhì)粒各挑取2 個(gè)克隆進(jìn)行序列測(cè)定。對(duì)EMA1 基因序列和推導(dǎo)氨基酸序列進(jìn)行變異分析。將測(cè)定獲得的2 個(gè)EMA1 基因序列與NCBI 獲取的全部23 個(gè)馬泰勒蟲完整EMA1 基因序列進(jìn)行比對(duì)，使用Lasergene 7.0 繪制進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 熒光定量PCR 反應(yīng)條件優(yōu)化

經(jīng)優(yōu)化確立的反應(yīng)體系為：每個(gè)反應(yīng)體系均包 含1×Ex TaqPCR Buffer、200 nmol/L dNTP、0.4 μmol/L 引物、0.2 μmol/L 檢測(cè)探針。反應(yīng)參數(shù)為：95 ℃ 3 min；94 ℃ 10 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40 個(gè)循環(huán)。每個(gè)循環(huán)72 ℃時(shí)收集熒光信號(hào)。

2.2 靈敏度試驗(yàn)

該建立的雙重反應(yīng)體系可以檢出22 拷貝的馬泰勒蟲質(zhì)粒DNA（圖3-A）和31 拷貝的駑巴貝斯蟲質(zhì)粒DNA（圖3-B），表明方法的靈敏度可以滿足要求。

圖3 靈敏度試驗(yàn)結(jié)果

2.3 回歸與熒光PCR 效率計(jì)算

對(duì)已知濃度的質(zhì)粒DNA 進(jìn)行檢測(cè)，將檢測(cè)結(jié)果經(jīng)計(jì)算后進(jìn)行線性回歸，獲得的相關(guān)數(shù)據(jù)及方程圖形見圖4，發(fā)現(xiàn)PCR 反應(yīng)效率分別為92.125%和98.088%，表明建立的方法擴(kuò)增效率較高。

2.4 特異性試驗(yàn)

應(yīng)用建立的檢測(cè)反應(yīng)體系，對(duì)西尼羅病毒NY-99、馬動(dòng)脈炎病毒CVL Bucyrus、馬流感病毒A/Equine/Xibei/1/2007（H3N8）、東部馬腦脊髓炎病毒ssp. North American variant、西部馬腦脊髓炎病毒McMillan 等病原的cDNA 以及馬皰疹病毒1 型、馬鏈球菌獸疫亞種（C55100）的核酸進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示建立的檢測(cè)方法與上述病原核酸無交叉反應(yīng)。

圖4 回歸分析及獲得的方程圖形

2.5 送檢樣品檢測(cè)

應(yīng)用建立的方法，對(duì)2018 年進(jìn)口的20 份馬血清及10 份馬全血進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果檢出2 份馬全血為馬泰勒蟲陽(yáng)性（編號(hào)8 和9）；進(jìn)一步使用毛細(xì)管電泳，對(duì)PCR 產(chǎn)物進(jìn)行分析，觀察到了預(yù)期大小的目的片段（圖5）。

2.6 陽(yáng)性樣品的完整EMA1 基因擴(kuò)增與克隆

采用TeEMA1-S 和TeEMA1-R，經(jīng)PCR 成功擴(kuò)增了8 號(hào)和9 號(hào)全長(zhǎng) EMA1 基因（圖6）；將其克隆入pGEM-T，質(zhì)粒經(jīng)菌落PCR 鑒定后，證明2 個(gè)樣品的EMA1 基因成功克隆入質(zhì)粒載體，分別命名為pGEM-T-EMA1-8 和pGEM-T-EMA1-9。

圖5 送檢樣品的熒光PCR 檢測(cè)結(jié)果

圖6 2 個(gè)樣品EMA1 基因PCR 擴(kuò)增結(jié)果

2.7 序列測(cè)定與變異分析

測(cè)序結(jié)果經(jīng)blast 分析顯示，目的片段均為馬泰勒蟲EMA1 基因，與預(yù)期一致，長(zhǎng)度均為819 nt，編碼273 個(gè)氨基酸，二者序列相似性為98.9%。對(duì)其推導(dǎo)氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)存在6 處氨基酸突變，顯示兩個(gè)樣品中的EMA1 基因并不完全一致（圖7）。

2.8 進(jìn)化分析和親緣性分析

使用Lasergene 7.0 MegAlign，將測(cè)得的2 個(gè)EMA1 序列與NCBI 獲取的全部23 個(gè)馬泰勒蟲完整EMA1 基因序列進(jìn)行了比對(duì)，并繪制了進(jìn)化樹（圖8）。結(jié)果顯示，2 個(gè)序列處于不同分支，提示基因可能來自不同的馬泰勒蟲蟲株。

圖7 EMA1 推導(dǎo)氨基酸序列比對(duì)結(jié)果

圖8 EMA1 序列的進(jìn)化分析結(jié)果

3 討論

本研究針對(duì)馬泰勒蟲EMA1 基因和駑貝貝斯蟲18S rRNA 靶基因，采用MGB 雙標(biāo)記探針，建立了一套可快速檢測(cè)2 種馬梨形蟲病病原的雙重?zé)晒釶CR 方法，并初步評(píng)價(jià)和驗(yàn)證了方法的有效性。研究顯示，該方法靈敏、特異，與其他馬病病原核酸無交叉反應(yīng)。應(yīng)用建立的方法，從2 份馬泰勒蟲抗體陽(yáng)性全血中檢出蟲體核酸；進(jìn)一步對(duì)2 份陽(yáng)性樣品的馬泰勒蟲EMA1 全基因進(jìn)行擴(kuò)增、克隆和序列分析，發(fā)現(xiàn)2 個(gè)序列存在差異，表明其可能來自不同的馬泰勒蟲蟲株。

有研究顯示，馬泰勒蟲流行地區(qū)的cELISA 確認(rèn)陽(yáng)性病例往往蟲體核酸檢測(cè)也呈陽(yáng)性，而且抗體陰性馬匹也可能呈蟲體核酸陽(yáng)性，表明核酸檢測(cè)方法對(duì)馬泰勒蟲具有較高的診斷敏感性，而且核酸檢測(cè)可能比cELISA 方法具有更高的敏感性[7]。本研究對(duì)2 份馬泰勒蟲cELISA 抗體陽(yáng)性動(dòng)物的全血檢測(cè)為蟲體核酸陽(yáng)性，與相關(guān)報(bào)道一致，顯示馬血中馬泰勒蟲抗體和蟲體可同時(shí)存在。研究還表明，目前馬泰勒蟲核酸檢測(cè)的靶基因主要為18S rRNA 和EMA1 基因，二者檢測(cè)結(jié)果基本一致。而馬泰勒蟲EMA1 特定序列在蟲體內(nèi)為單拷貝，因此本研究選擇了該基因進(jìn)行引物探針設(shè)計(jì)。由于建立方法的靈敏度和PCR 反應(yīng)效率較高，因此針對(duì)該基因的熒光定量PCR 方法可用于蟲體的定量分析。

對(duì)于駑巴貝斯蟲，許多研究表明，cELISA 和核酸分子檢測(cè)方法的一致性較差。巴西的一項(xiàng)調(diào)查顯示，抗體陽(yáng)性馬匹中，18S rRNA 定量PCR 檢測(cè)的陽(yáng)性率僅為13.5%[7]。核酸陽(yáng)性率與抗體陽(yáng)性率差異較大也見于水牛的牛巴貝斯蟲（B. bovis）和雙芽巴貝斯（B. bigemina）感染[8]。目前對(duì)造成這種檢測(cè)差異的原因還沒有徹底弄清。一些研究顯示，駑巴貝斯蟲感染與馬泰勒蟲不同，宿主可能會(huì)自行清除駑巴貝斯蟲蟲體，但持續(xù)性的抗體檢出可能是其他蟲體感染引起的非特異性反應(yīng)。本研究對(duì)2 份駑巴貝斯蟲抗體陽(yáng)性馬的核酸檢測(cè)結(jié)果為陰性，原因不明。

由于馬梨形蟲病病原感染的靶細(xì)胞為紅細(xì)胞，因此血清中一般不能檢出病原核酸，因此只能采集抗凝血進(jìn)行檢測(cè)。但由于一些單位采用肝素抗凝管采集全血，而肝素對(duì)PCR 的抑制作用較強(qiáng)，而且一般的核酸提取方法并不能去除肝素，因此檢測(cè)結(jié)果往往為陰性。本研究同樣發(fā)現(xiàn)血清的核酸檢測(cè)結(jié)果均為陰性，而且發(fā)現(xiàn)肝素對(duì)PCR 的抑制作用較強(qiáng)，但通過洗滌血細(xì)胞和聚乙二醇沉淀法處理提取DNA，可顯著消除肝素對(duì)PCR 的抑制作用。