抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療后人類免疫缺陷病毒感染者CD8+記憶性T 細(xì)胞活化與耗竭水平的研究

邱文浩 熊潤松 劉 顯 伍月榕 肖 健

1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣西南寧 530022；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)公共衛(wèi)生與管理學(xué)院，廣西南寧 530022；3.廣西中醫(yī)藥大學(xué)科技處，廣西南寧 530022；4.廣西中醫(yī)藥大學(xué)科學(xué)試驗(yàn)中心，廣西南寧 530022

人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）是艾滋病（acquired immune deficiency syndrome，AIDS）的病原體[1]，CD4+T 細(xì)胞計數(shù)是評價HIV 感染者免疫功能大致水平的重要指標(biāo)，對于評價抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療（after anti-retroviral therapy，ART）的效果也有重要意義[2]。CD8+T 細(xì)胞是抗病毒的主要免疫效應(yīng)細(xì)胞，在控制HIV 復(fù)制方面發(fā)揮重要作用[3]。免疫應(yīng)答的后期，存活下來的CD8+T 細(xì)胞成為CD8+記憶性T 細(xì)胞（memory T cells，Tm）細(xì)胞，參與再次免疫應(yīng)答[4]。由于病毒持續(xù)感染，HIV 感染者CD8+T 細(xì)胞表面常表現(xiàn)出更高水平的免疫活化分子CD38 和HLA-DR的表達(dá)，同時抑制性受體（如2B4）表達(dá)也會升高[5]。

本研究通過檢測CD8+Tm 細(xì)胞活化分子CD38、HLA-DR 和免疫耗竭分子2B4 的表達(dá)水平，探討其對免疫功能的影響，為臨床指導(dǎo)用藥及新藥研發(fā)提供新思路和理論依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 研究對象

2022 年1 月至2 月于廣西貴港市疾病防控中心收集了HIV 感染者62 例。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合《中國疾病預(yù)防控制中心中國艾滋病診療指南（2021 年版）》[6]的診斷標(biāo)準(zhǔn)；排除標(biāo)準(zhǔn)：多種病毒（如乙肝病毒、丙肝病毒）合并感染或其他特殊疾病。根據(jù)《艾滋病免疫功能重建不良中西醫(yī)協(xié)同治療專家共識（2020 版）》[7]，將HIV感染者分為免疫重建完全組40 例（ART 治療＞4 年，CD4+T 細(xì)胞計數(shù)≥500 個/μl）[8]，男22 例，女18 例；平均年齡（41.5±13.0）歲。免疫重建不全組22 例（ART 治療＞4 年，CD4+T 細(xì)胞計數(shù)＜500 個/μl），其中男12例，女10 例；平均年齡（42.5±14.0）。另外設(shè)置12 名健康捐獻(xiàn)者為健康組，男6 名，女6 名；平均年齡（40.3±10.0）歲。本研究經(jīng)醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)（GXIRB2022-0025），所有研究對象對本研究知情且同意。

1.2 主要儀器與試劑

Attune 流式細(xì)胞儀（賽默飛世爾公司）；抗體CD3（貨號：555674）、CD8（貨號：563256）、CD45RO（貨號：560743）、CCR7（貨號：353216）、CD62L（貨號：304842）、2B4（貨號：329536）、CD38（貨號：551400）、HLA-DR（貨號：561137）購自BD 公司。

1.3 研究方法

取免疫重建不全組、免疫重建完全組與健康組靜脈血，與等體積RPMI-1640 混勻，通過淋巴細(xì)胞分離液得到外周血單個核細(xì)胞；2%FPS 重懸細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞懸液濃度至2×107個/ml；取50 μl 細(xì)胞懸液加入EP 管中，加入抗體4℃避光孵育20 min；加入500 μl PBS 混勻后離心棄掉上清液；加入多聚甲醛固定后，流式細(xì)胞儀檢測[9]。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

通過GraphPad Prism 8.4 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)；計數(shù)資料采用百分率表示，比較采用χ2檢驗(yàn)。Pearson 分析相關(guān)性。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組CD8+Tm 細(xì)胞上CD38 表達(dá)量比較

免疫重建不全組和免疫重建完全組CD8+Tm 細(xì)胞CD38 的表達(dá)量均高于健康組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。免疫重建不全組和免疫重建完全組CD8+Tm 細(xì)胞CD38 的表達(dá)量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05）。見圖1、表1。

圖1 各組CD8+Tm 細(xì)胞CD38 的表達(dá)

表1 各組CD8+Tm 細(xì)胞CD38 表達(dá)量比較（%，）

表1 各組CD8+Tm 細(xì)胞CD38 表達(dá)量比較（%，）

注 與健康組比較，aP ＜0.05。Tm 細(xì)胞：記憶性T 細(xì)胞

2.2 各組CD8+Tm 細(xì)胞上HLA-DR 表達(dá)量比較

免疫重建不全組和免疫重建完全組CD8+Tm 細(xì)胞上HLA-DR 的表達(dá)量均高于健康組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。免疫重建不全組和免疫重建完全組CD8+Tm 細(xì)胞上HLA-DR 的表達(dá)量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05）。見圖2、表2。

圖2 CD8+Tm 細(xì)胞上HLA-DR 的表達(dá)

表2 各組CD8+Tm 細(xì)胞上HLA-DR 表達(dá)量比較（%，）

表2 各組CD8+Tm 細(xì)胞上HLA-DR 表達(dá)量比較（%，）

注 與健康組比較，aP ＜0.05。Tm 細(xì)胞：記憶性T 細(xì)胞

2.3 各組CD8+Tm 細(xì)胞上2B4 表達(dá)量比較

免疫重建不全組和免疫重建完全組CD8+Tm 細(xì)胞上2B4 的表達(dá)量均高于健康組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。免疫重建不全組和免疫重建完全組CD8+Tm 細(xì)胞上2B4 的表達(dá)量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05）。見圖3、表3。

圖3 各組CD8+Tm 細(xì)胞上2B4 表達(dá)量比較

表3 各組CD8+Tm 細(xì)胞上2B4 表達(dá)量比較（%，）

表3 各組CD8+Tm 細(xì)胞上2B4 表達(dá)量比較（%，）

注 與健康組比較，aP ＜0.05。Tm 細(xì)胞：記憶性T 細(xì)胞

2.4 各組CD8+Tm 細(xì)胞上CD38、HLA-DR 的共表達(dá)

免疫重建不全組和免疫重建完全組CD8+Tm 細(xì)胞上CD38、HLA-DR 的共表達(dá)量均高于健康組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。免疫重建不全組和免疫重建完全組CD8+Tm 細(xì)胞上CD38、HLA-DR 的共表達(dá)量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05）。見圖4、表4。

圖4 各組CD8+Tm 細(xì)胞上CD38、HLA-DR 的共表達(dá)

表4 CD8+Tm 細(xì)胞上CD38、HLA-DR 的共表達(dá)量比較（%，）

表4 CD8+Tm 細(xì)胞上CD38、HLA-DR 的共表達(dá)量比較（%，）

注 與健康組比較，aP ＜0.05。Tm 細(xì)胞：記憶性T 細(xì)胞

2.5 各組CD38+HLA-DR+CD8+Tm 細(xì)胞上2B4 的表達(dá)

免疫重建不全組和免疫重建完全組CD38+HLADR+CD8+Tm 細(xì)胞上2B4 的表達(dá)量均高于健康組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。免疫重建不全組和免疫重建完全組CD8+CD38+HLA-DR+Tm 細(xì)胞上2B4 的表達(dá)量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05）。見圖5、表5。

圖5 CD38+HLA-DR+CD8+Tm 細(xì)胞上2B4 的表達(dá)

表5 CD38+HLA-DR+CD8+Tm 細(xì)胞上2B4 表達(dá)量（%，）

表5 CD38+HLA-DR+CD8+Tm 細(xì)胞上2B4 表達(dá)量（%，）

注 與健康組比較，aP ＜0.05。Tm 細(xì)胞：記憶性T 細(xì)胞

2.6 ART 后HIV 感染者CD8+Tm 細(xì)胞上各分子表達(dá)的相關(guān)性

ART 后HIV 感染者CD8+Tm 細(xì)胞上CD38 與HLADR 的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.634 6，P ＜0.05），CD38、HLA-DR 與2B4 間無相關(guān)性（r=0.0814、0.1996，P ＞0.05）。

3 討論

CD8+Tm 細(xì)胞是再次免疫應(yīng)答中的主力軍，在面對HIV 攻擊時，存活時間更長、反應(yīng)更強(qiáng)更快[10-11]。因此，深入對CD8+Tm 細(xì)胞的免疫功能水平的研究，對于治療HIV 的慢性感染有著深遠(yuǎn)意義。

慢性、未經(jīng)治療的HIV 感染的特點(diǎn)是病理性免疫激活和炎癥狀態(tài)[12]，盡管ART 有效預(yù)防HIV 感染患者的死亡，但免疫重建仍存在問題[13]。CD38 分子可傳遞活化信號，誘導(dǎo)T 細(xì)胞的活化和增殖[14]，而HLADR 是一種晚期激活標(biāo)志物[15]。HIV 感染進(jìn)程中，CD8+T 細(xì)胞的活化提示T 細(xì)胞的高頻率更新和免疫耗竭[16-18]，并與感染易感性增加有關(guān)，由CD38 和HLA-DR 共同表達(dá)確定的CD8+T 細(xì)胞活化水平，與AIDS 發(fā)病和死亡的風(fēng)險具有相關(guān)性[19-21]。相比之下，低感染表型的特點(diǎn)是T 細(xì)胞上HLA-DR 和CD38 的低表達(dá)[22]。當(dāng)通過ART 將血漿病毒血癥抑制到幾乎檢測不到的水平時，免疫激活會減弱，但不會達(dá)到健康人群的水平[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，ART 后HIV 感染者免疫重建不全組和免疫重建完全組CD8+Tm 細(xì)胞上CD38、HLA-DR 的表達(dá)水平較健康組均升高，免疫重建不全組和免疫重建完全組CD8+Tm 細(xì)胞上CD38、HLA-DR的共表達(dá)水平較健康組均升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。同時本研究的相關(guān)性分析結(jié)果中，ART后HIV 感染者CD8+Tm 細(xì)胞CD38 與HLA 的表達(dá)呈正相關(guān)。這提示盡管接受ART 治療，HIV 感染者免疫功能得到一定程度的重建，但是CD8+Tm 細(xì)胞活化水平依然處于異常升高的狀態(tài)中，這可能是由于病毒的持續(xù)感染導(dǎo)致的。另外，本研究發(fā)現(xiàn)ART 后HIV 感染者免疫重建不全組和免疫重建完全組CD8+Tm 細(xì)胞上CD38、HLA-DR 的表達(dá)量差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05），這提示在HIV 的持續(xù)感染下，CD8+Tm 細(xì)胞活化水平升高已得到證實(shí)，但其與CD4+T 計數(shù)的關(guān)聯(lián)，尚待進(jìn)一步探究。

持續(xù)的免疫活化會導(dǎo)致免疫抑制受體的高表達(dá)，最終導(dǎo)致T 細(xì)胞功能耗竭[24]。免疫耗竭分子2B4 在高表達(dá)時，會抑制T 細(xì)胞免疫功能，在AIDS 后期，2B4上調(diào)會通過抑制CD8+T 細(xì)胞的效應(yīng)而導(dǎo)致疾病進(jìn)一步進(jìn)展[25]。本研究發(fā)現(xiàn)，ART 后HIV 感染者免疫功能重建不全組和完全組CD8+Tm 細(xì)胞上2B4 的表達(dá)水平較健康組升高；在CD38+HLA-DR+CD8+Tm 細(xì)胞即活化的CD8+Tm 細(xì)胞上，2B4 的表達(dá)水平同樣呈現(xiàn)升高的情況。這提示盡管HIV 感染者接受了ART 治療，CD8+Tm 細(xì)胞免疫耗竭水平依然升高，高表達(dá)的2B4在一定程度上持續(xù)抑制CD8+Tm 細(xì)胞的免疫功能；而活化的CD8+Tm 細(xì)胞上2B4 表達(dá)升高，這提示病毒的持續(xù)感染在導(dǎo)致細(xì)胞免疫活化升高后，免疫抑制相應(yīng)升高，最終將導(dǎo)致細(xì)胞免疫功能的耗竭。

總之，本研究通過檢測ART 后HIV 感染者CD8+Tm細(xì)胞上免疫分子的表達(dá)水平，得出以下結(jié)論：盡管ART 治療使免疫功能得到一定程度的重建，但是隨著HIV 的持續(xù)感染，病毒無法被徹底清除，因此CD8+Tm細(xì)胞一直保持過度活化的狀態(tài)，引起免疫抑制升高，最終導(dǎo)致CD8+Tm 細(xì)胞的免疫耗竭。