錯(cuò)配修復(fù)基因在乙型肝炎病毒相關(guān)肝細(xì)胞癌中表達(dá)的影響因素

高玉雪 寧琪琪 蔡玉瑩 關(guān)媛月 楊鵬翔 陳德喜

首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院北京肝病研究所，北京 100069

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，是原發(fā)性肝癌的一大類，惡性程度高，浸潤(rùn)性強(qiáng)[1-3]。乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染是引發(fā)HCC 最常見(jiàn)和最主要的原因[4-6]。手術(shù)切除是目前治療HCC 患者的最佳治療手段。嗜肝病毒科的特征之一是病毒DNA 整合到宿主染色體，整合的HBV DNA 誘導(dǎo)染色體不穩(wěn)定性，基因不穩(wěn)定性是HCC 發(fā)生的重要原因之一[6-7]。目前錯(cuò)配修復(fù)基因（mismatch repair gene，MMR）的研究主要集中在結(jié)直腸癌領(lǐng)域[8-10]，對(duì)其在HCC 中的表達(dá)情況研究較少。本研究旨在探討MMR 在HBV 相關(guān)HCC 中的表達(dá)情況及其影響因素。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019 年12 月至2021 年6 月首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院（以下簡(jiǎn)稱“我院”）收治的125 例HBV相關(guān)HCC 患者，根據(jù)病理標(biāo)本行免疫組化檢查MMR表達(dá)，其中男108 例，女17 例；年齡29～80 歲，平均（53.58±10.24）歲。按照MutL 蛋白同系物1（MutL homologue 1，MLH1）、MutS 蛋白同系物2（MutS homologue 2，MSH2）、MutS 蛋白同系物6（MutS homologue 6，MSH6）和減數(shù)分裂后分離蛋白2（postmeiotic segregation increased 2，PMS2）基因表達(dá)缺失情況，分為MMR 缺失（deficiencyMMR，dMMR）組18 例，MMR 正常（proficiency MMR，pMMR）組（107 例）。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范（2019 年版）》[11]中HCC 的診斷標(biāo)準(zhǔn)；②HBV 感染；③手術(shù)切除原發(fā)病灶；④MLH1、MSH2、MSH6 和PMS2 免疫組化結(jié)果完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他惡性腫瘤或既往惡性腫瘤史；②合并其他病毒感染。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批（京佑科倫字[2021]080 號(hào)）。

1.2 研究方法

收集患者的臨床病理資料，包括性別、年齡、谷草轉(zhuǎn)氨酶（glutamic-oxaloacetic transaminase，GOT）、異常凝血酶原、甲胎蛋白、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（glutamic-pyruvic transaminase，GPT）、總膽紅素、直接膽紅素、白蛋白和球蛋白、腫瘤分化程度、Edmondson 分級(jí)、壞死情況、衛(wèi)星結(jié)節(jié)、微血管侵犯、增殖細(xì)胞核抗原指數(shù)（Ki-67 labeling index，Ki-67）、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（glypican-3，GPC-3）、肝細(xì)胞石蠟抗原1（hepatocyte paraffin-1，HepPar-1）、P53 蛋白、谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase，GS）、精氨酸酶-1（arginase-1，Arg-1）、乙型肝炎表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）、乙型肝炎核心抗原（hepatitis B core antigen，HBcAg）表達(dá)情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0 或GraphPad Prism 9.0.0 軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。正態(tài)分布的計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，比較采用t 檢驗(yàn)；偏態(tài)分布的計(jì)量資料采用中位數(shù)（四分位數(shù)）[M（P25，P75）]表示，比較采用Mann-Whitney U 檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料采用例數(shù)或百分率表示，比較采用χ2檢驗(yàn)。等級(jí)資料比較采用秩和檢驗(yàn)。采用logistic 回歸模型分析影響因素。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 dMMR 組基因缺失情況

dMMR 組缺失情況包括MLH1/PMS2 表達(dá)缺失者4 例，MLH1 表達(dá)缺失者1 例，MSH2/PMS2 表達(dá)缺失者1 例，PMS2 表達(dá)缺失者12 例。

2.2 兩組病理特征比較

dMMR 組壞死率、微血管侵犯率低于pMMR 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。兩組分化程度、Edmondson 分級(jí)、P53 蛋白強(qiáng)度比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 兩組病理特征比較（例）

2.3 兩組臨床指標(biāo)比較

dMMR 組GOT、異常凝血酶原水平低于pMMR 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 兩組臨床指標(biāo)比較[M（P25，P75）]

2.4 HBV 相關(guān)HCC 患者發(fā)生dMMR 的影響因素分析

以MMR 表達(dá)情況為因變量（dMMR=1，pMMR=0），以壞死情況（有=1，無(wú)=0）、微血管侵犯情況（有=1，無(wú)=0）、分化程度（中及中低分化、低分化=1，高及高中分化=0）、Edmondson 分級(jí)（Ⅲ級(jí)、＞Ⅲ級(jí)=1，≤Ⅱ級(jí)、Ⅱ～Ⅲ級(jí)=0）、P53（陽(yáng)性=1，陰性=0）、GOT、異常凝血酶原為自變量進(jìn)行多因素分析，結(jié)果顯示，Edmondson分級(jí)、GOT 水平是dMMR 發(fā)生的獨(dú)立影響因素（P ＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 HBV 相關(guān)HCC 患者發(fā)生dMMR 的影響因素分析

3 討論

HCC 是消化系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤，可由基因遺傳因素和環(huán)境因素共同作用引起，基因組不穩(wěn)定性是其發(fā)生發(fā)展的原因之一[3,12]。DNA 錯(cuò)配修復(fù)可識(shí)別并修復(fù)DNA 合成過(guò)程中產(chǎn)生的堿基錯(cuò)配，維持基因組穩(wěn)定，保證遺傳信息準(zhǔn)確性，MMR 功能缺陷可引起微衛(wèi)星不穩(wěn)定性[13-15]。MMR 主要包括MLH1、MSH2、MSH6和PMS2，以MLH1 和MSH2 主導(dǎo)的蛋白質(zhì)二聚體，分別與PMS2 蛋白質(zhì)和MSH6 蛋白質(zhì)形成異源二聚體[16-17]。

HCC 患者中存在MLH1、MSH2、PMS2 和p16 的啟動(dòng)子甲基化，且其啟動(dòng)子沉默在晚期HCC 中更容易被檢測(cè)到[18]。在丙型肝炎病毒相關(guān)HCC 中，MSH2 或MLH1 低表達(dá)與腫瘤低分化關(guān)系密切，與其他臨床病理指標(biāo)無(wú)關(guān)[19]。HCC 中DNA 損傷修復(fù)體細(xì)胞突變者具有更高的腫瘤突變負(fù)荷，也具有更高的基因突變，如MLH1、MSH2、細(xì)胞周期檢驗(yàn)點(diǎn)激酶2 等[20]。最近研究顯示，MSH2（rs2303428）與HBV 感染和家族史相互作用，增加HCC 發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，多因素分析顯示rs2303428、腫瘤數(shù)量、腫瘤分期、轉(zhuǎn)移對(duì)HCC 患者預(yù)后有顯著影響[21]。

本研究發(fā)現(xiàn)，HBV 相關(guān)HCC 中dMMR 發(fā)生率為14.4%（18/125），提示MMR 缺失在HCC 中可能是低頻事件。與Wang 等[22]研究結(jié)果一致，在36 例HCC患者中免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示均檢測(cè)到hMLH1 和hMSH2 表達(dá)，提示不存在hMLH1 和hMSH2 失活突變或hMLH1 啟動(dòng)子高甲基化。但張翠娟等[23]研究發(fā)現(xiàn)，在HCC 患者中hMLH1 和hMSH2 基因啟動(dòng)子CpG 島的甲基化較為常見(jiàn)，其中hMSH2 基因啟動(dòng)子甲基化是誘導(dǎo)HCC發(fā)生發(fā)展的早期事件。MMR 表達(dá)的減少在丙型肝炎病毒相關(guān)HCC 中起著重要的作用，hPMS2 可能參與HCC 發(fā)生的早期階段，其表達(dá)降低可能為HCC提供生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)[24]。不同于dMMR 的結(jié)腸癌獨(dú)特的病理學(xué)特征[25]，本研究顯示，HBV 相關(guān)HCC 患者dMMR 也有獨(dú)特的病理學(xué)特征，微血管侵犯發(fā)生率較低，Edmondson分級(jí)較低，組織學(xué)分化較好，壞死較少，低p53 表達(dá)，低GOT 和異常凝血酶原，其dMMR發(fā)生情況與Edmondson 分級(jí)較低、GOT 水平有關(guān)。本研究存在一些局限，如入選患者人數(shù)有限，需要加大樣本研究；缺乏長(zhǎng)期隨訪結(jié)果，不能明確MMR 蛋白表達(dá)缺失與治療及預(yù)后的關(guān)系。綜上所述，dMMR 在HBV 相關(guān)HCC 中是一種低頻事件，但是其可能是一種有效的靶標(biāo)，具體調(diào)控機(jī)制及與HBV 相關(guān)HCC 發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，尚需進(jìn)一步研究探討。