血必凈注射液對(duì)體外循環(huán)后急性肺損傷大鼠肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞凋亡相關(guān)微RNA 表達(dá)的影響

徐朝軍 張勝康 張 怡 周代勇 宋 嵐

1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院心胸外科，湖南長(zhǎng)沙 410007；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，湖南長(zhǎng)沙 410208

隨著體外循環(huán)方法和外科技術(shù)的提高，體外循環(huán)心臟手術(shù)的安全性大大提高，然而肺部并發(fā)癥是心臟術(shù)后重要的死亡原因，而大多數(shù)肺部并發(fā)癥與體外循環(huán)術(shù)后急性肺損傷有關(guān)[1-2]，微RNA（miRNA）是一類內(nèi)源性的非編碼RNA 分子，它們?cè)谵D(zhuǎn)錄后水平沉默特定基因，對(duì)生物體基因表達(dá)發(fā)揮精細(xì)調(diào)節(jié)的作用。研究發(fā)現(xiàn)microRNA 可能在體外循環(huán)急性肺損傷中也發(fā)揮重要作用[3-4]。

血必凈注射液臨床廣泛用于膿毒癥及急性肺損傷[5-6]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，血必凈可以有效改善體外循環(huán)術(shù)后患者的肺功能，但是其具體機(jī)制目前尚未明確[7-9]。近年來研究表明，中藥及其活性成分對(duì)miRNA 能起到廣泛調(diào)節(jié)作用[10-11]，本研究運(yùn)用生物信息學(xué)技術(shù)獲取與肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞凋亡相關(guān)性的候選miRNAs，再建立SD 大鼠體外循環(huán)肺損傷模型，通過real-time PCR 的方法觀察血必凈對(duì)體外循環(huán)急性肺損傷肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞中候選miRNA 表達(dá)的影響，從分子水平探討血必凈注射液治療體外循環(huán)急性肺損的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 30 只清潔級(jí)雄性SD 大鼠購于湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物中心，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（湘）2013-0005（動(dòng)物合格證號(hào)：43004700020981），20～22 周齡，體重450～500 g。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均獲得湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)許可并按照國際實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南進(jìn)行（ZYFY20171017）。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥品 血必凈注射液（天津紅日藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：Z20040033）；戊巴比妥鈉（sigma 公司）。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 DMEM 培養(yǎng)基、Trizol、cDNA 第一鏈合成試劑盒（貨號(hào)：11752250，Invitrogen 公司）；無支原體小牛血清（杭州四季青生物工程公司）；10%水合氯（青島育龍化學(xué)試劑有限公司）；彈性蛋白酶（Becton-Dickinson 公司）；胰脫氧核糖核酸酶（Sigma 公司）；鼠IgG（Becton-Dickinson 公司）；TaqManTMmicroRNA 分析試劑盒（貨號(hào)：4366596，Biosystems 公司）；PCR 引物由上海英駿公司合成；miRcute miRNA 提取分離試劑盒（貨號(hào)：CW0627，北京康為世紀(jì)生物科技有限公司）；miRNA 熒光定量檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)：CW2142，北京康為世紀(jì)生物科技有限公司）。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)儀器 熒光定量PCR 儀（LC-480Ⅱ型，美國Perkin-Elmer 公司）；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（賀利氏HERAcell 150 i，賽默飛世爾公司）；超凈工作臺(tái)（CJ-1B 北京半導(dǎo)體設(shè)備廠）；倒置相差顯微鏡（CKX31，日本Olympus 公司）；-80℃低溫冰箱（Forma 995，美國FORMA 公司）；可見紫外分光光度計(jì)（UV-2600i，日本島津公司）。

1.1.5 相關(guān)數(shù)據(jù)庫的使用及靶基因預(yù)測(cè)工具 大鼠miRNA 數(shù)據(jù)庫：miRBase（http：//www.mirbase.org/cgi-bin/querv.pl?terms=rat）；mRNAMap（http：//mimamap.mbc.nctu.edu.tw/html/search.html）；miRDB（http：// www.mirdb.org/cgi-bin/search.egi）。

miRNA 靶基因預(yù)測(cè)軟件：MirTarget（http：//llmirdb.org/miRDB/policy.htral）；TargetScan（http：//www.targetscan.org/vert 50/）；Blast（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）；DAVID（http：//david.abcc.ncifcrf.gov/）。

1.2 研究方法

1.2.1 篩選大鼠miRNAs 利用miRBase 數(shù)據(jù)庫、mRNAMap 數(shù)據(jù)庫及miRDB 數(shù)據(jù)庫，以“rat”為關(guān)鍵詞搜索，獲得的各數(shù)據(jù)庫的大鼠miRNAs，然后整合去掉重復(fù)miRNAs 信息。

通過MirTarget 和TargetScan 軟件，篩選出與大鼠肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞凋亡相關(guān)的靶基因及其對(duì)應(yīng)的miRNA。

獲得候選miRNAs，采用DAVID 軟件，分析上述靶基因預(yù)測(cè)工具獲得的miRNAs 靶基因的功能，以“肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞”“凋亡”“肺臟”為關(guān)鍵詞篩選，從其中找出與大鼠肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞凋亡相關(guān)的靶基因（score＞95），并得到對(duì)應(yīng)的miRNAs。

1.2.2 動(dòng)物分組及體外循環(huán)所致急性肺損傷大鼠模型制備 按隨機(jī)數(shù)字表法將30 只大鼠分為三組：假手術(shù)組、體外循環(huán)組、血必凈組，每組10 只。假手術(shù)組于血管穿刺前2 h、體外循環(huán)組于體外循環(huán)前2 h 經(jīng)腹腔注射4 ml/kg 的生理鹽水。血必凈組在麻醉后體外循環(huán)前2 h 經(jīng)腹腔注射血必凈注射液4 ml/kg。實(shí)驗(yàn)前大鼠自由飲水但禁食6 h。采用腹腔內(nèi)注射麻醉（2%戊巴比妥按50 mg/kg），根據(jù)術(shù)中情況予靜脈追加戊巴比妥以維持麻醉。采用頸部氣管切開后行氣管內(nèi)插管并縫合固定，予以小動(dòng)物呼吸機(jī)行機(jī)械通氣。在將溫度探頭置入大鼠直腸內(nèi)監(jiān)測(cè)溫度并采用變溫毯調(diào)節(jié)體溫，經(jīng)股動(dòng)脈置管監(jiān)測(cè)有創(chuàng)血壓，肢體導(dǎo)聯(lián)連接心電監(jiān)護(hù)儀進(jìn)行監(jiān)測(cè)。假手術(shù)組不建立體外循環(huán)，體外循環(huán)組和血必凈組參照文獻(xiàn)[10]方法建立大鼠體外循環(huán)模型并進(jìn)行體外循環(huán)管理，用20G 套管穿刺尾動(dòng)脈并與小動(dòng)物膜肺的動(dòng)脈血出口連接，采用多孔16G 套管針穿刺右側(cè)頸外靜脈并置管于右心房處，引流靜脈血入儲(chǔ)血槽，采用動(dòng)物特制膜肺進(jìn)行氧合，由轉(zhuǎn)流泵驅(qū)動(dòng)體外循環(huán)。轉(zhuǎn)流開始時(shí)灌注量約40 ml/（kg·min），循環(huán)流量逐步增加至100 ml/（kg·min），保持該流量并維持此轉(zhuǎn)速1 h 后逐步降低流量直到停止體外循環(huán)，術(shù)中密切監(jiān)測(cè)心率、血壓、體溫等指標(biāo)，體外循環(huán)結(jié)束后先拔除靜脈插管，以低流量灌注將機(jī)器管路里的血液經(jīng)尾動(dòng)脈回輸動(dòng)物體內(nèi)，在血壓穩(wěn)定后拔除插管，繼續(xù)監(jiān)測(cè)有創(chuàng)血壓2 h，嚴(yán)密觀測(cè)大鼠生命體征，麻醉蘇醒，放入鼠籠，繼續(xù)禁食不禁飲。假手術(shù)組僅行動(dòng)、靜脈穿刺置管不行體外循環(huán)，其他處理同體外循環(huán)組。

1.2.3 大鼠肺濕/干重比（wet to dry weight ratio，W/D）和大鼠肺泡損傷數(shù)定量評(píng)價(jià)指標(biāo)（index of quantitative assessment，IQA）的測(cè)定 體外循環(huán)結(jié)束后4 h 放血處死大鼠，取左肺下葉，生理鹽水反復(fù)清洗，濾紙去除多余水分并立即稱重，即為濕重（wet，W）；然后將這些樣品真空干燥直到重量恒定再予以稱重，即為干重（dry，D），計(jì)算W/D。取左上肺組織，經(jīng)4%多聚甲醛固定，石蠟包埋切片，采用蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin staining，HE）染色。測(cè)定肺泡IQA。

1.2.4 SD 大鼠肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞分離及培養(yǎng)SD 大鼠制備體外循環(huán)肺損傷模型后進(jìn)行肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞分離。SD 大鼠進(jìn)行腹腔注射麻醉，胸主動(dòng)脈放血法處死大鼠。經(jīng)肺動(dòng)脈和支氣管反復(fù)灌注PBS（8 次，10 ml/次），以減少肺組織中的中性粒細(xì)胞。剪取適量肺組織置于37℃水中水浴20 min，再經(jīng)支氣管導(dǎo)管向氣管內(nèi)緩慢注入含172 U 彈性蛋白酶的40 ml PBS。仔細(xì)修剪與肺組織相連的其他組織和心臟組織，將1 000 U DNAse I 加入肺組織中，再用顯微剪將肺組織反復(fù)剪碎，加入5 ml 低IgG 的胎牛血清滅活DNAseI。在室溫條件下輕柔地?cái)嚢?0 min，先后采用孔徑為500、200、105 μm 的聚酯篩網(wǎng)過濾，然后重懸于30 ml DMEM中，予以450 g 離心10 min，緊接著再將細(xì)胞重懸于45 ml DMEM 中。然后將收集細(xì)胞接種至事先包被鼠IgG（30 μg/ml）的100 mm 培養(yǎng)皿中37℃培養(yǎng)1 h，以去除剩余的中性粒細(xì)胞。采用DMEM多次洗滌培養(yǎng)皿并收集肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞。再次離心后將肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞重懸于10～20 ml DMEM（含10%小牛血清，1%慶大霉素，1%青霉素，1%非必需氨基酸，1%L-谷氨酸）中。先行細(xì)胞計(jì)數(shù)，并測(cè)定細(xì)胞活力（臺(tái)盼藍(lán)染色）。選取檢測(cè)活性＞95%的細(xì)胞接種至8 孔培養(yǎng)板中（1×106/ml，0.5 ml/孔）。置于5%CO2培養(yǎng)箱中37℃條件下培養(yǎng)48 h，收集貼壁細(xì)胞并得到肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞，再將細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)于含10%小牛血清，2%慶大霉素，2%青霉素，2%非必需氨基酸，2%L-谷氨酸的DMEM 中，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.5 RFPCR 檢測(cè)microRNA 表達(dá) 用miRNA 提取試劑盒提取細(xì)胞樣本中miRNA。使用TaqMan microRNA reverse transcription 試劑盒逆轉(zhuǎn)錄micorRNA生成cDNA，逆轉(zhuǎn)錄體系和條件參考說明書[反應(yīng)體系：Poly（A）反應(yīng)液4 μl，dNTP（10 mmol/L）1 μl，25 μmol/L RT 引物3 μl，5×RT 緩沖液4 μl，逆轉(zhuǎn)錄酶0.5 μl，無RNA 酶水7.5 μl]。qRT-PCR 反應(yīng)體系參照試劑盒說明書進(jìn)行[反應(yīng)體系：2×miRNA qRT-PCR 預(yù)混液10 μl，上游引物（10 μmol/L）0.4 μl，下游引物（10 μmol/L）0.4 μl，模板2 μl，加入滅菌蒸餾水至20 μl]。rno-miR-17-5p 正向引物序列5’-TGTCGTGGAGTCGCC-3’，反向引物序列5’-CAAAGUGCUUACAGUGC-3’；rno-miR-34a-5p 正向引物序列5’-TGTCGTGGAGTCGCC-3’，反向引物序列5’-UGGC AGUGUCUUAGCU-3’；rno-miR-26a-5p 正向引物序列5’-TGTCGTGGAGTCGCC-3’，反向引物序列5’-UUCAAGUAAUCCAGGA-3’；rno-miR-21-5p 正向引物序列5’-TGTCGTGGAGTCGCC-3’，反向引物序列5’-UAGCUUAUCAGACUGA-3’；rno-miR-375-3p 正向引物序列5’-TGTCGTGGAGTCGCC-3’，反向引物序列5’-UUUGUUCGUUCGGCUC-3’；采用U6 RNA 作為內(nèi)參，正向引物序列5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，反向引物序列5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。采用2-△△ct法計(jì)算miRNA 的表達(dá)變化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0 對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，比較采用t 檢驗(yàn)。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠miRNA 列表信息

通過數(shù)據(jù)庫搜索、整合得到495 個(gè)大鼠miRNA。利用MirTarget 等靶基因在線預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)到大鼠438 個(gè)miRNA 的靶標(biāo)基因1 932 個(gè)（Score＞99.0）。未預(yù)測(cè)到的其他57 個(gè)miRNAs，一部分miRNA 沒有搜索到靶基因，還有一部分miRNA 與438 條miRNA 中部分miRNA 具有高度相似結(jié)構(gòu)。對(duì)miRNA 分子進(jìn)行功能注釋及分析，獲取與肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞、細(xì)胞凋亡以及在肺臟表達(dá)相關(guān)的miRNA。然后通過DAVID工具對(duì)miRNA 靶基因分析，并將功能分析結(jié)合文獻(xiàn)調(diào)研等方法，確定rno-miR-17-5p、rno-miR-34a-5p、rno-miR-26a-5p、rno-miR-21a-5p 和rno-miR-375-3p 這五條miRNA 與肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞凋亡相關(guān)。

2.2 三組大鼠肺組織W/D、IQAI 比較

體外循環(huán)組W/D 和IQA 高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。血必凈組W/D、IQA 低于體外循環(huán)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。見表1。

表1 三組大鼠肺組織W/D、IQA 比較（）

表1 三組大鼠肺組織W/D、IQA 比較（）

注 與假手術(shù)組比較，aP ＜0.05；與體外循環(huán)組比較，bP ＜0.05。W/D：濕/干重比；IQA：肺泡損傷數(shù)定量評(píng)價(jià)指標(biāo)

2.3 血必凈對(duì)體外循環(huán)大鼠肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞miRNA表達(dá)的影響

體外循環(huán)組大鼠肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞rno-miR-17-5p 表達(dá)較假手術(shù)組下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）；而血必凈組rno-miR-17-5p 高于體外循環(huán)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。而體外循環(huán)組rno-miR-34a-5p 表達(dá)高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）；但是rno-miR-34a-5p 在體外循環(huán)組及血必凈組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。其余候選miRNAs的表達(dá)在假手術(shù)組、體外循環(huán)組及血必凈組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。見圖1。

圖1 血必凈對(duì)體外循環(huán)肺損傷大鼠肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞microRNA 表達(dá)的影響

3 討論

體外循環(huán)是心臟直視手術(shù)的必要手段。盡管有先進(jìn)的器官保護(hù)技術(shù)和術(shù)后嚴(yán)密監(jiān)測(cè)，但體外循環(huán)術(shù)后的器官功能不全仍時(shí)有發(fā)生，而體外循環(huán)術(shù)后急性肺損傷是體外循環(huán)術(shù)后最常見的并發(fā)癥之一[1]。

大量研究顯示，在體外循環(huán)肺損傷中有復(fù)雜的細(xì)胞凋亡發(fā)生，其中由各種凋亡相關(guān)基因異常表達(dá)所致的肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞凋亡在體外循環(huán)肺損傷發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著重要作用，減輕肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞凋亡過度激活，可能是防治體外循環(huán)肺損傷的重要策略之一[12-13]。本研究采用生物信息學(xué)篩選了可能與肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞凋亡相關(guān)的miRNA。通過整合幾種常用數(shù)據(jù)庫中包含的大鼠miRNA 信息，然后進(jìn)一步采用靶基因預(yù)測(cè)軟件獲得了候選miRNA 靶基因序列并分析候選基因的功能，篩選得到與肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞凋亡相關(guān)的miRNAs 5 條：rno-miR-17-5p、rno-miR-34a-5p、rno-miR-26a-5p、rno-miR-21a-5p 和rno-miR-375-3p。

現(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí)，血必凈注射液可通過多種機(jī)制對(duì)急性肺損傷起保護(hù)作用[14-17]。本研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，體外循環(huán)組大鼠肺組織W/D 及QIA 升高，提示大鼠體外循環(huán)所致急性肺損傷模型制備成功。而血必凈組W/D 及QIA 較體外循環(huán)組降低，表明經(jīng)血必凈注射液處理可以減輕體外循環(huán)誘導(dǎo)的急性肺損傷，血必凈注射液可能是體外循環(huán)誘導(dǎo)的急性肺損傷的潛在治療藥物。

體外循環(huán)急性肺損傷歸屬于中醫(yī)“暴喘”“喘脫”的范疇。研究已表明，體外循環(huán)肺損傷的基本病機(jī)為外邪犯肺、病位在肺腎，病機(jī)關(guān)鍵在于“熱、瘀、水（濕）、虛”4 個(gè)方面[18-20]。而血必凈注射液源于血府逐瘀湯，具有活血化瘀、清熱解毒等功效。其功效與體外循環(huán)急性肺損傷的發(fā)生及中醫(yī)防治機(jī)制的認(rèn)識(shí)相吻合。然而血必凈治療體外循環(huán)急性肺損的機(jī)制尚不明確，還需要深入探索和研究。文獻(xiàn)報(bào)道，血必凈的有效成分可以調(diào)節(jié)不同細(xì)胞miRNA 表達(dá)[21]。因此本研究進(jìn)一步檢測(cè)血必凈對(duì)體外循環(huán)肺損傷大鼠肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞凋亡相關(guān)候選miRNA 表達(dá)的影響。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：體外循環(huán)組肺損傷大鼠肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞miR-17-5p 表達(dá)較假手術(shù)組下降，而miR-34a-5p 表達(dá)上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）；血必凈組miR-17-5p 較體外循環(huán)則組顯著上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）；但是miR-34a-5p 在體外循環(huán)組及血必凈組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。研究顯示，miR-17-5p 在胚胎肺上皮祖細(xì)胞中高表達(dá)，而且可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期調(diào)節(jié)基因Rbl2 表達(dá)調(diào)節(jié)肺上皮細(xì)胞分化和增殖[22]。研究還顯示，miR-17-5p對(duì)肺血管內(nèi)皮細(xì)胞及多種腫瘤細(xì)胞凋亡有調(diào)節(jié)作用[23-25]，本研究也顯示，體外循環(huán)肺損傷大鼠肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞miR-17-5p 表達(dá)顯著下降，而血必凈組肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞miR-17-5p 表達(dá)較體外循環(huán)組顯著上升。本研究推測(cè)血必凈可以通過上調(diào)肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞miR-17-5p 表達(dá)抑制肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞凋亡，這可能是血必凈治療體外循環(huán)后急性肺損傷的機(jī)制之一。

但是血必凈通過調(diào)控肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞miR-17-5p 表達(dá)抑制細(xì)胞凋亡發(fā)揮治療體外循環(huán)急性肺損作用的靶點(diǎn)及機(jī)制尚需在后續(xù)工作中深入探索和研究。