骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)K562 細(xì)胞衰老的作用及Raf/ MEK/ ERK 信號(hào)通路的影響

周 雯 周 玥 唐紫云 何思悅 劉小虎 畢子瑩 李敏瑞 楊 楠

大理大學(xué)組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，云南大理 671000

慢性髓系白血病是一種未成熟髓細(xì)胞在體內(nèi)大量擴(kuò)增的增生性疾病。酪氨酸激酶抑制劑作為一線治療，提高了患者的生存率[1-3]，但耐藥、不良反應(yīng)及高成本，使其應(yīng)用受到限制[4-6]。骨髓微環(huán)境是造血干細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育的主要場(chǎng)所，與白血病的發(fā)生有著密切的聯(lián)系[7-10]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）作為微環(huán)境中的基質(zhì)細(xì)胞對(duì)白血病的進(jìn)展起到了一定的調(diào)控作用[11-12]。K562 細(xì)胞與間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）進(jìn)行直接或間接共培養(yǎng)后，其增殖均受到抑制，但間接培養(yǎng)中的抗增殖作用較弱，表明細(xì)胞間直接接觸的重要性[13]。誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞衰老是腫瘤治療的新策略[14-17]，可以為患者提供等效或更長(zhǎng)的生存期。但目前報(bào)道的BMSCs通過誘導(dǎo)K562 細(xì)胞衰老而抑制白血病進(jìn)展的研究少見，本研究主要探究BMSCs 能否誘導(dǎo)K562 衰老及其可能的機(jī)制，為白血病的治療提供理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

6～8 周SPF 級(jí)C57BL/6J 雄性小鼠30 只，體重20～30 g，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，合格證號(hào)為430727210100922464，許可證號(hào)為SCXK（湘）2019-0004，本實(shí)驗(yàn)由大理大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（2020-028）。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境溫度為22～25℃，濕度45%～55%，提供充足的水和飼料，飼養(yǎng)1 周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 主要試劑及器材

DMEM/F12 培養(yǎng)基（Gibco 公司，8120254）；成脂、成骨分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基（Cyagen 公司，MUBMX-90031、MUBMX-90021）；SA-β-Gal 衰老染色試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司，C0602）；流式細(xì)胞儀（Beckman，美國(guó)Cyto-FLEX）。CD29、CD44、CD45（Bioscience 公司，美國(guó)SC3746、SC7297、SC1178）；CDKN2A/p16INK4a、β-actin、HRP 標(biāo)記山羊抗兔IgG（abcam，英國(guó)，EPR1473、ab210083、ab97051）；GAPDH、兔抗人多克隆抗體p-Raf、p-MEK、p-ERK（Santacruze，美國(guó)，sc-47724、sc-135707、sc-101733、sc-101760）。K562 細(xì)胞購(gòu)自齊氏生物科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 BMSCs 的培養(yǎng)和鑒定 取小鼠雙下肢骨髓細(xì)胞，使用DMED/F12 完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)入6 cm 塑料培養(yǎng)皿中，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取第3 代BMSCs 的細(xì)胞懸液，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)BMSCs表面抗原CD29、CD244、CD45 的表達(dá)。使用成脂、成骨分化誘導(dǎo)液誘導(dǎo)后，采用油紅O、茜素紅染色鑒定BMSCs 的分化能力。

1.3.2 CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況 取第3 代BMSCs，將0、0.25×105、0.5×105、1×105、2×105個(gè)BMSCs 分別鋪入3 個(gè)24 孔板，每個(gè)濃度設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，貼壁后每孔加入1×105個(gè)K562 細(xì)胞懸液500 μl，即BMSCs 與K562細(xì)胞的比例為1∶4、1∶2、1∶1、2∶1，未添加BMSCs 的K562 細(xì)胞作為對(duì)照。于24、48、72 h 收集細(xì)胞鋪入96 孔板中，每孔100 μl，檢測(cè)450 nm 處吸光度值并計(jì)算K562 細(xì)胞增殖率。選擇K562 細(xì)胞增殖率最低時(shí)的共培養(yǎng)時(shí)間及細(xì)胞比例作為BMSCs 組，常規(guī)培養(yǎng)的K562 細(xì)胞作為對(duì)照組進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 SA-β-Gal 染色法檢測(cè)細(xì)胞衰老情況 兩組細(xì)胞進(jìn)行衰老染色，顯微鏡下觀察并計(jì)算400 個(gè)細(xì)胞中的衰老陽性細(xì)胞率。本實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.4 Western blot 檢測(cè)p16INK4a、p-Raf、p-MEK、p-ERK 蛋白的表達(dá)量 收集兩組細(xì)胞提取并測(cè)定總蛋白濃度，電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，加入兔抗鼠CDKN2A/p16INK4a（1∶1 000）、內(nèi)參一抗β-actin（1∶1 000）。p-Raf（1∶5 000）、p-MEK（1∶20 000）、p-ERK（1∶10 000）和內(nèi)參一抗GAPDH（1∶1 000）4℃過夜，TBST 緩沖液漂洗2 次，加入二抗HRP 標(biāo)記山羊抗兔IgG（1∶1 000），室溫反應(yīng)2 h，凝膠成像系統(tǒng)曝光。本實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 26.0 對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，比較采用t 檢驗(yàn)。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BMSCs 表面標(biāo)志物的鑒定

BMSCs 表面標(biāo)志物CD29、CD44、CD45 的陽性表達(dá)率分別為89.18%、87.65%、1.16%。見圖1。

圖1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物

2.2 BMSCs 的成脂、成骨分化

BMSCs 油紅O 染色可見紅色脂滴，茜素紅染色可見橘紅色鈣結(jié)節(jié)。見圖2。

圖2 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成脂、成骨分化染色

2.3 不同比例BMSCs 與K562 細(xì)胞共培養(yǎng)不同時(shí)間的K562 細(xì)胞增殖率比較

BMSCs∶K562 細(xì)胞比例為1∶2、1∶1、2∶1 時(shí)，共培養(yǎng)各時(shí)間點(diǎn)的K562 細(xì)胞增殖率均低于同一時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組，比例為2∶1 時(shí)各時(shí)間點(diǎn)的K562 細(xì)胞增殖率均低于同一時(shí)間點(diǎn)1∶2、1∶1（P ＜0.05）。BMSCs∶K562細(xì)胞比例為2∶1 時(shí)，共培養(yǎng)48 h 后K562 細(xì)胞增殖率均低于共培養(yǎng)24、72 h后（P ＜0.05）。見圖3。

圖3 BMSCs 對(duì)K562 細(xì)胞增殖能力的影響（n=3）

2.4 兩組細(xì)胞衰老情況比較

BMSCs 組衰老細(xì)胞陽性率高于對(duì)照組（P ＜0.01）。見圖4。

圖4 BMSCs 對(duì)K562 細(xì)胞衰老的影響（n=3）

2.5 兩組p16INK4a 蛋白表達(dá)水平比較

BMSCs 組p16INK4a蛋白表達(dá)水平高于對(duì)照組（P ＜0.01）。見圖5。

圖5 兩組p16INK4a 蛋白表達(dá)水平比較（n=3）

2.6 兩組p-Raf、p-MEK、p-ERK 蛋白表達(dá)水平比較

BMSCs 組p-Raf、p-MEK、p-ERK 蛋白表達(dá)水平均低于對(duì)照組（P ＜0.01）。見圖6。

圖6 兩組p-Raf、p-MEK、p-ERK 蛋白表達(dá)水平比較（n=3）

3 討論

BMSCs 是具有自我更新和多向分化能力的非造血祖細(xì)胞，是為成纖維細(xì)胞樣貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞群體。在本研究分離的BMSCs 中，干細(xì)胞表面標(biāo)志物CD29、CD44 陽性表達(dá)，造血干細(xì)胞表面標(biāo)志物CD45 陰性表達(dá)，且其在體外成功分化為脂肪細(xì)胞和骨細(xì)胞，提示分離成功。

既往研究報(bào)道，臍帶MSCs 能抑制白血病細(xì)胞增殖并增強(qiáng)伊馬替尼誘導(dǎo)的K562 細(xì)胞凋亡[18-19]。健康小鼠BMSCs 注入白血病小鼠的骨髓中后，改善了局部骨髓微環(huán)境，改善血小板生成，減少了腫瘤負(fù)荷，并延長(zhǎng)了白血病小鼠的生存期[20]。細(xì)胞增殖能力降低和SA-β-Gal 活性增高是衰老的常見表現(xiàn)。本研究中，BMSCs 與K562 細(xì)胞共培養(yǎng)后，K562 增殖率降低，SA-β-Gal 活性增高，提示BMSCs 能夠誘導(dǎo)K562 細(xì)胞衰老。p16INK4a是一種衰老調(diào)控分子，其高表達(dá)推動(dòng)細(xì)胞進(jìn)入衰老[21]。本研究中，BMSCs 組p16INK4a高于對(duì)照組，提示其能促進(jìn)K562 細(xì)胞衰老。

Raf/MEK/ERK 信號(hào)級(jí)聯(lián)在細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期等過程中發(fā)揮重要作用[22]。此信號(hào)通路在白血病BCRABL 融合基因形成后被異常激活[23-24]，導(dǎo)致K562 細(xì)胞大量增殖，靶向此通路的抑制劑能夠增強(qiáng)白血病化療效果[25]。本研究中，BMSCs 組Raf、MEK、ERK 活化蛋白表達(dá)量降低，提示BMSCs 發(fā)揮的抗衰老作用或許與該通路相關(guān)。目前與BMSCs 誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞衰老的報(bào)道較少，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞衰老或許能減少腫瘤的復(fù)發(fā)，提供更長(zhǎng)的生存期?，F(xiàn)有研究停留在細(xì)胞階段，缺乏相關(guān)的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行佐證，后續(xù)需深入研究BMSCs誘導(dǎo)腫瘤衰老的機(jī)制及影響，為臨床應(yīng)用提供切實(shí)可靠的依據(jù)。