外泌體microRNA對缺血性腦卒中調(diào)控機制的研究進展

蘇梓健，詹晨陽，張 婷，韋佩祺，向軍軍綜述，胡躍強審校

缺血性腦卒中(cerebral ischemia,CI)是全球第二大死亡原因，也是導致殘疾的主要原因。隨著人口老齡化社會的到來，其發(fā)病率明顯上升，給家庭、社會帶來了巨大的精神、物質(zhì)負擔[1]。CI是由動脈粥樣硬化、高血壓病、血脂異常、糖尿病等多種危險因素引起的[2]。缺血性腦卒中一旦發(fā)生可立即導致離子平衡破壞、代謝衰竭和腦細胞中一般蛋白質(zhì)合成減少，繼而誘發(fā)梗死灶周圍去極化、興奮性毒性、氧化應激、炎癥反應和血腦屏障(blood brain barrier,BBB)破壞，可導致神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞、小膠質(zhì)細胞、少突膠質(zhì)細胞和內(nèi)皮細胞等死亡[3]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，外泌體來源的microRNA(miRNA)與CI的發(fā)生發(fā)展具有密切的關(guān)系，腦組織中miRNA的表達、分布和作用，成為早期診斷的分子標志物和有效的治療靶標，且miRNA能自由通過BBB。miRNA可通過參與細胞凋亡、血管新生、氧化應激抑制、神經(jīng)炎癥及BBB調(diào)節(jié)等影響CI的發(fā)生發(fā)展。故本文對外泌體來源miRNA在細胞凋亡、血管新生、氧化應激抑制、神經(jīng)炎癥以及BBB調(diào)節(jié)方面對CI形成的影響進行綜述。

1 外泌體及miRNA的生物學特性

外泌體是一種由晚期內(nèi)體或多泡體(multivesicular bodies,MVBs)與質(zhì)膜融合后釋放到細胞外環(huán)境的小囊泡，系脂質(zhì)雙層球形結(jié)構(gòu)，大小在30～200 nm之間。外泌體內(nèi)容物包括蛋白質(zhì)、脂類物質(zhì)、氨基酸、代謝物、mRNAs和miRNA等，均可反映來源細胞的生物學特點[4]。miRNA是由21～25核苷酸組成的單鏈非編碼小RNA，其主要通過介導靶基因轉(zhuǎn)錄本的降解或抑制其翻譯，即從轉(zhuǎn)錄后水平上抑制相關(guān)基因的表達，從而影響生命進程中包括發(fā)育、分化、增殖和鐵死亡等多種生理病理過程。miRNA廣泛分布于動植物基因組中，其表達具有高度保守性、時序性和組織特異性[5]。作為腦卒中治療的靶點，基于miRNA的策略提供了快速起效。

2 miRNA與細胞凋亡

細胞死亡分為細胞壞死和細胞凋亡，是不可逆的細胞功能的結(jié)束。細胞凋亡與CI的發(fā)生密切相關(guān)，當線粒體功能異常時，可增強促凋亡相關(guān)因子表達，繼而激活線粒體凋亡通路，是引起急性腦梗死后半暗帶區(qū)神經(jīng)元死亡的主要原因[6]。如miR-16系屬于miR-15/miR-16簇，已被較好地證明是凋亡相關(guān)miRNA。miR-16可在嚴重肢體缺血和腦卒中患者血清中升高，CI患者的血清miR-15a和miR-16表達水平與對照組相比，可分別升高8.3倍和42倍[7,8]。根據(jù)結(jié)構(gòu)和功能，B淋巴細胞瘤2(B cell lymphoma,BCL2)家族蛋白在細胞凋亡中的作用可分為抗凋亡蛋白(BCL-2、BCL-xL和MCL-1等)和促凋亡蛋白(BAK、BAX和BIM等)，通過調(diào)節(jié)線粒體介導的細胞凋亡參與腦缺血，其中抑制細胞凋亡的主要蛋白是BCL-2。

Yan等[9]實驗證明，對小鼠采用大腦中動脈阻塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)造模，與對照組相比，通過上調(diào)miR-21的表達可顯著降低p53和Bax的mRNA表達和蛋白水平，增加Bcl-2的mRNA表達和蛋白水平，顯著改善缺血再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)損傷，表現(xiàn)為每張冠狀位腦片梗死面積或總腦梗死體積減少，從而保護大腦免受缺血性損傷。長期的動物實驗及臨床研究中發(fā)現(xiàn)，在數(shù)小時內(nèi)，缺血半影區(qū)中的神經(jīng)元短暫地經(jīng)歷可逆性損傷，并最終發(fā)生細胞凋亡，在很大程度上導致I/R損傷中的細胞死亡。作為BCL-2的上游調(diào)節(jié)因子，磷酸化信號傳導與轉(zhuǎn)錄活化因子-3(phosphorylation signal transduction and transcription activator-3,p-STAT3)的表達與BCL-2的動態(tài)表達一致。在腦缺血再灌注損傷早期，實驗研究發(fā)現(xiàn)miR-124、信號傳導及轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)與p-STAT3的表達水平在12 h內(nèi)達到峰值，miR-124的動態(tài)表達通過抗凋亡蛋白BCL-2和STAT3有效抑制細胞凋亡，表現(xiàn)出可保護神經(jīng)元免受腦缺血而發(fā)生死亡的作用[10]。這些結(jié)果證實了miRNA與細胞凋亡關(guān)系緊密，可減輕腦缺血損傷，保護神經(jīng)元。

3 miRNA與血管新生

血管生成已被證明是導致腦缺血后腦微脈管系統(tǒng)改變的重要事件。局灶性缺血發(fā)作后，在嚙齒動物和非人類靈長類動物模型中，缺血性核心區(qū)域的邊界似乎會刺激血管生成。在這些模型系統(tǒng)中，腦缺血發(fā)生后4～14 d內(nèi)可在局部缺血區(qū)域觀察到新的毛細血管及軸突生長[11]。Zhang等[12]通過小鼠實驗證明，將C肽與外泌體結(jié)合，并負載膽固醇修飾的miR-210(RGD-exo：miR-210)，將RGD-exo：miR-210靜脈靶向注射到腦缺血區(qū)域，隔天給藥一次，連續(xù)給藥14 d，發(fā)現(xiàn)miR-210、整合素β3、血管內(nèi)皮生長因子和CD34的表達顯著上調(diào)，促進腦缺血后腦組織修復的血管生成，小鼠存活率顯著提高。內(nèi)皮細胞是新生腦微血管的主要成分，其功能是血管生成所必需的，包括形態(tài)發(fā)生、遷移、增殖等。Arderiu等[13]的實驗研究發(fā)現(xiàn)，脂肪間充質(zhì)干細胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)促血管生成潛能的調(diào)節(jié)受miR-145的控制。在ADSCs中，內(nèi)皮細胞分泌的堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)與其受體相互作用，誘導蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)，調(diào)節(jié)叉頭盒轉(zhuǎn)錄因子O1(forkhead box O1,FoxO1)轉(zhuǎn)錄活性，降低miR-145的表達。敲低miR-145可促進ADSCs分化為內(nèi)皮細胞，內(nèi)皮細胞標志物表達增加并誘導毛細血管的形成。另一項研究表明，慢病毒敲低原代小鼠或人腦微血管內(nèi)皮細胞培養(yǎng)物中的miR-15a/16-1簇可增強氧糖剝奪后的體外血管生成，上調(diào)促血管生成蛋白表達。該研究還表明血管內(nèi)皮靶向敲除miR-15a/16-1簇通過促進血管重塑和刺激功能性血管的生成，促進卒中后血管新生，增加同側(cè)腦血流[14]。而慢病毒過表達miR-15a/16-1簇可抑制體外血管生成，下調(diào)促血管生成蛋白表達。

4 miRNA與氧化應激抑制

氧化應激是指體內(nèi)活性氧(reactive oxygen species,ROS)的產(chǎn)生與抗氧化防御之間的不平衡，導致ROS蓄積過多而引起機體細胞氧化損傷的過程。氧化應激是腦I/R損傷中最常見、研究最充分的因素，闡明腦I/R損傷氧化應激機制已成為治療缺血性腦卒中的重要問題[15]。

NADPH氧化酶(NADPH oxidase,NOX)是許多細胞類型中ROS的主要來源[16]。Zuo等[17]通過MCAO小鼠造模，測定小鼠腦組織或細胞的基因表達水平、ROS產(chǎn)生和凋亡情況，并進行生物信息學分析，NOX2在I/R模型的腦組織和缺氧/復氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)模型的人神經(jīng)母細胞瘤細胞(Human neuroblastoma cells,SH-SY5Y)中顯著升高，而miR652在腦組織和血漿中的表達顯著降低。過表達miR652顯著抑制H/R作用下SHSY5Y細胞NOX2的表達和ROS的生成，并降低轉(zhuǎn)染報告基因質(zhì)粒的細胞相對熒光素酶活性。錳超氧化物歧化酶(manganese-containing superoxide dismutase,MnSOD)和細胞外超氧化物歧化酶(extracellular superoxide dismutase，EcSOD)具有抗氧化活性，對機體內(nèi)ROS清除的平衡至關(guān)重要，而核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor erythtoid 2 related factor 2,Nrf2)是氧化還原敏感的轉(zhuǎn)錄因子，可激活超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)表達，從而保護細胞抵抗氧化應激損傷。miR-424表達水平升高降低I/R梗死體積，抑制神經(jīng)元凋亡，降低皮質(zhì)ROS和丙二醛水平，增加MnSOD和EcSOD的表達和活化以及氧化還原Nrf2的表達。在神經(jīng)元培養(yǎng)中，miR-424表達水平升高還可消除H2O2誘導的損傷，表現(xiàn)為降低乳酸脫氫酶漏出和丙二醛水平，提高細胞活力和MnSOD活性；通過Nrf2敲除和SOD抑制劑處理逆轉(zhuǎn)miR-424對氧化應激的保護作用，表明miR-424具有通過抑制氧化應激來預防短暫性腦缺血/再灌注損傷的潛力[18]。

5 miRNA與神經(jīng)炎癥

腦I/R損傷誘導的氧自由基的異常往往在激活氧化應激的同時，還破壞線粒體膜上的鈣離子泵并造成谷氨酸誘導的細胞內(nèi)鈣離子的累積，從而導致神經(jīng)細胞炎癥。神經(jīng)炎癥是導致腦I/R損傷發(fā)展的主要病理生理因素。

大量研究表明，許多miRNA與CI后神經(jīng)炎癥反應的調(diào)控有關(guān)。如有學者報道，miR-210在CI患者病灶周圍腦白質(zhì)中的星形膠質(zhì)細胞較對照神經(jīng)組織腦白質(zhì)中的星形膠質(zhì)細胞表達增加1.6倍。miR-210過表達增加促進星形膠質(zhì)細胞糖酵解活性，乳酸生成增強，抗炎分子表達增加，同時抑制促炎介質(zhì)的表達[19]。Zhou等[20]通過蛋白免疫印跡試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-19a/b-3p抑制劑通過增加沉默信息調(diào)節(jié)因子1(sirtuin1,SIRT1)水平及降低調(diào)節(jié)叉頭盒轉(zhuǎn)錄因子O3(forkhead box O3,FoxO3)、鞘氨醇激酶1 (sphingosine kinases 1,SPHK1)和核轉(zhuǎn)錄因子-κβ(nuclear factor kappaB,NF-κβ) p65水平，逆轉(zhuǎn)氧糖剝奪/復氧(oxygen-glucose deprivation/reoxygenation,OGD/R)誘導的蛋白表達變化。同樣，miR-19a/b-3p抑制劑可抑制OGD/R損傷后腫瘤壞死因子α(Tumor Necrosis Factor-α,TNF-α)、白細胞介素(interleukin,IL)-6、IL-1β等炎性因子水平的升高，提示通過靶向miR-19a/b-3p/SIRT1/FoxO3/SPHK1抑制炎癥反應，可能是改善CI預后的一個有前景的途徑。

6 miRNA與BBB調(diào)節(jié)

中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)的血管具有獨特的屏障性質(zhì)。內(nèi)皮細胞是構(gòu)成CNS血管的細胞，通過強的緊密連接、特異性的轉(zhuǎn)運蛋白和有限的內(nèi)吞作用，共同保護大腦免受毒素的侵害，維持大腦的穩(wěn)態(tài)[21]。卒中后血腦屏障的破壞促進炎癥，使白細胞等免疫細胞能夠通過血腦屏障遷移并浸潤CNS實質(zhì)。白細胞促進壞死組織的清除和神經(jīng)元的恢復，但同時也加重BBB損傷，加重CI結(jié)局，尤其是再灌注后期[22,23]。

許多差異表達的miRNA已被報道在CI后BBB調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用[24,25]。Wang等[26]的研究顯示，鋅轉(zhuǎn)運蛋白4(Zinc Transporter 4,ZnT4)是miR-30a負調(diào)控的直接靶點，下調(diào)miR-30a的表達水平，可以降低MCAO小鼠微血管中鋅的蓄積，增加ZnT4的表達，阻止緊密連接蛋白的丟失。即使在MCAO后90 min，也能阻止BBB損傷，減少腦梗死體積，改善神經(jīng)功能缺損。E-選擇素(e-selectin,Es)是在炎癥過程最初階段出現(xiàn)的粘附分子，可引起血管細胞粘附分子1(vascular cellular adhesion molecule-1,VCAM-1)表達增加，參與損傷血管內(nèi)皮細胞，從而加劇腦損傷。觀察組與對照組相比，在MCAO小鼠腦組織中miR-126-3p/-5p過表達使VCAM-1和Es表達分別下調(diào)3.3倍和3.4倍，顯著減少梗死灶，減輕水腫，保護BBB的完整性[27]。還有實驗研究發(fā)現(xiàn)，miR-98過表達可使MCAO小鼠的血腦屏障通透性降低兩倍，3 d后淋巴細胞抗原6復合物高表達(lymphocyte antigen 6 complexhigh,Ly6Chigh)單核細胞減少1.79倍，缺血腦組織內(nèi)活化小膠質(zhì)細胞減少兩倍，結(jié)果提示miR-98過表達可以保護BBB免受促炎Ly6Chigh單核細胞的穿越，從而阻止小膠質(zhì)細胞的進一步激活[28]。

7 前景與展望

CI發(fā)生發(fā)展過程復雜，由于BBB的存在，只有少數(shù)小分子藥物能夠通過血流進入腦實質(zhì)，大分子藥物則無法通過BBB，故研究miRNA對其調(diào)控機制為CI的防治提供新思路和新靶點具有重要意義。miRNA作為一種可同時調(diào)控多種通路及蛋白的非編碼RNA，可通過減輕細胞凋亡、抑制氧化應激及炎癥反應等方面，從而減輕腦缺血損傷的發(fā)生，維持BBB的完整性，促進血管新生，改善神經(jīng)功能。目前，關(guān)于CI的發(fā)病機制及治療的研究較多集中在識別和鑒定與腦卒中相關(guān)的miRNA，明確其作用及機制。動物實驗研究的重點主要集中于應用miRNA相關(guān)抑制劑及模擬物注射小鼠等低級動物。由于患者難以接受側(cè)腦室注射miRNA的給藥途徑，故臨床研究缺乏。隨著我們進一步對CI發(fā)病機制中miRNA表達和功能的認識的提高，以及對動物實驗研究的樣本廣泛性的增加，進行綜合比對分析，后續(xù)必將為探索miRNA治療CI的創(chuàng)新性治療策略提供潛在的指導和幫助，具有十分廣闊的應用前景。