糖皮質(zhì)激素對(duì)阿霉素腎病大鼠齦溝液中IL-6及TNF-α的影響

郭樂(lè)樂(lè) 侯月潔 徐文靖

天津市兒童醫(yī)院 300000

腎病綜合征 (Nephritic syndrome, NS)是一種常見(jiàn)的免疫炎癥性疾病，以大量蛋白尿、低蛋白血癥、水腫和高脂血癥為特征的臨床綜合征，在兒童和成人腎小球類疾病中發(fā)病率分別為70%～90%和21%～31%[1]。臨床治療通常以糖皮質(zhì)激素(GC)為首選藥物[2]，因治療需要應(yīng)用激素量大、時(shí)間長(zhǎng), 易出現(xiàn)較多不良反應(yīng)和并發(fā)癥，如滿月臉、高血壓、糖尿病、骨質(zhì)疏松等[3]。對(duì)口腔的副作用也逐漸受到關(guān)注：吸入治療時(shí)可引發(fā)口腔白色念珠菌感染；正畸過(guò)程中糖皮質(zhì)激素可影響牙齒移動(dòng)的效率或矯治完成后的穩(wěn)定性；通過(guò)影響骨的愈合和重建，引發(fā)骨質(zhì)疏松，從而影響種植體的骨結(jié)合等[4-6]。另外有學(xué)者[7]發(fā)現(xiàn)口服皮質(zhì)激素藥物治療的腎病患者牙周健康情況變差，提示牙周炎與腎病及糖皮質(zhì)激素的應(yīng)用之間可能存在關(guān)聯(lián)。同時(shí)，糖皮質(zhì)激素治療腎臟疾病時(shí)患者體內(nèi)IL-6及TNF-α含量增高，IL-6、TNF-α作為牙周炎時(shí)機(jī)體免疫應(yīng)答產(chǎn)生的細(xì)胞因子，與牙周炎的發(fā)生密切相關(guān)[8]。牙周健康是口腔臨床工作中的修復(fù)、正畸、種植等治療的基礎(chǔ)，本研究在腎病大鼠模型的基礎(chǔ)上進(jìn)行激素治療，以IL-6及TNF-α水平為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，旨在探討牙周炎與腎病及糖皮質(zhì)激素應(yīng)用之間的相關(guān)性，為腎病患者的口腔治療提供實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑與儀器:鹽酸阿霉素(北京艾德萊生物科技有限公司)，注射用甲潑尼龍琥珀酸鈉(海正輝瑞制藥有限公司)，BCA蛋白定量試劑盒(北京雷根生物技術(shù)有限公司)，大鼠IL-6及TNF-α ELISA試劑盒(美國(guó)eBioscience公司)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理:60只SPF級(jí)健康、雄性WISTAR大鼠，體質(zhì)量200～230g，飼養(yǎng)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射研究所動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，收集24h尿檢測(cè)尿蛋白呈陰性后，隨機(jī)分為兩組：正常組、腎病組，每組30只。腎病組采用間隔1周2次尾靜脈注射4mg/kg鹽酸阿霉素，建立大鼠阿霉素腎病模型，正常組尾靜脈注射等量生理鹽水。注射完成4周后將造模大鼠共30只置于代謝籠內(nèi)收集24h尿液，用BCA蛋白定量試劑盒檢測(cè)尿蛋白；隨后將兩組大鼠各隨機(jī)抽取10只處死，摘取腎臟制作病理切片。尿蛋白定量>100mg/24h，結(jié)合大鼠腎臟組織病理表現(xiàn)證明大鼠腎病綜合征模型建立成功。剩余40只大鼠，隨機(jī)將正常組20只分為空白對(duì)照組、糖皮質(zhì)激素組，每組10只；腎病組20只分為阿霉素腎病組、阿霉素腎病+激素灌胃組，每組10只。糖皮質(zhì)激素組及阿霉素腎病+激素灌胃組建模后給予甲潑尼龍30mg/(kg·d)灌胃，連續(xù)10周，1次/d，空白對(duì)照組及阿霉素腎病組給予等體積生理鹽水灌胃。本研究中涉及內(nèi)容均符合國(guó)家倫理原則，經(jīng)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)實(shí)施。

1.2 樣本采集

1.2.1 腎臟組織樣本：阿霉素注射完成4周后，正常組及腎病組各隨機(jī)抽取10只大鼠麻醉，摘取左側(cè)腎臟組織，固定于10%甲醛中，用于制作病理切片。

1.2.2 齦溝液樣本：各組灌胃10周后進(jìn)行齦溝液樣本采集，稱取大鼠體質(zhì)量按3ml/kg注射10%水合氯醛溶液，待大鼠麻醉后取其仰臥位，固定口腔，將大鼠右下頜第一磨牙頰面用無(wú)菌棉球擦拭，隔濕,干燥，將兩根40號(hào)標(biāo)準(zhǔn)化滅菌紙尖分別插入隔濕的大鼠右下頜第一磨牙的(M1)近遠(yuǎn)中位點(diǎn)的牙周袋內(nèi)，直至遇輕微阻力為止，靜置15s后取出,合并置于含有1ml無(wú)菌PBS的EP管中(若紙尖上有血?jiǎng)t棄之重取),-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 牙周組織樣本：齦溝液樣本采集完成后將大鼠處死，切取右側(cè)上頜骨，保留磨牙及周圍牙槽骨，置于10%甲醛溶液中固定，用于組織切片制作。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 24h尿蛋白定量：采用BCA蛋白定量試劑盒檢測(cè)。

1.3.2 組織切片制作：將上頜骨標(biāo)本置于10%甲醛溶液中，4℃固定1周，8%的甲酸溶液脫鈣1周，60%、70%的酒精脫水各1h，80%的酒精脫水過(guò)夜，90%、95%、100%的酒精脫水各1h，65℃環(huán)境下浸蠟2次，各1.5h，石蠟包埋，在切片機(jī)上沿牙體長(zhǎng)軸近遠(yuǎn)中向制作厚度為6μm的組織切片，HE染色。腎臟病理切片制作除去脫鈣其余步驟同牙周切片制作相同。

1.3.3 齦溝液IL-6及TNF-α檢測(cè)：由eBioscience公司提供的試劑盒，采用ELISA雙抗體夾心法分別測(cè)定齦溝液中IL-6及TNF-α。嚴(yán)格按說(shuō)明書操作，室溫下將樣本融化，加入蒸餾水重建大鼠IL-6標(biāo)準(zhǔn)品，每個(gè)反應(yīng)孔各加入標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品100μl，加入50μl生物素共軛物。室溫下孵育2h，洗板。向所有微量孔內(nèi)加入100μl抗生蛋白鏈菌素-HRP，室溫下孵育2h，洗板。向所有微量孔內(nèi)加入100μl TMB底物溶液，室溫下孵育10min。每個(gè)微量孔快速加入100μl終止液，終止酶反應(yīng)，使用分光光度計(jì)以基色波長(zhǎng)450nm檢測(cè)各個(gè)微量孔吸光度。采用TECAN sunrise 酶標(biāo)儀，測(cè)得各檢測(cè)孔吸光度值，按點(diǎn)到點(diǎn)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣本孔吸光度值求得樣本濃度。TNF-α檢測(cè)步驟同IL-6。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況觀察 空白對(duì)照組大鼠體重持續(xù)增長(zhǎng)，皮毛光潔，飲食、尿量無(wú)明顯改變。腎病組大鼠不同程度出現(xiàn)體重增長(zhǎng)較對(duì)照組緩慢或下降情況，皮毛蓬松無(wú)光澤或有臟污，精神不活躍，其中以阿霉素腎病+激素灌胃組最為明顯。

2.2 腎臟組織學(xué)觀察 光鏡觀察：空白對(duì)照組無(wú)異常(圖1a)，腎病組可發(fā)現(xiàn)腎小管內(nèi)有較多蛋白管型，部分的腎小球系膜細(xì)胞呈輕度增生(圖1b)，腎小球可見(jiàn)節(jié)段性硬化，囊壁可見(jiàn)增厚(圖1c)。腎病組的病理表現(xiàn)與人類慢性腎小球腎炎和局灶節(jié)段性腎小球硬化類似，是不同腎病終末期的共同形態(tài)學(xué)表現(xiàn)，證明本實(shí)驗(yàn)所造模型為慢性腎病綜合征模型，符合本實(shí)驗(yàn)要求。

2.3 牙周組織學(xué)觀察 空白對(duì)照組結(jié)合上皮位于釉牙骨質(zhì)界，牙齦牙周膜纖維排列整齊，無(wú)炎癥反應(yīng)，牙槽嵴頂無(wú)吸收(圖2a)；糖皮質(zhì)激素組溝內(nèi)上皮和固有層可見(jiàn)炎細(xì)胞浸潤(rùn)，牙周纖維排列紊亂，毛細(xì)血管數(shù)目增多，擴(kuò)張充血(圖2b)；阿霉素腎病組牙周組織有少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，牙周纖維排列稍有紊亂(圖2c)；阿霉素腎病+激素灌胃組牙周纖維排列紊亂，牙槽嵴頂可見(jiàn)破骨細(xì)胞(圖2d)。

a b c

a b

2.4 大鼠齦溝液IL-6及TNF-α水平 與空白對(duì)照組相比，其他三組大鼠齦溝液中IL-6及TNF-α含量均升高(P<0.05)，其中阿霉素腎病+激素灌胃組的IL-6、TNF-α明顯高于其余三組(P<0.01)，糖皮質(zhì)激素組與阿霉素腎病組的IL-6、TNF-α無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠齦溝液的IL-6及TNF-α含量比較

3 討論

牙周病發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，可從自身免疫反應(yīng)、環(huán)境因素和系統(tǒng)性疾病影響等方面得以解釋。越來(lái)越多的流行病學(xué)調(diào)查研究證明牙周炎與慢性腎病具有相關(guān)性，一項(xiàng)研究中，美國(guó)牙科協(xié)會(huì)列出與口腔健康相關(guān)的系統(tǒng)性疾病，其中便包括腎臟疾病[9]。目前，關(guān)于兩種疾病相互影響的機(jī)制一些學(xué)者提出，牙周致炎因子在患者體內(nèi)的循環(huán)水平提高，增加了系統(tǒng)性炎癥的負(fù)擔(dān)，體內(nèi)IL-6含量增加，與腎小球系膜細(xì)胞表面IL-6受體結(jié)合刺激系膜細(xì)胞增殖，從而使腎小球病理變化加劇，引起腎小球組織結(jié)構(gòu)及功能的異常，可能會(huì)導(dǎo)致腎病患者病情的惡化[10]。而包括TNF-α在內(nèi)的腫瘤壞死因子可引起腎臟固有細(xì)胞增殖，刺激其表達(dá)黏附分子和其他炎癥介質(zhì)導(dǎo)致腎臟系膜細(xì)胞的損傷進(jìn)而促使腎病的惡化。慢性腎病患者針對(duì)包括IL-6和TNF-α在內(nèi)的致炎因子表現(xiàn)出活躍的系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)，體內(nèi)IL-6、TNF-α含量增加，并且經(jīng)過(guò)牙周基礎(chǔ)治療后，炎癥因子的水平明顯下降[11]，表明牙周炎與慢性腎病有一定的相關(guān)性。

IL-6作為炎性因子的一種與牙周炎有密切的關(guān)系：針對(duì)炎癥刺激誘導(dǎo)一系列反應(yīng)，并且控制其他細(xì)胞因子的表達(dá)，如IL-1、IL-10、TNF-α等；通過(guò)影響齦下菌群的組成、增加牙周致病菌定植的敏感性在革蘭陽(yáng)性菌引起的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[12]；促進(jìn)牙槽骨的吸收，誘導(dǎo)破骨細(xì)胞前體轉(zhuǎn)化為成熟的破骨細(xì)胞促進(jìn)骨基質(zhì)的降解。此外，IL-6具有抑制牙槽骨吸收后新骨的形成；Moreira等[13]發(fā)現(xiàn)，IL-6的表達(dá)量與牙周附著喪失有密切關(guān)系。以上均證明IL-6參與牙周炎的發(fā)病機(jī)制。TNF-α是由單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的一種低分子量蛋白質(zhì)，通過(guò)誘導(dǎo)成骨細(xì)胞、牙周初代細(xì)胞、T細(xì)胞和牙周膜細(xì)胞，增強(qiáng)人破骨細(xì)胞活性進(jìn)而促進(jìn)牙槽骨吸收，增加基質(zhì)金屬蛋白酶的產(chǎn)生，導(dǎo)致膠原纖維的破壞，刺激基質(zhì)細(xì)胞的凋亡，限制牙周組織的修復(fù)等。TNF-α的濃度與牙周炎的病程密切相關(guān)，在牙周病發(fā)展過(guò)程中加重炎性反應(yīng)，促進(jìn)牙槽骨破壞[14]。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果中發(fā)現(xiàn)腎病綜合征大鼠齦溝液中的IL-6及TNF-α含量高于空白對(duì)照組大鼠(P<0.05)，與國(guó)外研究報(bào)道相符[15]。表明腎病綜合征可造成牙周致炎因子的升高，可能會(huì)引發(fā)或加重牙周炎，造成牙周病的潛在威脅，并且牙周組織切片中腎病綜合征組有輕微的炎癥表現(xiàn)，共同證明腎病綜合征可造成牙周的炎癥。有研究發(fā)現(xiàn)由腎病引發(fā)的炎癥反應(yīng)可對(duì)牙周組織產(chǎn)生危害，加重牙周疾病的程度，引起牙槽骨、牙齦、牙周膜和牙骨質(zhì)等牙周組織的病理性改變[16]。臨床觀察得知大約90%的慢性腎病患者出現(xiàn)牙周異常的癥狀，較正常人群牙周狀況差，并且經(jīng)過(guò)牙周非手術(shù)治療后，牙周情況普遍好轉(zhuǎn)。我國(guó)傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為齒為腎之標(biāo)，腎氣盛則齒更發(fā)長(zhǎng)，牙齒浮動(dòng)多為腎氣虛衰、牙齒失榮導(dǎo)致，腎臟疾病是牙周炎發(fā)病的主要因素，并且通過(guò)補(bǔ)腎藥物配合牙周基礎(chǔ)治療對(duì)牙周炎的療效顯著[17]，更加驗(yàn)證本實(shí)驗(yàn)結(jié)論。

近年來(lái)，內(nèi)分泌與牙周炎的相關(guān)性受到人們的關(guān)注，從而提示糖皮質(zhì)激素與牙周炎之間有一定的聯(lián)系[18]。本文結(jié)果顯示，糖皮質(zhì)激素組大鼠齦溝液中的IL-6及TNF-α含量高于空白對(duì)照組大鼠(P<0.05)，且與阿霉素腎病組的IL-6、TNF-α含量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，同時(shí)糖皮質(zhì)激素組牙周組織病理切片中表現(xiàn)出輕度炎癥，表明糖皮質(zhì)激素的應(yīng)用可能會(huì)引起牙周炎癥。而李生嬌等[19]通過(guò)制造牙周炎大鼠模型并給予激素皮下注射發(fā)現(xiàn)單純的糖皮質(zhì)激素失調(diào)并不能引起牙周炎的發(fā)生，但卻可以加重牙周炎的嚴(yán)重程度，該學(xué)者觀點(diǎn)與本實(shí)驗(yàn)略有差異，推測(cè)可能是由于激素灌胃時(shí)間短及劑量不同所導(dǎo)致，該差異造成的原因還有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。

本文結(jié)果顯示，阿霉素腎病+激素灌胃組大鼠齦溝液中IL-6及TNF-α的含量高于阿霉素腎病組(P<0.05)，并且阿霉素腎病+激素灌胃組的組織切片中炎癥反應(yīng)較阿霉素腎病組更嚴(yán)重，且出現(xiàn)破骨細(xì)胞。表明在腎病綜合征的基礎(chǔ)上糖皮質(zhì)激素治療可引起大鼠齦溝液中的致炎因子含量的升高，加重牙周組織的炎癥反應(yīng)，與之前的研究結(jié)果較為一致。

綜上所述，阿霉素腎病大鼠本身存在牙周異常，腎病與牙周病之間存在一定的相關(guān)性，在腎病基礎(chǔ)上使用大劑量糖皮質(zhì)激素治療后會(huì)使大鼠牙周異常加重。本實(shí)驗(yàn)結(jié)論為進(jìn)一步研究牙周炎與腎病及糖皮質(zhì)激素應(yīng)用之間的關(guān)系提供了理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，并且對(duì)臨床腎病綜合征患者的激素治療方案和牙周炎的預(yù)防、治療具有一定的指導(dǎo)意義。但本實(shí)驗(yàn)研究樣本小，檢測(cè)指標(biāo)較少，結(jié)論有一定的局限性，仍需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究和臨床驗(yàn)證。