復(fù)方七芍降壓片對(duì)SHR大鼠內(nèi)皮細(xì)胞線粒體自噬和炎癥應(yīng)激的影響*

曹彥花， 雍蘇南， 李蘇**， 樂(lè)金海， 李俊， 王忠良， 劉梅， 劉慧

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 心血管科， 湖南 長(zhǎng)沙 410021； 2.長(zhǎng)沙市中醫(yī)醫(yī)院 骨傷科， 湖南 長(zhǎng)沙 410000； 3.長(zhǎng)沙醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 湖南 長(zhǎng)沙 410219； 4.長(zhǎng)沙醫(yī)學(xué)院 臨床醫(yī)學(xué)院， 湖南 長(zhǎng)沙 410219； 5.長(zhǎng)沙醫(yī)學(xué)院 公共衛(wèi)生學(xué)院， 湖南 長(zhǎng)沙 410219)

高血壓是全球廣泛流行的慢性疾病，全球患病率逐年增加大約10%，可顯著增加心血管病及靶器官損害風(fēng)險(xiǎn)[1]。目前將無(wú)法明確病因的高血壓稱為原發(fā)性高血壓(essential hypertension，SHR)，SHR患者血管內(nèi)皮存在明顯的功能障礙，內(nèi)皮細(xì)胞線粒體自噬障礙可能是啟動(dòng)微血管床病理生理改變的主要內(nèi)因，而衍生出β受體阻滯劑、鈣通道阻滯劑、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑等臨床西醫(yī)降壓藥[2]。長(zhǎng)期使用西醫(yī)降壓藥，部分患者有明顯的頭暈或惡心癥狀，耐藥性也比較常見[2]。復(fù)方七芍降壓片是用于腎陰虛、瘀血阻絡(luò)型高血壓患者的常用藥物，能改善SHR而導(dǎo)致的動(dòng)脈內(nèi)膜粗糙、管壁增厚，緩解炎癥介質(zhì)對(duì)血管內(nèi)皮的損傷，可有效逆轉(zhuǎn)血管異常增生[3]。研究指出，哺乳動(dòng)物體內(nèi)的促炎、抗炎系統(tǒng)持續(xù)處于動(dòng)態(tài)平衡中，其反應(yīng)程度直接決定了血管損傷的修復(fù)效果，復(fù)方七芍降壓片發(fā)揮降壓效果的機(jī)制則可能與其減少炎癥介質(zhì)釋放有關(guān)[4-5]，但其干預(yù)SHR的具體機(jī)制尚無(wú)定論，本研究探討其對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞線粒體自噬、炎癥應(yīng)激損傷的影響，報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物和材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 50只8周齡SPF級(jí)Wistar雄性SHR大鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司[許可證書SCXK(湘)2019-214]，體質(zhì)量210～250 g，分籠飼喂(每籠10只)，飼喂室溫(24.0±2.0)℃，相對(duì)濕度(60.0±5.0)%，晝夜交替(各12 h)，常規(guī)飼養(yǎng)7 d后開始實(shí)驗(yàn)。

1.1.2主要儀器和試劑 AUW2200分析天平(日本島津)、BP98A無(wú)創(chuàng)血壓計(jì)(北京軟隆生物技術(shù)有限公司)、CKX53倒置顯微鏡(日本奧林巴斯)、WH-866旋渦振蕩器(江蘇太倉(cāng)華利達(dá)實(shí)驗(yàn)室設(shè)備公司)、MK3多功能酶標(biāo)儀(中國(guó)賽默飛世爾儀器有限公司)、DHG-9023A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱等，大鼠丙二醛(MDA)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、一氧化氮(NO)、超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)試劑盒購(gòu)自欣博盛公司，蘇木精(國(guó)藥滬試，批號(hào)71020782)、伊紅Y (國(guó)藥滬試，批號(hào)71014544)、組織線粒體分離試劑盒(上海碧云天生物公司)等。

1.1.3主要藥物 復(fù)方七芍降壓片(湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科，批號(hào)20190111)，厄貝沙坦(杭州賽諾菲制藥有限公司，批號(hào)5A159)等。

1.2 研究方法

1.2.1造模及干預(yù) 無(wú)菌條件下結(jié)扎大鼠雙腎動(dòng)脈下極分支，采用高脂高鹽飼料喂養(yǎng)60 d，以制備高血壓模型，造模結(jié)束在大鼠安靜、清醒條件下測(cè)量尾動(dòng)脈血壓，單日隨機(jī)重復(fù)檢測(cè)3次，取成功造模大鼠進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)[4]。采用隨機(jī)數(shù)字表，將大鼠均分為空白組[予10 mg/(kg·d)生理鹽水灌胃]、陽(yáng)性對(duì)照組[予10 mg/(kg·d)厄貝沙坦灌胃]及復(fù)方七芍(低、中、高)劑量組[分別予5、10、20 mg/(kg·d)復(fù)方七芍降壓片灌胃]， 1次/d、連續(xù)30 d。

1.2.2組織處理 干預(yù)30 d時(shí)用乙醚麻醉大鼠，頸椎脫臼法處死，取20 mg腹主動(dòng)脈組織置入EP管，用PBS洗凈殘留血液，冰上剪碎(1 mm×1 mm)，4 ℃ 3 000 r/min轉(zhuǎn)離心12 min，取上清液待檢。

1.2.3觀察指標(biāo) (1)內(nèi)皮細(xì)胞線粒體功能相關(guān)蛋白：采用western blot法檢測(cè)，腹主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞加入組織裂解液、磷酸酶抑制劑、蛋白酶抑制劑，勻漿靜置后再次離心30 min；變性聚丙烯酰氨凝膠電泳后，依次經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)膜、封閉、抗體孵育、二抗孵育等步驟，用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)采集PINK1、Parkin、LC3蛋白印跡信號(hào)[6-7]。(2)氧化損傷和炎癥損傷相關(guān)指標(biāo)用黃嘌呤氧化酶酸法檢測(cè)MDA、SOD、CAT，用ELISA法檢測(cè)IL-1β、TNF-α、NO)[8-9]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 腹主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞PINK1、Parkin、LC3蛋白含量

干預(yù)后，陽(yáng)性對(duì)照組、復(fù)方七芍各劑量組大鼠腹主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞PINK1、Parkin、LC3蛋白高于空白組，復(fù)方七芍各劑量組低于陽(yáng)性對(duì)照組，其中復(fù)方七芍低劑量組>中劑量組>高劑量組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 干預(yù)后各組大鼠腹主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞線粒體功能相關(guān)蛋白含量比較Tab.1 Comparison of mitochondrial function-related protein contents in endothelial cells in SHR abdominal aorta tissues after treatment in each

2.2 腹主動(dòng)脈組織內(nèi)皮細(xì)胞SOD、CAT、IL-1β、TNF-α、NO含量

干預(yù)后，陽(yáng)性對(duì)照組、復(fù)方七芍各劑量組大鼠腹主動(dòng)脈組織內(nèi)皮細(xì)胞MDA、IL-1β、TNF-α、NO含量高于空白組，復(fù)方七芍各劑量組低于陽(yáng)性對(duì)照組，復(fù)方七芍低劑量組>中劑量組>高劑量組(P<0.05)。各組大鼠腹主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞SOD、CAT含量比較，陽(yáng)性對(duì)照組、復(fù)方七芍各劑量組大鼠低于空白組，復(fù)方七芍各劑量組高于陽(yáng)性對(duì)照組，其中復(fù)方七芍低劑量組<中劑量組<高劑量組(P<0.05)。見表2。

2.3 氧化、炎癥指標(biāo)與線粒體功能相關(guān)蛋白含量的相關(guān)性

對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組、劑量組大鼠PINK1、Parkin、LC3蛋白含量與MDA、IL-1β、TNF-α、NO含量呈正相關(guān)，與SOD、CAT含量呈負(fù)相關(guān)。見表3。

表2 各組大鼠腹主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷和炎癥損傷相關(guān)指標(biāo)比較Tab.2 Comparison of related indexes of oxidative injury and inflammatory injury in endothelial cells in SHR abdominal aorta tissues in each

表3 SHR模型大鼠內(nèi)皮細(xì)胞氧化、炎癥指標(biāo)與線粒體功能相關(guān)蛋白含量的相關(guān)性Tab.3 Association of oxidative and inflammatory indexes with mitochondrial function-related proteins in SHR endothelial cells

2.4 氧化、炎癥指標(biāo)含量對(duì)粒體功能相關(guān)蛋白含量的影響

分別以高劑量組線粒體功能相關(guān)蛋白含量為因變量，以內(nèi)皮細(xì)胞氧化、炎癥指標(biāo)含量為自變量，擬合回歸方程顯示，6項(xiàng)自變量(MDA、SOD、CAT、IL-1β、TNF-α、NO含量)對(duì)3項(xiàng)因變量(PINK1蛋白、Parkin蛋白、LC3蛋白)的綜合影響均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

3 討論

“病位在肝，根源在腎”是高血壓核心中醫(yī)病機(jī)，中醫(yī)防治高血壓講究“整體條理，辯證施治”原則。復(fù)方七芍降壓片因能改善SHR而導(dǎo)致的動(dòng)脈內(nèi)膜粗糙、管壁增厚，繼而有效緩解炎癥介質(zhì)對(duì)血管內(nèi)皮的損傷，最終有效逆轉(zhuǎn)血管異常增生現(xiàn)狀[10]?，F(xiàn)有研究指出，哺乳動(dòng)物體內(nèi)的促炎、抗炎系統(tǒng)持續(xù)處于動(dòng)態(tài)平衡中，其反應(yīng)程度直接決定了血管損傷的修復(fù)效果，復(fù)方七芍降壓片發(fā)揮降壓效果的機(jī)制則可能與其減少炎癥介質(zhì)釋放有關(guān)[11-12]。本研究旨在明確復(fù)方七芍降壓片對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、內(nèi)皮細(xì)胞線粒體自噬狀況和炎癥應(yīng)激損傷的具體影響，特對(duì)50只SHR大鼠進(jìn)行了對(duì)照實(shí)驗(yàn)研究。

表4 氧化、炎癥指標(biāo)含量和粒體功能相關(guān)蛋白含量的回歸分析Tab.4 Regression analysis of the contents of oxidation, inflammation indexes, and mitochondrial function-related protein contents

研究數(shù)據(jù)顯示，復(fù)方七芍各劑量組大鼠腹主動(dòng)脈組織內(nèi)皮細(xì)胞PINK1、Parkin、LC3蛋白含量均低于陽(yáng)性對(duì)照組，明降壓藥物干預(yù)SHR大鼠能直接改善內(nèi)皮功能，而厄貝沙坦、復(fù)方七芍降壓片分別干預(yù)后后取得的短期效果亦有不同。結(jié)果還顯示，復(fù)方七芍高劑量組大鼠PINK1、Parkin、LC3蛋白的檢出水平均低于復(fù)方七芍低、中劑量組，說(shuō)明在大鼠機(jī)體耐受的前提下，盡可能提高復(fù)方七芍降壓片使用劑量能保持線粒體穩(wěn)態(tài)，降低功能障礙程度[13]。線粒體作為真核細(xì)胞融合、分裂的平衡細(xì)胞器，其自噬程度直接影響著多種疾病發(fā)生或發(fā)展過(guò)程。具體分析復(fù)方七芍降壓片作用機(jī)制，主要與其組方中不同藥物組合搭配充分激活了血管重塑進(jìn)程有關(guān)[14-15]。三七、白芍為君主要發(fā)揮活血化瘀通絡(luò)功效；桑寄生、丹參、杜仲、天麻共為臣藥，則主要發(fā)揮補(bǔ)益肝腎功效；蘿芙木、葛根、地龍、炒香附共為佐藥，則發(fā)揮平肝清熱和息風(fēng)通絡(luò)的功效[16]，可見復(fù)方七芍降壓片對(duì)SHR患者的調(diào)理作用不限定于心腦血管疾病，也有益于肝腎臟器的功能改善，但本研究尚未對(duì)SHR大鼠肝、腎指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，也有待后續(xù)研究加以完善。

研究還顯示，復(fù)方七芍各劑量組大鼠腹主動(dòng)脈組織內(nèi)皮細(xì)胞MDA、IL-1β、TNF-α、NO含量均低于陽(yáng)性對(duì)照組，同時(shí)復(fù)方七芍各劑量組大鼠腹主動(dòng)脈組織內(nèi)皮細(xì)胞SOD、CAT含量均高于陽(yáng)性對(duì)照組，進(jìn)一步說(shuō)明氧化呼吸鏈中點(diǎn)子漏出情況有所減少，對(duì)應(yīng)釋放至胞漿中的活性氧、凋亡因子可能也有所降低，最終將有助于降低線粒體損傷程度[17]。但是該研究尚未對(duì)腹主動(dòng)脈組織進(jìn)行病理形態(tài)觀測(cè)，不同復(fù)方七芍降壓片使用劑量將對(duì)腹主動(dòng)脈管壁厚度、中膜厚度、管腔內(nèi)徑造成何種長(zhǎng)期影響，后續(xù)研究仍有待進(jìn)一步探究。逐一分析各炎癥或應(yīng)激指標(biāo)在不同劑量組SHR大鼠腹主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)差異，高劑量組大鼠多效細(xì)胞因子IL-1β的低水平表達(dá)，則有益于抑制纖維細(xì)胞增殖或膠原合成，有效緩解病情進(jìn)展[18-19]。而多效能促炎癥因子TNF-α可直接引發(fā)血管內(nèi)皮發(fā)生功能障礙，繼而導(dǎo)致血管平滑肌持續(xù)增生肥大，因此常用于模擬高血壓患者機(jī)體的炎癥微環(huán)境，該指標(biāo)的低水平表達(dá)則能降低炎癥反應(yīng)性疾病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[20]。CAT含量差異則可能與復(fù)方七芍降壓片通過(guò)降低P2Y6表達(dá)，繼而抑制下游信號(hào)傳遞，并最終影響NFκB信號(hào)通路激活狀況有關(guān)[21]。但與SHR關(guān)聯(lián)的核內(nèi)調(diào)控機(jī)制眾多，復(fù)方七芍降壓片抑制信號(hào)通路活動(dòng)來(lái)發(fā)揮炎癥抑制、應(yīng)激抑制效果的具體通路仍需進(jìn)一步探究。MDA、SOD檢出含量在不同劑量復(fù)方七芍降壓片干預(yù)SHR大鼠的體內(nèi)亦有顯著差別，可能與高水平復(fù)方七芍降壓片發(fā)揮抗氧化屏障功效，并直接激活抗氧化系統(tǒng)，恢復(fù)體內(nèi)氧自由基代謝平衡有關(guān)，也可能與其限制線粒體氧化磷酸化過(guò)程，從而恢復(fù)線粒體能量代謝失調(diào)有關(guān)[22]。同時(shí)，MDA和SOD含量改變也會(huì)影響線粒體膜脂質(zhì)的過(guò)氧化進(jìn)程，繼而干擾神經(jīng)毒性介質(zhì)產(chǎn)生過(guò)程，最終影響炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)[23]。

相關(guān)性分析則發(fā)現(xiàn)，線粒體功能相關(guān)蛋白各項(xiàng)指標(biāo)、氧化損傷和炎癥損傷各項(xiàng)指標(biāo)均呈現(xiàn)出顯著關(guān)聯(lián)性，這種關(guān)聯(lián)效應(yīng)不限于單一組別，對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組、復(fù)方七芍各劑量組均有相同關(guān)聯(lián)方向，確診線粒體功能可直接或簡(jiǎn)介參與內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷、炎癥損傷過(guò)程。相關(guān)方向上，PINK1、Parkin、LC3蛋白與MDA、IL-1β、TNF-α、NO呈正相關(guān)，與SOD、CAT則呈負(fù)相關(guān)，該結(jié)果與上述討論分析基本一致。總的來(lái)說(shuō)，復(fù)方七芍降壓片可有效維持細(xì)胞線粒體的自噬情況，保障細(xì)胞呼吸和能量轉(zhuǎn)化正常運(yùn)行，在穩(wěn)定線粒體功能的基礎(chǔ)上降低炎癥、應(yīng)激反應(yīng)，并最終保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞功能[24-25]?；貧w分析也發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮細(xì)胞氧化、炎癥指標(biāo)含量對(duì)高劑量組SHR模型大鼠線粒體功能相關(guān)蛋白含量均有顯著影響，擬合多項(xiàng)回歸方程均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，進(jìn)一步證實(shí)內(nèi)皮細(xì)胞的氧化、炎癥過(guò)程會(huì)綜合影響疾病大鼠線粒體相關(guān)功能。因此，通過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞功能相關(guān)指標(biāo)的含量檢測(cè)可一定程度上預(yù)測(cè)大鼠線粒體功能狀態(tài)，但其實(shí)踐效果仍需進(jìn)一步擴(kuò)大研究范圍，加以驗(yàn)證。

綜上所述，復(fù)方七芍降壓片對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用是通過(guò)多環(huán)節(jié)、多途徑、多靶點(diǎn)加以實(shí)現(xiàn)的，總的來(lái)說(shuō)，安全范圍內(nèi)加大復(fù)方七芍降壓片使用劑量，將有助于維持SHR大鼠炎癥、應(yīng)激反應(yīng)穩(wěn)態(tài)。