基于RNA-Seq技術(shù)的真菌病毒AfPV1感染對(duì)寄主黃曲霉基因表達(dá)的影響*

江銀輝， 楊碧， 劉翔， 田詢， 禹文峰， 齊曉嵐， 吳昌學(xué)

(貴州醫(yī)科大學(xué) 地方病與少數(shù)民族疾病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 & 貴州省醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽 550004)

真菌病毒是寄生在各種絲狀真菌和酵母中的病毒[1]。自從第1個(gè)真菌病毒在雙孢菇中發(fā)現(xiàn)以來，研究者在不同種類的真菌中都發(fā)現(xiàn)了真菌病毒[1-2]。目前已知真菌病毒的基因組大多數(shù)為雙鏈RNA(double stranded RNA，dsRNA)，也有單鏈RNA(single-stranded RNA，ssRNA)，少數(shù)為單鏈DNA(single-stranded DNA，ssDNA)[3]。通常情況下，真菌病毒不會(huì)影響宿主真菌的表型，但也有些病毒會(huì)對(duì)宿主表型產(chǎn)生了較大的影響[3-4]。在釀酒酵母中，研究人員發(fā)現(xiàn)感染輔助病毒L-A和殺手病毒的菌株可以分泌1種毒素，該毒素可以抑制其他未感染的酵母菌株[5]。感染真菌病毒Talaromycesmarneffeipartitivirus 1(TmPV1)的馬爾尼非青霉菌(Talaromycesmarneffei,T.marneffei)增強(qiáng)了對(duì)小鼠的致病力[6]；而真菌病毒誘導(dǎo)煙曲霉(Aspergillusfumigatus,A.fumigatus)減弱了對(duì)小鼠的致病力[7]。RNA測(cè)序(RNA-sequencing，RNA-seq)已被廣泛用于揭示生命現(xiàn)象的分子機(jī)理，也被用于研究病毒感染對(duì)宿主影響的分子機(jī)理[3, 8]。對(duì)真菌病毒而言，比較轉(zhuǎn)錄組分析能夠顯示病毒感染和病毒脫毒菌株之間的基因表達(dá)差異，比如感染A.fumigatus的病毒Apergillus chrysovirus 41362(AfuCV41362)、感染葡萄座腔菌(Botryosphaeriadothidea,B.dothidea)的病毒B.dothideachrysovirus 1和病毒B.dothideapartitivirus 1、感染板栗疫病菌的病毒Cryphonectriahypovirus1(CHV1)、感染小麥赤霉病菌(Fusariumgraminearum,F.graminearum)的病毒F.graminearumhypovirus及病毒F.graminearumvirus 1等[9]。這些研究表明，真菌病毒的感染可以影響宿主真菌的許多重要生物學(xué)過程，包括代謝、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、物質(zhì)運(yùn)輸、毒力因子表達(dá)和核糖體功能[10]。黃曲霉(Aspergillusflavus,A.flavus)是一種條件致病菌，在免疫功能缺陷的人群中引發(fā)曲霉感染[11]；此外，A.flavus還會(huì)產(chǎn)生具有強(qiáng)烈致癌的次級(jí)代謝產(chǎn)物A.flavus素[12]。近年來，發(fā)現(xiàn)A.flavus容易對(duì)現(xiàn)有抗菌藥物產(chǎn)生耐藥性[13]。因此，迫切需要新的治療策略控制A.flavus的感染。隨著越來越多的真菌病毒被發(fā)現(xiàn)能夠選擇性感染致病真菌，真菌病毒作為生物治療，已顯示出的巨大潛力[14]。本課題組前期研究分離得到一株能夠引起A.flavus表型嚴(yán)重衰退、孢子產(chǎn)量減少和生長(zhǎng)速度減慢的真菌病毒A.flavuspartitivirus1(AfPV1)[15]。真菌病毒AfPV1為雙分病毒科家族成員，病毒顆粒直徑約為40 nm，AfPV1基因組為3條dsRNA片段(dsRNA 1長(zhǎng)度為1.7 kbp，dsRNA 2長(zhǎng)度為1.4 kbp，dsRNA 3長(zhǎng)度為1.1 kbp)[15]。為了闡明AfPV1感染引起寄主A.flavus表型改變的分子機(jī)理，本研究利用RNA-Seq技術(shù)分析真菌病毒AfPV1對(duì)寄主A.flavus基因表達(dá)的影響，并從轉(zhuǎn)錄組分析AfPV1與寄主A.flavus互作的分子機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1菌株及培養(yǎng)基A.flavus菌株LD-F1(不攜帶任何病毒并標(biāo)記嘧啶磺胺抗性)、LD-F1-b(病毒AfPV1感染菌株LDF1獲得)，AfPV1(NCBI GenBank No. MK344768，No. MK344769，No. MK344770)，以上A.flavus菌株和AfPV1病毒由本課題組前期獲得。所有A.flavus菌株在馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar，PDA，土豆200 g、葡萄糖20 g及瓊脂粉12～15 g，蒸餾水定容至1 000 mL)，121 ℃滅菌20 min，平板30 ℃培養(yǎng)，4 ℃保存于PDA平板上。

1.1.2主要試劑和儀器 TRIZOL(美國(guó)invitrogen)，實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)試劑(大連寶生物)；超凈臺(tái)(蘇州金凈凈化)，生化培養(yǎng)箱(天津賽得利斯)，冷凍高速離心機(jī)(美國(guó)GENE)，PCR擴(kuò)增儀(美國(guó)Applied Biosystem)，Agilent 2100(美國(guó)agilent)，分光光度計(jì)和Qubit 2.0(美國(guó)thermo)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1A.flavus菌株RNA提取與質(zhì)量檢測(cè)A.flavus菌株LD-F1和LD-F1-b分別接種于鋪有滅菌玻璃紙的PDA培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)5 d；收集每個(gè)菌株的菌絲；使用TRIzol試劑提取A.flavus菌株的總RNA；稱取菌絲0.5 g，置于提前用0.1%焦碳酸二乙酯(diethylpyrocarbonate，DEPC)溶液處理過的研缽中，加液氮研磨成粉末。將研缽中的粉末用藥勺轉(zhuǎn)移至無RNA酶的離心管中，加TRIzol試劑1 mL和氯仿0.2 mL，劇烈震蕩混合，置于冰上靜置5 min，12 000 r/min于4 ℃離心10 min，取上清，轉(zhuǎn)入新的無RNA酶的離心管，加等體積異丙醇，上下顛倒混勻，于-20 ℃條件靜置2 h以上，12 000 r/min于4 ℃離心15 min，棄上清，加75%乙醇1 mL洗滌沉淀，12 000 r/min于4 ℃離心15 min，棄上清，得到RNA沉淀；RNA沉淀于室溫條件下干燥，加無RNA酶污染的去離子水20 μL溶解，-80 ℃保存；取RNA樣品2 μL，1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)條帶類型，Agilent 2100檢測(cè)RNA樣品的完整性；用Qubit和NanoDrop-2000分光光度計(jì)對(duì)RNA進(jìn)行濃度和純度檢測(cè)。

1.2.2文庫構(gòu)建和RNA-SeqA.flavus菌株RNA樣本由Novogene公司通過Illumina HiSeq 2000進(jìn)行高通量測(cè)序，每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)；樣品RNA檢測(cè)合格，mRNA純化，打斷成小片段，用隨機(jī)引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成第1鏈互補(bǔ)DNA(complementary DNA，cDNA)，合成第2鏈cDNA鏈，純化雙鏈cDNA，PCR富集得到最終的cDNA文庫；使用Qubit 2.0對(duì)構(gòu)建好的cDNA文庫進(jìn)行初步定量，用Agilent 2100對(duì)待測(cè)文庫中的插入片段長(zhǎng)度進(jìn)行準(zhǔn)確測(cè)定，最后使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)方法對(duì)cDNA文庫的有效濃度進(jìn)行準(zhǔn)確定量(有效濃度>2 nmol/L)；cDNA文庫檢測(cè)合格后，將不同文庫按照濃度要求和測(cè)序數(shù)據(jù)量要求進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3序列分析 (1)通過去除低質(zhì)量堿基和污染序列，將原始測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾，然后以美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/360?genome_assembly_id=968150)的A.flavus菌株NRRL 3357的參考基因組；(2)基于P<0.05，通過比較Reads Per Kilobase Per Million mapped Reads(RPKM)的差異獲得A.flavus差異表達(dá)基因(differentially expressed genes，DEGs)；(3)對(duì)A.flavus的DEGs進(jìn)行基因本體(gene ontology，GO)注釋和京都基因和基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)進(jìn)行功能富集分析。

1.2.4qRT-PCR分析 隨機(jī)挑選A.flavus12個(gè)基因，采用qRT-PCR方法進(jìn)行相對(duì)表達(dá)量驗(yàn)證。qRT-PCR在實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)系統(tǒng)中，使用TB Green?Premix Ex TaqTM進(jìn)行；PCR反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性15 s、56 ℃退火15 s、72 ℃延伸20 s，共40個(gè)反應(yīng)循環(huán)；在每個(gè)PCR反應(yīng)結(jié)束時(shí)分析每個(gè)基因的熔體曲線，A.flavus肌動(dòng)蛋白基因(7910404)作為內(nèi)參基因。檢測(cè)基因相對(duì)表達(dá)量的引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物Tab.1 qRT-PCR primer sequences

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

差異基因統(tǒng)計(jì)使用DESeq軟件進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，然后進(jìn)行負(fù)二項(xiàng)分布分析，使用Benjamini和Hochberg的方法對(duì)P值進(jìn)行調(diào)整，調(diào)整后log2(foldchange)的絕對(duì)值大于1(P<0.05)，則認(rèn)為基因表達(dá)具有差異；GO富集分析采用的軟件Goseq，基于Wallenius非中心超幾何分布模型通過對(duì)基因長(zhǎng)度的偏好性進(jìn)行估計(jì)，計(jì)算出GO條目中差異基因富集的概率；KEGG顯著性富集分析以KEGG數(shù)據(jù)庫中基因信號(hào)通路為單位，應(yīng)用超幾何檢驗(yàn)，找出與整個(gè)基因組背景相比較存在差異表達(dá)基因中顯著性富集的通路，富集因子越大，表示富集的程度越大；q值是做過多重假設(shè)檢驗(yàn)校正之后的P值，范圍為0～1，越接近于零，表示富集越顯著；qRT-PCR數(shù)據(jù)采用軟件GraphPad Prism 7.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以均數(shù)表示。

2 結(jié)果

2.1 RNA質(zhì)量

樣品菌株LD-F1和LD-F1-b的總RNA條帶清晰，無污染(圖1)；RNA完整性(RNA integrity number，RIN；RIN值介于6～8)好，總RNA純度良好(OD260/OD280介于1.8～2.0)，樣品質(zhì)量滿足測(cè)序建庫要求(表2)。

注：M為DNA marker，1為菌株LD-F1的RNA，2為菌株LD-F1-b的RNA圖1 樣品RNA瓊脂糖凝膠電泳Fig.1 Agarose gel electrophoresis of RNA samples

表2 樣品RNA質(zhì)量Tab.2 Quality of RNA samples

2.2 測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量

樣品測(cè)序結(jié)果可靠，錯(cuò)誤率僅為0.02%，每組樣品的clean read的數(shù)據(jù)大于4 Gb，Q20>96%，Q30>90%(表3)；測(cè)序的結(jié)果能夠成功比對(duì)到A.flavus的基因組序列(>56%)，多匹配位點(diǎn)<2%，唯一匹配位點(diǎn)>56%，測(cè)序結(jié)果符合后續(xù)序列分析(表4)。

表3 測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量Tab.3 Quality of sequencing data

表4 Reads與參考基因組比對(duì)情況Tab.4 Comparison between reads and reference genome

2.3 DEGs分析

與A.flavus菌株LD-F1相比，菌株LD-F1-b有4 127個(gè) DEGs，其中被上調(diào)表達(dá)的基因?yàn)? 864個(gè)，被下調(diào)表達(dá)的基因?yàn)? 263個(gè)(圖2)；DEGs的GO注釋結(jié)果顯示了30個(gè)最顯著的GO，其中包括氧化還原過程、單生物過程、單生物代謝過程、跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、谷氨酰胺家族氨基酸代謝過程、谷氨酰胺家族氨基酸生物合成過程、二羥酸代謝過程、單生物轉(zhuǎn)運(yùn)、谷氨酸代謝過程、單生物定位、生物過程、谷氨酸生物合成過程、二羥酸生物合成過程、色氨酸代謝過程、Indolalkylamine代謝過程、含吲哚化合物的代謝過程、氨基酸代謝過程等18個(gè)生物過程，1個(gè)細(xì)胞組分(細(xì)胞投射部分)，氧化還原酶活性、催化活性、作用于配對(duì)供體的氧化還原酶活性、血紅素結(jié)合、谷氨酸合酶活性(glutamate synthase activity)、單氧酶活性、四吡咯結(jié)合、輔酶結(jié)合、FAD結(jié)合、輔因子結(jié)合、作用于L-氨基酸多肽酶活性、鐵離子結(jié)合等12個(gè)分子功能(圖3)。KEGG富集分析結(jié)果顯示，DEGs參與的KEGG代謝通路中最顯著的有20條，分別為酪氨酸代謝、色氨酸代謝、淀粉和糖代謝、丙酮代謝、苯丙氨酸代謝、戊糖與葡萄糖醛酸互相轉(zhuǎn)換、核苷酸切除修復(fù)、非同源重組末端連接、氮代謝、錯(cuò)配修復(fù)、吲哚二萜生物堿的生物合成、同源重組、乙醛酸和二羧酸代謝、半乳糖代謝、葉酸生物合成、脂肪酸降解、DNA復(fù)制、生物素代謝、次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物合成及堿基切除修復(fù)(圖4)。

注：紅色表示上調(diào)表達(dá)的基因，綠色表示下調(diào)表達(dá)的基因，藍(lán)色表示變化不顯著的基因。圖2 DEGs火山圖Fig.2 Volcano plot of DEGs

2.4 DEGs表達(dá)

從DEGs中隨機(jī)挑選12個(gè)基因，其中7個(gè)上調(diào)表達(dá)的基因，5個(gè)下調(diào)表達(dá)的基因；qRT-PCR的驗(yàn)證結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果變化趨勢(shì)一致(圖5)，表明轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)真實(shí)可靠。

3 討論

隨著大量使用廣譜抗生素，對(duì)腫瘤患者進(jìn)行放療化療，以及對(duì)器官和干細(xì)胞移植的患者免疫抑制劑的使用，免疫力低下人群逐漸增多，導(dǎo)致曲霉病的發(fā)生率逐年升高[16]。A.flavus不僅是感染人和動(dòng)物的條件致病菌，而且是很多植物的致病菌[16]。同時(shí)A.flavus能夠產(chǎn)生具有強(qiáng)烈致癌作用的A.flavus素B等次級(jí)代謝產(chǎn)物，嚴(yán)重威脅人類健康[17]。目前只有抗真菌藥物用于治療A.flavus感染，但容易引起耐藥菌株產(chǎn)生[18]。真菌病毒是一種選擇性感染真菌的病毒，有些真菌病毒能夠引起寄主致病力衰退，因此具有治療病原真菌感染的潛力[15]。目前真菌病毒已經(jīng)應(yīng)用于一些植物病原真菌的防治[19]，但未見應(yīng)用于治療動(dòng)物和人的真菌感染。本研究中，真菌病毒AfPV1的感染能夠引起寄主真菌A.flavus表型嚴(yán)重的衰退，具有治療A.flavus的潛力[15]。本研究對(duì)真菌病毒AfPV1調(diào)控A.flavus的差異基因進(jìn)行分析，為獲得抗A.flavus潛在靶點(diǎn)提供參考。

雖然真菌病毒在真菌中廣泛存在，但其與宿主之間的相互作用機(jī)制尚不清楚。通過研究板栗疫病菌(Cryphonectriaparasitica,C.parasitica)的真菌病毒，研究者發(fā)現(xiàn)RNA沉默是寄生C.parasitica抗病毒防御的機(jī)制之一[20]。C.parasitica的RNA沉默途徑的基因突變以后，增加了C.parasitica對(duì)真菌病毒感染的易感性，同時(shí)病毒蛋白p29被認(rèn)為是真菌中RNA沉默介導(dǎo)的病毒防御的抑制因子[21]。RNA-seq能夠提供真菌病毒與寄主真菌相互作用機(jī)制的全面信息[3, 8]。通過比較相同基因型背景下，含有真菌病毒和不含真菌病毒的菌株轉(zhuǎn)錄組的差異，可以揭示由于真菌病毒感染引起寄主真菌癥狀的機(jī)制[8-9]。但是關(guān)于真菌病毒感染引起寄主真菌轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后翻譯變化的研究并不多，其中包括A.fumigatus、板栗疫病菌C.parasitica、褐座堅(jiān)殼菌Rosellinianecatrix、核盤菌Sclerotiniasclerotiorum和禾谷鐮刀菌Fusariumgraminearum[22-24]。盡管如此，大多數(shù)情況下真菌病毒調(diào)控的基因表達(dá)途徑的確切性質(zhì)仍不清楚[25]。本研究通過比較含有真菌病毒AfPV1和不含AfPV1的菌株的轉(zhuǎn)錄組，得到4 127個(gè)DEGs。對(duì)這些DEGs進(jìn)行GO注釋和KEGG富集分析，結(jié)果表明DEGs涉及A.flavus的氧化還原過程、單生物過程、單生物代謝過程、跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、谷氨酰胺家族氨基酸代謝過程、谷氨酰胺家族氨基酸生物合成過程、二羥酸代謝過程及血紅素結(jié)合等；這些DEGs參與A.flavus代謝通路中的戊糖、葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)換、非同源重組末端連接、氮代謝、錯(cuò)配修復(fù)、同源重組、DNA復(fù)制、次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物合成及堿基切除修復(fù)等。這些基因代謝途徑可能參與真菌病毒與寄主真菌互作的分子機(jī)理，但需要做進(jìn)一步的基因功能驗(yàn)證。

注：(1)P<0.05。圖3 DEGs的GO富集分析Fig.3 GO enrichment analysis of DEGs

注：顏色變化表示q值由0到1，越接近于零，表示富集越顯著。圖4 DEGs的KEGG富集分析Fig.4 KEGG enrichment analysis of DEGs

圖5 DEGs的qRT-PCR驗(yàn)證Fig.5 Expression levels of DEGs confirmed by qRT-PCR